專利名稱：平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)，尤其是涉及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞增殖，及治療與平滑肌細(xì)胞增殖減少相關(guān)疾病上的新應(yīng)用。
PDGF/VEGF生長(zhǎng)因子家族包含許多結(jié)構(gòu)上相關(guān)的生長(zhǎng)因子。該家族成員含有一個(gè)保守的富含半胱氨酸的區(qū)域，即半胱氨酸結(jié)(Sun，P.D.1995)，它通過鏈間二硫鍵共價(jià)連接，形成二聚體(Potgens et al.1994，Andersson et al.1992)。血小板來源的生長(zhǎng)因子(PDGF)對(duì)包括成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的結(jié)締組織細(xì)胞具有促有絲分裂活性(綜述于Heldin et al.1999)。PDGF由相異的A鏈和B鏈的異二聚體組成，并激活兩個(gè)受體酪氨酸激酶，PDGFR-α和PDGFR-β。PDGF mRNA在正常細(xì)胞類型范圍內(nèi)被表達(dá)，并可能涉及腫瘤發(fā)生及其它疾病過程(Heldin et al.1999)。此外，PDGF-B基因作為v-sis致癌基因由轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶(Devare et al.，1983)，表明其過度表達(dá)可致癌。
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子涉及新血管形成及血管通透性(綜述于Ferrara&Davis-Smyth，1997，Neufeld et al.，1999)。到目前為止，五種內(nèi)源VEGFs(VEGF-A，-B，-C，-D和胎盤生長(zhǎng)因子(PLGF))已被描述過。VEGF的信號(hào)傳遞是通過一個(gè)受體酪氨酸激酶家族(Ferrara&Davis-Smyth，1997，Neufeld et al.，1999)進(jìn)行的，盡管最近顯示神經(jīng)菌毛素1也是VEGF-A的一些同工型的受體(Soker et al.，1998)。
VEGF-A在若干包括心臟、胎盤和胰腺的正常組織中被表達(dá)(Berse etal.，1992)。在許多腫瘤中VEGF-A顯示出被過度表達(dá)(Takahashi etal.，1995)，并且在動(dòng)物模型中，VEGF-A作用的抑制顯示出會(huì)導(dǎo)致腫瘤的消退(Kim et al.，1993)。VEGF-A也與其它涉及不恰當(dāng)血管發(fā)生的疾病過程相關(guān)(Folkman 1995)。VEGF-B mRNA在正常組織中的表達(dá)與VEGF-A的表達(dá)重疊，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也是可檢測(cè)的(Lagercrantz et al.，1998)。VEGF-C以低于VEGF-A和VEGF-B的表達(dá)水平被表達(dá)(Lagercrantz et al.，1998)，但在一系列組織中可以檢測(cè)到(Lee et al.1996，F(xiàn)itz et al.，1997)。VEGF-D在肺、心臟和小腸中強(qiáng)表達(dá)，且在若干其它組織中也可以檢測(cè)到(Yamada etal.，1997)。
通過檢索EST數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果鑒定了一個(gè)VBGF/PDGF家族新成員。所鑒定的多肽序列含一個(gè)N-末端CUB結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C-末端PDGF結(jié)構(gòu)域，該多肽被命名為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-X(VEGF-X；專利WO 0037641；EMBL編號(hào)AX028032)。相同序列最近被公布，并顯示具有PDGF活性(Lietal.，2000)，被命名為PDGF-C，這兩種命名可交替使用。Li等人發(fā)現(xiàn)PDGF-C的C-末端PDGF結(jié)構(gòu)域具有PDGFR結(jié)合活性，并刺激成纖維細(xì)胞增殖，反之，全長(zhǎng)PDGF-C不顯示該活性。他們提出一種模型，該模型中，CUB結(jié)構(gòu)域的功能是作為PDGF結(jié)構(gòu)域的抑制物激活作用是通過蛋白質(zhì)水解以釋放活性PDGF-C。
在尿道和膀胱壁中，平滑肌細(xì)胞在控制膀胱功能上起著重要作用。已證實(shí)平滑肌細(xì)胞數(shù)量的增加可治療充溢性尿失禁和膀胱功能障礙(Yokoyama et al.，2000)。作為一種治療方法，可直接注射平滑肌細(xì)胞(成肌細(xì)胞)于尿道和膀胱壁中，以增加細(xì)胞數(shù)量。
另一方面，已知?jiǎng)用}平滑肌細(xì)胞增生會(huì)導(dǎo)致多種疾病，且阻斷這種不希望有的細(xì)胞水平事件的試劑可用于對(duì)這些疾病的藥物定向治療中。動(dòng)脈粥樣硬化，一種大動(dòng)脈的疾病，是心臟病及中風(fēng)的主要原因。在西方社會(huì)，它是大約50％死亡的基本原因。動(dòng)脈粥樣硬化癥是一種進(jìn)展性疾病，該病的特征是在大動(dòng)脈中積累了脂類及纖維成分。血管壁細(xì)胞，尤其是平滑肌細(xì)胞(SMCs)的過度生長(zhǎng)，促成了動(dòng)脈粥樣硬化癥的發(fā)病(Lusis，AJ，2000)。一種可阻斷平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的治療方法足以預(yù)防內(nèi)膜增生，并也可促進(jìn)血管愈合過程。在當(dāng)前血管介入環(huán)境中，高的再狹窄率提高了對(duì)內(nèi)膜增生，即一種在血管壁損傷后出現(xiàn)的慢性結(jié)構(gòu)病變的重要性的注意，該結(jié)構(gòu)病變可引起腔狹窄和血管閉塞。內(nèi)膜增生被定義為血管平滑肌細(xì)胞的異常遷移和增殖，并伴隨細(xì)胞外結(jié)締組織基質(zhì)的沉積(Hagen P.O.，et al.1994)。心臟移植動(dòng)脈粥樣硬化是限制受體長(zhǎng)期存活的主要原因之一。其特征是由增殖的平滑肌細(xì)胞組成的內(nèi)膜增厚，由于動(dòng)脈壁的廣泛損傷，這種內(nèi)膜增厚可能發(fā)生在吻合位點(diǎn)(Suzuki J.et al.2000)。對(duì)平滑肌細(xì)胞病理性過度增殖的預(yù)防可被用于減少愈合微動(dòng)脈吻合時(shí)的內(nèi)膜增生，及移植動(dòng)脈的內(nèi)膜增生(Robert C.，et al.，1995)。抑制平滑肌細(xì)胞外膜細(xì)胞的生長(zhǎng)將有助于減少由冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)引起的新內(nèi)膜增生。在糖尿病受試者的膀胱病變中，膀胱或腎肥大和腎增生是公認(rèn)的。平滑肌的過度增殖也能由于慢性和/或急性膀胱出口阻塞而引起膀胱和腎功能不可逆的改變(Mumtaz FH，et al 2000)。
現(xiàn)在已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，重組的全長(zhǎng)VEGF-X和CUB結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)在體外都顯示出對(duì)人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞具有促有絲分裂活性，這表明CUB結(jié)構(gòu)域除了維持PDGF結(jié)構(gòu)域潛伏狀態(tài)的作用外還具有一個(gè)功能。因此，VEGF-X及提高平滑肌細(xì)胞增殖的CUB結(jié)構(gòu)域可能在治療尿失禁、膀胱功能障礙與其它由平滑肌細(xì)胞組成的括約肌的功能障礙上具有優(yōu)勢(shì)。在重建骨盆底時(shí)，也可利用VEGF-X和CUB結(jié)構(gòu)域以改善平滑肌功能。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了編碼VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或變體的核酸分子在制造可于體內(nèi)或體外刺激平滑肌細(xì)胞增殖的藥物上的應(yīng)用。優(yōu)選地，VEGF-X多肽序列如

圖1(a)所示。本發(fā)明也提供了VEGF-X的CUB結(jié)構(gòu)域或功能等同物、衍生物或其變體于體內(nèi)或體外刺激平滑肌細(xì)胞增殖的應(yīng)用，該CUB結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選由如圖1(a)所示40-150位的氨基酸序列組成。上述多肽、CUB結(jié)構(gòu)域和核酸分子也可被用作藥物，或用于制備可治療尿道功能障礙、膀胱功能障礙、括約肌功能障礙或其它與功能性VEGF-X或CUB結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)表達(dá)降低相關(guān)的疾病或狀況的藥物，或用來制備用于骨盆底重建的藥物。本發(fā)明的另一方面提供了VEGF-X或其CUB結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)或體外組織工程應(yīng)用中，用平滑肌細(xì)胞構(gòu)成基質(zhì)的用途。
本發(fā)明的DNA分子可被方便地包含在適合的表達(dá)載體中，以在適合的宿主中表達(dá)由其編碼的VEGF-X。如Sambrook et al.，(1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press所提供的，將克隆DNA摻入適合的表達(dá)載體，以進(jìn)行該細(xì)胞隨后的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
本發(fā)明的表達(dá)載體包括具有一個(gè)本發(fā)明的核酸的載體，該核酸可操作地連接于能夠影響所述DNA片段表達(dá)的調(diào)控序列上，例如啟動(dòng)子區(qū)。術(shù)語“可操作地連接”指一種并置關(guān)系，其中所描述的成分處于一種允許它們以其指定方式發(fā)揮功能的關(guān)系當(dāng)中。這樣的載體可被轉(zhuǎn)化到適合的宿主細(xì)胞中，以表達(dá)本發(fā)明的多肽。
這種表達(dá)載體也可被用于刺激平滑肌細(xì)胞增殖，并也可被用在對(duì)本發(fā)明的包括尿道功能障礙、膀胱功能障礙或其它與功能性VEGF-X蛋白質(zhì)表達(dá)減少相關(guān)疾病在內(nèi)的疾病或狀況的治療中。
本發(fā)明的多肽可以是重組的、合成的或天然存在的，但優(yōu)選是重組的。同樣，可采用重組或合成技術(shù)，例如，采用PCR克隆原理，制備本發(fā)明的核酸序列。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了含有治療有效量的本發(fā)明多肽的藥物組合物的應(yīng)用，該組合物包含例如多肽的可溶解形態(tài)、或本發(fā)明的核酸分子、或摻入了與藥學(xué)可接受載體或賦形劑結(jié)合的所述核酸分子的載體。這樣的載體包括，但不僅限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇、及其組合。根據(jù)發(fā)明的這一方面，藥物組合物可被用于刺激在組織和器官中的平滑肌細(xì)胞增殖，或可選地，治療或預(yù)防尿道、膀胱或括約肌的功能障礙，或與發(fā)明的VEGF-X多肽的異常內(nèi)源性活性相關(guān)的功能障礙中的任意一種。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥物包裝和試劑盒，二者含一個(gè)或多個(gè)充滿一種或多種上述發(fā)明組合物的成分的容器。多肽及其它本發(fā)明的化合物可被單獨(dú)應(yīng)用或與其它化合物，例如治療化合物聯(lián)合應(yīng)用。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽(此處兩種術(shù)語可交替使用)此處被定義為包括由本發(fā)明的核酸分子編碼的所有可能的氨基酸變體，包括被所述分子編碼的多肽，且具有保守氨基酸改變。保守氨基酸取代指在一種蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代，該替代并不影響蛋白質(zhì)的功能或表達(dá)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽此處被進(jìn)一步定義為包括這種序列的變體，包括天然存在、基本上與所述蛋白質(zhì)或多肽同源的等位變體。在上下文中，基本同源性被看作是至少有70％、優(yōu)選80％或90％和優(yōu)選95％的氨基酸與本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或多肽同源的序列。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的“功能等同物”包含所有如本發(fā)明方法和應(yīng)用所要求的、上文中預(yù)見的顯示VEGF-X活性的氨基酸和等位變體。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是重組體、合成物或天然存在的，但優(yōu)選是重組的。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽此處也被定義為包括所述蛋白質(zhì)或多肽的生物前體。該生物前體是能夠在生物過程中被轉(zhuǎn)化成具有如發(fā)明所要求的VEGF-X活性的蛋白質(zhì)或多肽的分子。發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)可被用作藥物，或用于制備治療癌癥或其它與VEGF-X蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)疾病或狀況的藥物。
本發(fā)明的核酸分子或蛋白質(zhì)可連同其藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑被方便地提供在藥物組合物中。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過采用反義技術(shù)在體內(nèi)抑制VEGF-X。通過反義DNA或RNA的三螺旋結(jié)構(gòu)形成，反義技術(shù)可被用于控制基因表達(dá)，兩種方法均基于多核苷酸與DNA或RNA的鍵合。例如，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的5’編碼部分或成熟DNA序列，可被用于設(shè)計(jì)一種長(zhǎng)度為10-50個(gè)堿基對(duì)的反義RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被設(shè)計(jì)成與涉及轉(zhuǎn)錄的基因的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)(三螺旋-見Lee et al.Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al.，Science，241456(1988)；以及Dervanet al.，Science，2511360(1991))，從而阻止VEGF-X的轉(zhuǎn)錄及產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明也提供了一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化癥、因動(dòng)脈吻合術(shù)或球囊導(dǎo)管導(dǎo)致的新內(nèi)膜增生、因經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀血管成形術(shù)后的動(dòng)脈擴(kuò)張(stenting)導(dǎo)致的血管成形術(shù)后再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的與編碼VEGF-X多肽的核酸分子反義的多核酸分子，例如可雜交與圖1(a)的核酸，或其在高嚴(yán)格性條件下的互補(bǔ)序列雜交的反義多核苷酸分子，其濃度足夠治療或預(yù)防所述病癥。
高嚴(yán)格性條件通常包括溫度超過30C、典型地超過37℃、優(yōu)選地超過45C。嚴(yán)格的鹽條件通常低于1000mM，典型地低于500mM，優(yōu)選地低于200mM。
根據(jù)給藥途徑，例如通過全身或口服途徑可調(diào)整組成。全身給藥的優(yōu)選形式包括注射、典型地通過靜脈注射。其它注射途徑，如皮下、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)也可被采用。
全身給藥的可選方法包括采用滲透劑，如膽鹽或梭鏈孢酸或其它去污劑，經(jīng)粘膜和經(jīng)皮給藥。另外，如果本發(fā)明的多肽或其它化合物可被制劑化為腸道制劑或膠囊化制劑，口服給藥也是可能的。這些化合物的給藥也可是體表的和/或局部的，以藥膏、糊劑、凝膠等形式。
所需的劑量范圍取決于本發(fā)明的肽或其它化合物的選擇、給藥途徑、制劑的性質(zhì)、受試者狀況的性質(zhì)、及參與的實(shí)施者的判斷。盡管如此，合適的劑量仍在0.1-100mg/kg受試者體重范圍內(nèi)。不過，鑒于可用化合物的多樣性及不同給藥途徑的不同功效，仍然期望在需要?jiǎng)┝可嫌袕V泛的變化。
例如，口服給藥預(yù)期需要的劑量高于靜脈注射給藥的劑量。正如本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，這些劑量水平上的變化可采用標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)驗(yàn)程序調(diào)整優(yōu)化。
此處所用的術(shù)語“治療有效量”，意指本發(fā)明的VEGF-X、或其它活性物質(zhì)的量，當(dāng)根據(jù)預(yù)期治療計(jì)劃給藥時(shí)，該劑量會(huì)得到預(yù)期的治療效果或反應(yīng)、或提供希望的益處。
優(yōu)選的治療有效量是可刺激平滑肌細(xì)胞增殖的量。
此處所用的“藥學(xué)可接受的”意指從毒性或安全的角度出發(fā)，通常適合于對(duì)哺乳動(dòng)物，包括人類給藥。
本發(fā)明中，VEGF-X蛋白質(zhì)典型地給藥一段足夠的時(shí)間，直到達(dá)到預(yù)期治療效果。此處所用“直到達(dá)到預(yù)期治療效果”，意指根據(jù)選擇的給藥方案，持續(xù)給予一種或多種治療劑，直到臨床醫(yī)生或研究者觀察到被調(diào)節(jié)的疾病或狀況有尋求的臨床或醫(yī)學(xué)效果的時(shí)間為止。對(duì)本發(fā)明的治療方法而論，化合物被持續(xù)給藥直到在骨質(zhì)或結(jié)構(gòu)上觀察到有預(yù)期的變化為止。在這些實(shí)例中，預(yù)期的目標(biāo)是達(dá)到平滑肌細(xì)胞的增加。對(duì)降低疾病狀態(tài)或狀況危險(xiǎn)的方法而論，只要需要就盡可能長(zhǎng)時(shí)間地持續(xù)給藥化合物，以預(yù)防不希望發(fā)生的狀況。
兩種或兩種以上平滑肌細(xì)胞增殖的刺激物的聯(lián)合也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
“多核苷酸”通常指任何多聚核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，可以是未修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。“多核苷酸”不加限制地包括單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區(qū)混合物DNA、單鏈和雙鏈RNA、及單鏈和雙鏈區(qū)混合物RNA、雜交分子，該雜交分子包含可以是單鏈、或更典型的是雙鏈、或單鏈與雙鏈區(qū)域混合物的DNA或RNA。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)。
術(shù)語“多核苷酸”也包括含有一個(gè)或多個(gè)已修飾堿基的DNAs或RNAs，及為了穩(wěn)定性或其它原因而修飾過主鏈的DNAs或RNAs?！耙研揎棥眽A基包括，例如，三苯甲基化的堿基、非常見堿基如次黃嘌呤核苷。對(duì)DNA和RNA可進(jìn)行若干種修飾；這樣，“多核苷酸”包括自然界中典型發(fā)現(xiàn)的多核苷酸的化學(xué)、酶學(xué)或代謝的修飾形式，也包括病毒和細(xì)胞的特征性的DNA和RNA的化學(xué)形式。“多核苷酸”也包括相對(duì)短的多核苷酸，常常指寡核苷酸。
“多肽”指任何含有兩種或兩種以上，通過肽鍵或已修飾肽鍵彼此連接的氨基酸的肽或蛋白質(zhì)，即，肽等排物?！岸嚯摹敝付替満烷L(zhǎng)鏈，短鏈一般指肽、寡肽或寡聚物，長(zhǎng)鏈通常指蛋白質(zhì)。多肽可含有除了20個(gè)基因編碼氨基酸以外的氨基酸。
“多肽”包括通過自然方法，如翻譯后加工，或通過本領(lǐng)域內(nèi)已熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。這些修飾方法在基礎(chǔ)課本、更為詳細(xì)的專著、及大量文獻(xiàn)中有很好的描述。修飾可以發(fā)生在多肽的任何位置，包括肽主鏈，氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。應(yīng)當(dāng)理解在特定多肽的若干位點(diǎn)上，相同類型的修飾可能表現(xiàn)相同或不同的程度。同樣，特定多肽可含有許多修飾類型。多肽可由于遍在蛋白化作用而有分支，且可為具有或無分支的環(huán)狀。環(huán)狀、分支和分支的環(huán)狀多肽可由翻譯后自然加工產(chǎn)生，或通過合成方法制成。修飾包括乙?；饔?、?；饔谩DP核糖基化作用、酰胺化作用、黃素的共價(jià)連接、亞鐵原卟啉部分的共價(jià)連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接、脂類或脂類衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化作用、二硫鍵形成、脫甲基作用、共價(jià)交聯(lián)形成、半胱氨酸鍵形成、焦谷氨酸鹽形成、甲酰化作用、γ羧化作用、糖基化作用、GPI錨形成、羥基化作用、碘化作用、甲基化作用、豆蔻酰化作用、氧化、蛋白水解加工、磷酸化作用、異戊二烯化作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸化作用、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸添加到蛋白質(zhì)，例如精氨酰化作用、及遍在蛋白化作用(見，例如，PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，2nc Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，NewYork，1993；Wold，F(xiàn).，Post-translational Protein ModificationsPerspectives and Prospects，pages.1-12 in POSTTRANSLATIONALCOVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，New York，1983；Selfter et al.，“Analysis for proteinmodifications and nonprotein cofactors”，Meth Enzymol(1990)182626-646和Rattan et al.，“Protein SynthesisPost-translational Modifications and Aging”，Ann NYAcad Sci(1992)66348-62)。
含有任何上述修飾的多肽可被描述為本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的“衍生物”。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于鑒定VEGF-X生物學(xué)活性的抑制劑的篩選方法。這些抑制劑包括中和性VEGF-X抗體、反義VEGF-X序列或與VEGF-X生物學(xué)活性競(jìng)爭(zhēng)的非蛋白拮抗劑。適合的抗體可由適當(dāng)?shù)拿庖咴?，例如分離的和/或重組抗原，或其部分(包括合成分子，如合成肽)，或表達(dá)重組抗原的宿主細(xì)胞刺激產(chǎn)生。另外，表達(dá)重組抗原的細(xì)胞，如轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可被用作免疫原，或用于對(duì)結(jié)合受體的抗體進(jìn)行篩選(舉例見，Chuntharapai et al，J Immunol.，159.-17831-1789(1994)。
抗體產(chǎn)生細(xì)胞，優(yōu)選的是脾或淋巴結(jié)的那些抗體產(chǎn)生細(xì)胞，可獲得自經(jīng)感興趣的抗原免疫過的動(dòng)物。融合細(xì)胞(雜交瘤)可采用選擇性培養(yǎng)條件進(jìn)行分離，并通過有限稀釋進(jìn)行克隆?？赏ㄟ^適合的分析方法(例如ELISA)選擇出產(chǎn)生具有期望特異性的抗體的細(xì)胞。
因此，本發(fā)明也提供了治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化癥、因動(dòng)脈吻合術(shù)或球囊導(dǎo)管導(dǎo)致的新內(nèi)膜增生、因經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后動(dòng)脈擴(kuò)張導(dǎo)致的血管成形術(shù)后再狹窄中的任何一種的方法，該方法包括給予上述受試者一定量的能結(jié)合于如圖1(a)中所示VEGF-X多肽，或其表位的抗體，其濃度足夠治療或預(yù)防上述病癥。
適用于本發(fā)明的抗VEGF-X抗體的特征在于高親和力結(jié)合于VEGF-X受體?？筕EGF-X的抗體可通過吸入法給藥(如，加入吸入劑或噴霧劑中，或作為噴霧的薄霧)。其它給藥途徑包括鼻內(nèi)、口服、包括輸注和/濃注(bolus)的靜脈內(nèi)、真皮下、經(jīng)皮的(如，在緩釋聚合物中)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、局部的、硬膜外、頰等途徑。也可采用其它適合的給藥途徑，例如，通過上皮、或粘膜皮膚襯細(xì)胞達(dá)到吸收的目的。抗體也可通過基因療法給藥，其中編碼特定治療蛋白質(zhì)或肽的DNA分子可通過，例如載體的方法給予病人，該載體可引起特定蛋白質(zhì)或肽在體內(nèi)于治療水平被表達(dá)和分泌。另外，抗VEGF-X抗體可連同其它生物學(xué)活性試劑的成分給藥，如藥學(xué)可接受表面活性劑(例如，甘油酯)，賦形劑(例如，乳糖)，載體、稀釋劑和運(yùn)載體?？筕EGF-X抗體可在其它治療方案或試劑(如，多藥物方案)之前、同時(shí)或序貫地，預(yù)防性或治療性地給個(gè)體用藥。與其它治療劑同時(shí)給藥的抗VEGF-X抗體，可以在相同或不同組合物中給藥?？筕EGF-X抗體可與藥學(xué)可接受腸胃外運(yùn)載體一起被制劑化成溶液、懸液、乳劑或凍干粉。
VEGF-X抗體的治療有效量可根據(jù)癥狀性質(zhì)和范圍、同時(shí)進(jìn)行的治療、及預(yù)期效果等因素以單次或分開劑量給藥(如，按日、周或月的時(shí)間間隔分成系列劑量)，或以持續(xù)釋放形式給藥。
另一方面，提供了激動(dòng)劑和拮抗劑的篩選檢驗(yàn)方法，該方法包括測(cè)定候選化合物對(duì)本發(fā)明的VBGF-X或CUB結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)合于VEGF-X受體的效果。特別地，該方法包括將VEGF-X受體與本發(fā)明的VEGF-X或CUB結(jié)構(gòu)域多肽和候選化合物接觸，并且確定VEGF-X或CUB結(jié)構(gòu)域多肽與VEGF-X受體的結(jié)合是否由于候選化合物的存在而增加或減少。在這個(gè)測(cè)定方法中，VEGF-X或CUB結(jié)構(gòu)域多肽的結(jié)合超過標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合的增加，表明候選化合物是VEGF-X或CUB結(jié)構(gòu)域的激動(dòng)劑。與標(biāo)準(zhǔn)相比，VEGF-X或CUB結(jié)構(gòu)域多肽結(jié)合的減少表明化合物是VEGF-X或CUB結(jié)構(gòu)域的拮抗劑。
從下列實(shí)施例，并參考附圖，可以更清晰地理解本發(fā)明。其中圖1(a)是PDGF-C的cDNA序列說明。預(yù)測(cè)的PDGF-C翻譯產(chǎn)物示于序列上方，預(yù)測(cè)信號(hào)序列加有下劃線。預(yù)測(cè)的mRNA剪接剪切事件實(shí)心發(fā)生部位以實(shí)心三角形指示。通過對(duì)分離的BAC克隆直接測(cè)序，或者通過與EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中的部分BAC序列比較的方法推斷mRNA剪切事件的位置(來自AC0015837的nt.1-374的區(qū)域，公布日期2000年4月7日，來自AC009582的nt.375-571的區(qū)域，公布日期2000年4月5日)。對(duì)斜體指示的nt.900-957區(qū)域而論，目前為止還沒有關(guān)于剪切事件的資料。從通過PCR分離的變異序列推斷，隱蔽剪切供體/受體位點(diǎn)位于nt.719/720和988/989(空心三角形)。多肽序列中的潛在N連接糖基化位點(diǎn)于方框中表示，且從小于預(yù)期長(zhǎng)度的PCR片段預(yù)測(cè)(b)變異PDGF-C蛋白質(zhì)序列-多肽序列?？寺〔y(cè)序覆蓋該區(qū)域的PCR片段，以展現(xiàn)如圖1(a)所示的隱蔽剪切供體/受體位點(diǎn)。
圖2是PDGF-C結(jié)構(gòu)域與數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較說明(A)用其它的人類PDGFs和VEGFs的PDGF結(jié)構(gòu)域與PDGF-C的PDGF結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)。
(B)用BMPs和神經(jīng)菌毛素的CUB結(jié)構(gòu)域與PDGF-C的CUB結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)；蛋白質(zhì)如指示所示，來自X.laevis，小鼠或小雞。
所有結(jié)構(gòu)域序列來自PFAMA數(shù)據(jù)庫(kù)(Rocchigiani，M.et al.，(1998)Genomics 47，204-216)，并采用CLUSTALW比對(duì)程序進(jìn)行比對(duì)(EMBL，Heidelberg，Germany)。表1總結(jié)了圖2顯示的蛋白質(zhì)區(qū)域的比較結(jié)果。從這些比較中，可以清楚地看出CUB結(jié)構(gòu)域與其它數(shù)據(jù)庫(kù)序列的相似程度高于PDGF結(jié)構(gòu)域與其它數(shù)據(jù)庫(kù)序列的相似程度。
圖3是從PDGF-C的mRNA表達(dá)獲得的結(jié)果圖示說明(A)組織和癌細(xì)胞系中的PDGF-C mRNA分布的RNA印跡分析。采用β肌動(dòng)蛋白cDNA探針進(jìn)行的對(duì)照雜交表明在每一泳道中有等量的mRNA。PDGF-C mRNA的位置已指示出。
(B)來自組織和癌細(xì)胞系的cDNA的PCR分析。對(duì)照采用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增部分甘油醛-3-磷酸脫氫酶cDNA的引物，表明在擴(kuò)增反應(yīng)中存在等量的每種cDNA(未顯示)。
圖4是從PDGF-C(VEGF-X)基因座的FISH圖譜獲得的結(jié)果的圖示說明-顯示了一個(gè)實(shí)例左邊顯示的是在人類染色體上的FISH信號(hào)，右邊顯示的是用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的相同有絲分裂圖，以鑒定人類染色體4。同時(shí)還顯示了圖解總結(jié)每一圓點(diǎn)代表在染色體4上檢測(cè)到的雙FISH信號(hào)。
圖5是PDGF-C重組蛋白質(zhì)特性的圖示說明(A)糖基化&鏈間二硫化物形成。用表達(dá)全長(zhǎng)PDGF-C的桿狀病毒感染T.ni Hi5細(xì)胞。桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基樣本處理如下泳道1-酶緩沖液+N-糖苷酶F；泳道2-酶緩沖液，無N-糖苷酶F；泳道3-還原的；泳道4-非還原的。蛋白質(zhì)印跡后的檢測(cè)采用抗His6抗體，以檢測(cè)導(dǎo)入的C-末端表位標(biāo)記。
(B)肝素結(jié)合。已純化的大腸桿菌來源的全長(zhǎng)MBP融合蛋白經(jīng)過SDS-PAGE，并用考馬斯藍(lán)染色凝膠。泳道1-用于肝素柱的上樣部分，泳道2-洗柱，泳道3-高鹽洗脫。
(C)全長(zhǎng)和CUB結(jié)構(gòu)域-由大腸桿菌制備的PDGF-C全長(zhǎng)融合蛋白(泳道1)和CUB結(jié)構(gòu)域(泳道2)樣品經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE。通過不溶物質(zhì)的重折疊制備CUB結(jié)構(gòu)域在采用抗-His6抗體的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中，20和25kDa的主帶均被檢測(cè)到，因此推斷25kDa類型含有未剪切信號(hào)肽。分子量標(biāo)準(zhǔn)以kDa為單位指示于左側(cè)。
圖6是PDGF-C(VEGF-X)或PDGF-C CUB結(jié)構(gòu)域?qū)θ祟惞跔顒?dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的效果圖示。細(xì)胞經(jīng)所示濃度的大腸桿菌來源的CUB或全長(zhǎng)PDGF-C蛋白質(zhì)處理。
材料及方法VEGF-X的cDNA和部分基因組克隆化基于已知VEGF序列(VEGF-A、B、C和D)中的PDGF樣結(jié)構(gòu)域?qū)D形顯影(Lee et al.，1996)，并將之用于檢索LifeSeqTM人類EST數(shù)據(jù)庫(kù)(Incyte Genomics Inc.Palo Alto，CA，USA)，檢索顯示出VEGF家族的潛在新成員的部分序列。為延伸cDNA序列，采用Marathon-Ready胎盤和骨骼肌cDNAs進(jìn)行5’RACE(Clontech，Palo Alto，CA，USA)。然后采用標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法擴(kuò)增全長(zhǎng)編碼序列(Fitz etal.，1997)。將PCR片段克隆進(jìn)載體pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA.USA)或pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA.USA)中。測(cè)序多個(gè)克隆以確定編碼序列；所有的亞克隆也同樣通過DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。為獲得部分基因組克隆，通過與來源于PDGF-C cDNA序列的寡核苷酸進(jìn)行雜交，以篩選人類染色體組BAC基因庫(kù)(Genome Systems，Inc.，StLouis，MI，USA)。為確定內(nèi)含子/外顯子邊界，直接采用基于已知cDNA序列的20-mer測(cè)序引物對(duì)BAC DNA進(jìn)行測(cè)序。采用Qiagen質(zhì)粒midi試劑盒制備BAC DNA(Qiagen GmbH，Düsseldorf，Germany)。
VEGF-X基因的染色體定位染色體圖譜的研究由See DNA Biotech Inc.(Toronto，Canada)采用如以前描述的生物素化的2.7kb探針(Yamada et al.，1997；Gribsteor et al.，1987，Ausabel et al.，1997)的FISH分析進(jìn)行。
通過RNA印跡和RT-PCR對(duì)VEGF-X mRNA表達(dá)的分析將含有來源自不同人類組織的2μg富含poly(A)+的RNA的RNA印跡(Clontech Laboratories；MTNTMblot，MTNTMblot II和癌細(xì)胞系MTNTMblot)與a-[32P]-dCTP隨機(jī)引物標(biāo)記的(Multiprime labelling試劑盒，Roche Diagnostics)293bp的特異性PDGF-C片段(包括PDGF-C的3’末端編碼區(qū)的9 2bp和3’非翻譯區(qū)的201bp的PinAI-StuI片段)雜交。將印跡于68℃雜交過夜，并在68℃于0.1xSSC/0.1％SDS中進(jìn)行高嚴(yán)格性的最終洗滌。用增強(qiáng)屏將膜進(jìn)行1-3天的放射自顯影。就RT-PCR分析而論，采用寡核苷酸引物GTTTGATGAAAGATTTGGGCTTG和CTGGTTCAAGATATCGAATAAGGTCTTCC對(duì)來自PDGF-C的350bp片段進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增是在人類多組織cDNA(MTCTM)板(Clontech人MTC板I和II以及人腫瘤MTC板)上進(jìn)行，該板標(biāo)準(zhǔn)化為6種不同管家基因的mRNA表達(dá)水平。另外，cDNA由不同腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物制得(Caco-2結(jié)直腸腺癌；T-84結(jié)腸直腸癌；MCF-7乳腺腺癌；T-47D乳腺導(dǎo)管腺癌；HT1080骨纖維肉瘤；SaOS-2骨肉瘤；SK-N-MC成神經(jīng)細(xì)胞瘤；HepG2肝胚細(xì)胞瘤；JURKAT T細(xì)胞白血病和THP-1髓單核細(xì)胞白血病)。為制備腫瘤細(xì)胞cDNA，將細(xì)胞勻漿化，并采用RNeasy Mini試劑盒制備總RNA(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)。采用寡(dT)15為引物，及50U的ExpandTM逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)對(duì)1μg的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后用PDGF-C特異性或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)特異性引物對(duì)1μl該cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。對(duì)所有cDNAs，用PDGF-C特異性引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)于50μl總體積中進(jìn)行。加熱樣品至95℃，持續(xù)30s，并且完成25、30或35個(gè)循環(huán)操作，每循環(huán)包括于95℃ 30s，68℃ 30s。同時(shí)進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)，該反應(yīng)采用了用于擴(kuò)增管家基因G3PDH的1kb片段的特異引物。
重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、純化和檢測(cè)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)而論，擴(kuò)增全長(zhǎng)編碼序列，并將其克隆進(jìn)載體pcDNA6/V5-His(Invitrogen，Leek，Netherlands)以添加一個(gè)C末端His6肽標(biāo)記，以便輔助檢測(cè)與純化。對(duì)大腸桿菌表達(dá)而論，PCR擴(kuò)增預(yù)測(cè)的成熟蛋白質(zhì)(Glu23-Gly345)的編碼區(qū)，以添加一個(gè)C末端His6肽標(biāo)記，然后將其克隆進(jìn)載體pMAL-p2(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。將得到的MBP融合蛋白質(zhì)首先在鎳螯合樹脂(Ni-NTA，Qiagen GmbH，Düsseldorf，Germany)上，然后于直鏈淀粉樹脂(New England Biolabs，Beverly，MA)上進(jìn)行純化。PCR擴(kuò)增編碼了PDGF-C(Glu23-Val171)的CUB結(jié)構(gòu)域片段的DNA序列，以添加一個(gè)C末端His6肽標(biāo)記，并將其克隆進(jìn)pET22b(Novagen，Madison，WI)中，用于在大腸桿菌中的分泌。通過標(biāo)準(zhǔn)方法(Fitz et al.，1997)從誘導(dǎo)培養(yǎng)物的周質(zhì)或不合細(xì)胞培養(yǎng)基中制備CUB結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)。通過用20％飽和的硫酸銨沉淀初步純化蛋白質(zhì)。用20mM Tris pH8.0，300mMNaCl透析過夜，以去除硫酸銨，然后采用前述的鎳螯合樹脂進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)。采用N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals，Brussels，Belgium)進(jìn)行蛋白質(zhì)糖基化分析。根據(jù)制造商使用說明使用肝素瓊脂糖柱(HiTrap，Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。在其用于基于細(xì)胞的分析前，采用可商購(gòu)試劑盒(COATESTEndotoxin，Chromogenix AB，Sweden)檢驗(yàn)蛋白質(zhì)樣品的內(nèi)毒素污染。
細(xì)胞培養(yǎng)于EGM-2生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Clonetics，San Diego，CA)中維持人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(Clonetics，San Diego，CA)，并于骨骼肌生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Clonetics，San Diego，CA)中培養(yǎng)人類骨骼肌細(xì)胞(SkMC)(Clonetics，San Diego，CA)。于補(bǔ)充有10％胎牛血清(FBS)(HyClone，Logen，UT)，6mM Hepes，50I.U./ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco，Gaithersburg，MD)中維持包括HCASMs(Clonetics，San Diego，CA)、大鼠心臟心肌H9c2(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)、及人類新生兒皮膚成纖維細(xì)胞(39-SK)(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)在內(nèi)的細(xì)胞。采用4-6代的細(xì)胞。于補(bǔ)充有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM中維持人類成骨細(xì)胞(MG 63)(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)。如以前描述的方法(Masure etal.，1998)，將原代軟骨細(xì)胞從牛肩分離。于補(bǔ)充有10％FBS、10mMHEPES、0.1mM非必需氨基酸、20μg/ml L-脯氨酸、50μg/ml抗壞血酸、100μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和0.25μg/ml兩性霉素B(軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基)的DMEM(高葡萄糖)中培養(yǎng)原代牛軟骨細(xì)胞。所有細(xì)胞培養(yǎng)均于37℃、濕化培養(yǎng)箱中、5％CO2和95％空氣的環(huán)境中進(jìn)行。
細(xì)胞增殖分析用0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA(Gibco，Gaithersburg，MD)消化HUVECs，并按5,000細(xì)胞/孔將其分配于96孔組織培養(yǎng)板中。在細(xì)胞貼壁并形成單層(16小時(shí))后，用含有0.5％-2％FBS的DMEM中如所示的不同濃度的VEGF-X刺激細(xì)胞。對(duì)人類皮膚成纖維細(xì)胞而論，生長(zhǎng)培養(yǎng)基用含有0.1％BSA、有或無不同濃度VEGF-X的DMEM替代。對(duì)MG63、人類SkMC，H9c2或HCASMC而論，培養(yǎng)基用含有0.5％FBS的DMEM替代。將牛軟骨細(xì)胞按5,000細(xì)胞/孔接種于補(bǔ)充有10％FBS的高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基的96孔組織培養(yǎng)板中，并讓其貼壁72h。培養(yǎng)基用含有2％BSA的DMEM替代，進(jìn)行或不進(jìn)行處理兩天。對(duì)所有的測(cè)試細(xì)胞而論，經(jīng)過處理的孵育后，培養(yǎng)基用100ml含有5％FBS和3μCi/ml的[3H]-胸苷替代。脈沖標(biāo)記后，用甲醇/乙酸(3∶1，體積比)于室溫固定細(xì)胞1h。以250ml/孔，用80％甲醇洗滌細(xì)胞兩次。將細(xì)胞先于0.05％胰蛋白酶(100ml/孔)中處理30min，然后于0.5％SDS(100ml/孔)中再處理30min，以溶解細(xì)胞。細(xì)胞裂解物的等分物(180ml)與2ml閃爍混合物結(jié)合，并用液體閃爍計(jì)數(shù)器(Wallac 1409)測(cè)定細(xì)胞裂解物的放射性。
PDGF-C基因的染色體定位及內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)通過FISH分析將VEGF-X定位于人類染色體4，q31-q32區(qū)的長(zhǎng)臂上(圖2)。對(duì)該探針而論，雜交效率為約70％。數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定了兩種攜有VEGF-X序列的基因組BAC克隆(EMBL編號(hào)AC009582和AC015837)。這些BAC克隆來源自染色體4，支持FISH數(shù)據(jù)。分離含有cDNA的3’部分的BAC克隆。通過對(duì)該克隆直接測(cè)序，可推斷在cDNA的PDGF結(jié)構(gòu)域中剪切事件的位置(圖1中nt.位置1179/1180)。就VEGF-A和VEGF-D而論，剪切位點(diǎn)的位置是保守的(Heng et al.，1993，Hagen et al.，1994)。圖1中所示的其它剪切位點(diǎn)的位置，可從上述數(shù)據(jù)庫(kù)BAC克隆AC009582和AC015837的序列推斷出。
VEGF-X和CUB結(jié)構(gòu)域的測(cè)試總結(jié)VEGF-X和CUB結(jié)構(gòu)域均不增加人類皮膚成纖維細(xì)胞、人類臍內(nèi)皮細(xì)胞、牛軟骨細(xì)胞或人類成骨細(xì)胞(MG63)的增殖。然而，全長(zhǎng)和CUB結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)均能夠以劑量依賴方式刺激人類冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖(圖3)。最佳刺激濃度范圍為1-10μg/ml。全長(zhǎng)或CUB結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的效果，于測(cè)試的最高濃度，均超過對(duì)照水平的四倍(圖2)。我們沒有觀察到CUB結(jié)構(gòu)域?qū)ζ渌〖?xì)胞類型，例如人類骨骼肌細(xì)胞或大鼠心肌(數(shù)據(jù)未顯示)的促有絲分裂活性。去除第三個(gè)半胱氨酸或?qū)⑵渫蛔優(yōu)橐粋€(gè)絲氨酸殘基，我們發(fā)現(xiàn)CUB結(jié)構(gòu)域?qū)θ祟惞跔顒?dòng)脈平滑肌細(xì)胞的促有絲分裂活性降低到大約為最高濃度下的一半(10μg/ml)(數(shù)據(jù)未顯示)。
表1.PDGF-C和相關(guān)蛋白質(zhì)同一性和相似性的成對(duì)比較％同一性％相似性CUBNRP_XENLA 35 50NRP_MOUSE 33 46NRP_CHICK 32 48BMP1_XENLA28 44BMP1_HUMAN24 41％同一性％相似性PDGFVEGFB 29 47VEGFD 29 44PDGFB 29 40PDGFA 29 39VEGFA 25 51VEGFC 24 43PLGF 23 42VEGF-Avs VEGF-C 38 51比較在圖2所示的蛋白質(zhì)區(qū)域間進(jìn)行，用Genedoc程序(http//www.cris.com/~Ketchup/genedoc.shtml)計(jì)算。參考文獻(xiàn)Li，X.，Ponten，A.，Aase，K.，Karlsson，L.，Abramsson，A.，Uutela，M.，Backstrom，G.，Bostrom，H.，Li，H.，Soriano，P.，Betsholtz，C.，Helding，C-H.，Alitalo，K.，Ostman，A.&Eriksson，U.(2000)PDGF-C is a new protease-activated ligandforthe PDGF -receptor.Nature Cell Biology 2，302-309.Sun，P.D.(1995)The cystine-knot growth factor superfamily.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24，269-291.Potgens，A.J.，Lubsen，N.H.，van Altena，M.C.，Vermeulen，R.，Bakker，A.，Schoenmakers，J.G.，Ruiter，D.J.&de Waal，R.M.(1994)Covalent dimerisation of vascular permeabilityfactor/vascular endothelial growth factor is essential for itsbiological activity.Evidence from Cysto Ser mutations.J.Biol.Chem.269，32879-32885.Andersson，M.，Ostman，A.，Backstrom，G.，Hellman，U.，George-Nascimento，C.，Westermark，B.，&Heldin，C-H.(1992)Assignment of interchain disulphide bonds in platelet-derivedgrowth factor(PDGF)and evidence for agoninst activity ofmonomeric PDGF.J.Biol.Chem.267，11260-11266.Heldin，C-H.&Westermark，B.(1999).Mechanism of action andin vivo role of platelet-derived growth factor.PhysiologicalReviews 79，1283-1316.Lusis，AJ.(2000)Atherosclerosis.Nature 407，233-241.Mumtaz FH，Shukla N，Sullivan ME，Thompson CS，Khan MA，MorganRJ，Stansby G，Mikhailidis DP.(2000).Inhibition of diabeticbladder smooth muscle cell proliferation by endothelin receptorantagonists.Urol Res 28，254-259.Devare，S.G.，Reddy，E.P.，Law，J.D.，Robbins，K.C.，&Aaronson，S.A.(1983).Nucleotide sequence of the simiansarcoma virus genomedemonstration that its acquired cellularsequences encode the transforming gene product p28sis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，731-735.Ferrara，N.&Davis-Smyth，T.(1997).The biology of vascularendothelial growth factor.Endocrine Reviews 18，4-25.Neufeld，G.，Cohen，T.，Gengrinovitch，S.&Poltorak，Z.(1999).Vascular endothelial growth factor(VEGF)and its receptors.FASEB J.13，9-22.Soker，S.，Takashima，S.，Miao，HQ.，Neufeld，G.&Klagsbrun，M.(1998).Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumorcells as an isoform-specific receptor for vascular endothelialgrowth factor.Cell 92，735-745.Berse，B.，Brown，L.F.，Van De Water，L.，Dvorak，H.&Senger，D.R.(1992).Vascular permeability factor(vascular endothelialgrowth factor)gene is expressed differentially in normaltissues，macrophages，and tumors.Mol.Biol.Cell 3，211-220.Takahashi，Y.，Kitadai，Y.，Bucana，C.D.，Cleary，K.R.&Ellis，L.M.(1995).Expression of vascular endothelial growth factorand its receptor，KDR，correlates with vascularity，metastasis，and proliferation of human colon cancer.Cancer Research 55，3964-3968.Kim，N.K.，Li，B.，Winer，J.，Armanini，M.，Gillet，N.，Phillips，H.S.&Ferrara，N.(1993).Inhibition of vascularendothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumorgrowth in vivo.Nature 362，841-844.Suzuki J，Isobe M，Morishita R，Nishikawa T，Amano J and KanedaY.(2000).Prevention of cardiac allograft arteriosclerosisusing antisense proliferating-cell nuclear antigenoligonucleotide.Transplantation 70，398-400.Folkman，J.(1995).Angiogenesis in cancer，vascular，rheumatoidand other disease.Nature Medicine 1，27-31.Lagercrantz，J.，F(xiàn)arnebo，F(xiàn).，Larsson，C.，Tvrdik，T.，Weber，G.&Piehl，F(xiàn).(1998).A comparative study of the expressionpatterns for vegf，vegf-b/vrf and vegf-c in the developing andadult mouse.Biochem.Biophys.Acta 1398，157-163.Lee，J.，Gray，A.，Yuan，J.，Luoh，S-M，Avraham，H.&Wood，W.I.(1996).Vascular endothelial growth factor-related proteinaligand and specific activator of the tyrosine kinase receptorFlt4.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，1988-1992.Fitz，L.J.，Morris，J.C.，Towler，P.，Long，A.，Burgess，P.，Greco，R.，Wang，J.，Gassaway，R.，Nickbarg，E.，Kovacic，S.，Ciarletta，A.，Gianotti，J.，F(xiàn)innerty，H.，Zollner，R.，Beier，D.R.，Leak，L.V.，Turner，K.J.&Wood，C.R.(1997).Characterization of murine Flt4 ligand/VEGF-C.Oncogene 15，613-618.Yamada，Y.，Nezu，J.，Shimane，M.and Hirata，Y.(1997).Molecular cloning of a novel Vascular endothelial growth factor，VEGF-D.Ganomics 42，483-488.Gribskov，M.，McLachlan，A.D.&Eisenberg，D.(1987).ProfileanalysisDetection of distantly related proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，4355-4358.Ausubel，F(xiàn).M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.&Struhl，K.(Eds).(1997)Currant Protocolsin Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.Masure，S.，Cik，M.，Pangalos，M.，Bonaventure，P.，Verhasselt，P.，Lesage，A.S.，Leysen，J.E.&Gordon，R.D.(1998).Molecular cloning，expression and tissue distribution ofglial-cell-derived neurotrophic factor receptor 3(GFR-3).Eur.J.Biochem.251，622-630.Heng，H.H.Q.，Squire，J.&Tsui，L.-C.(1992)High resolutionmapping of mammalian genes by in situ hybridization to freechromatin.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，9509-9513.Robert C，F(xiàn)ouchet C，Vergely C，Pruneau D，Belichard P.(1995)Quantitative image analysis of cell proliferation after ballooncatheter injury in the rabbit carotid artery.Anal Quant CytolHistol 17(6)366-73.Heng，H.H.Q.&Tsui，L.-C.(1993)Modes of DAPI banding andsimultaneous in situ hybridisation.Chromosoma 102，325-332.Hagen P.O.，Davies M.G.，(1994)Pathobiology of intimalhyperplasia.Vr J Surg 81(9)，1254-1269.Buschmann，M.D.，Gluzband，Y.A.，Grodzinsky，A.J.，Kimura，J.H.，and Hunziker，E.B，(1992).Chodrocytes in agarose culturesynthesize a mechanically functional extracellular matrix.J.Orthop.Res.10，745-758.Von Heijne，G.，(1986)A new method for predicting signalsequence cleavage sites.Nucleic Acids Res.14，4683-4690.Bork，P.&Beckmann，G.，(1993).The CUB domaina widespreadmodule in developmentally regulated proteins.J.Mol.Biol.231，539-545.Tischer，E.，Mitchell，R.，Hartman，T.，Silva，M.，Gospodarowicz，D.，F(xiàn)iddes，J.C.and Abraham，J.A.(1991).Thehuman gene for vascular endothelial growth factorMultipleprotein forms are encoded through alternative exon splicing.J.Biol.Chem.266，11947-11954.Rocchigiani，M.，Lestingi，M.，Luddi，A.，Orlandini，M.，F(xiàn)ranco，B.，Rossi，E.，Ballabio，A.，Zuffardi，O.and Oliviero，S.(1998).Human FIGFcloning，gene structure，and mapping tochromosome Xp22.1 between the PIGA and the GRPR genes.Genomics，47，207-216.10 Romero，A.，Romao，M.J.，Varela，P.F.，Kolln，I.，Dias，J.M.，Carvalho，A.L.，Sanz，L.，Topfer-Petersen，E.&Calvete，J.L.(1997).The crystal structures of two spermadhesins revealthe CUB domain fold.Nature Struct.Biol.4，783-788.Paavonen，K.，Horelli-Kuitunen，N.，Chilov，D.，Kukk，E.，Pennanen，S.，Kallioniemi，O.P.，Pajusola，K.，Olofsson，B.，Eriksson，U.，Joukov，V.，Palotie，A.&Alitalo，K.(1996)Novel human vascular endothelial growth factor genes VEGF-B andVEGF-C localize to chromosomes 11q13 ard 4q34，respectively.Circulation 93，1079-1082.Stacker，S.A.，Stenvers，K.，Caesar，C.，Vitali，A.，Domagala，T.，Nice，E.，Roufail，S.，Simpson，R.，Moritz，R.，Karpanen，T.，Alitalo，K.&Achen，M.(1999).Biosynthesis of vascularendothelial growth factor-D involves proteolytic processingwhich generates non-covalent homodimers.J.Biol.Chem.274，32127-32136.Makinen，T.，Olofsson，B.，Karpanen，T.，Hellman，U.，Soker，S.，Klagsbrun，M.，Eriksson，U.&Alitalo，K.(1999).Differentialbinding of vascular endothelial growth factor B splice andproteolytic isoforms to neuropilin-1.J.Biol.Chem.274，21217-21222.Bateman，A.，Birney，E.，Durbin，R.，Eddy，S.，Howe，K.L.&Sonnhammer，E.L.L.(2000).The Pfam protein families.Yokoyama，T.，Huard，J.，Chancellor，M.B.World J.Urol.1856-61(2000)；Chancellor，M.B.，Yokoyama，T.，Tirney，S.，Mattes，C.E.，Ozawa，H.，Yoshimura，N.，de Groat，W.C.，Huard，J.Neurol.Urodyn.19279-87(2000).
序列表<110>詹森藥業(yè)有限公司<120>平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)<130>JAB 1687<150>US 60/274901<151>2001-03-09<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>345<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110
Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr145 150 155 160Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu165 170 175Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala180 185 190Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp195 200 205Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly210 215 220Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu225 230 235 240Leu Thr Glu Glu Val Arg Leu Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Phe Ser245 250 255Val Ser Ile Arg Glu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Thr Ile Phe Trp Pro260 265 270Gly Cys Leu Leu Val Lys Arg Cys Gly Gly Asn Cys Ala Cys Cys Leu275 280 285His Asn Cys Asn Glu Cys Gln Cys Val Pro Ser Lys Val Thr Lys Lys290 295300
Tyr His Glu Val Leu Gln Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly Leu305 310 315 320His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys Asp325 330 335Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly340 345<210>2<211>111<212>PRT<213>人<400>2Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn1 5 10 15Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr20 25 30Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln35 40 45Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile50 55 60Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile65 70 75 80Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser85 90 95Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe Val Ser Asp Glu Tyr Phe100 105 110
<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PDGF-C正向引物<400>3gtttgatgaa agatttgggc ttg 23<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PDGF-C反向引物<400>4ctggttcaag atatcgaata aggtcttee 29<210>5<211>282<212>PRT<213>人<400>5Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60
His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr145 150 155 160Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu165 170 175Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala180 185 190Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp195 200 205Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly210 215 220Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu225 230 235 240Leu Thr Glu Glu Val Leu Gln Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly245 250 255
Leu His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys260 265 270Asp Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly275 280<210>6<211>167<212>PRT<213>人<400>6Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe
130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Ser Asn Arg Gly Gly Lys145 150 155 160Ile Ile Gln Leu His Thr Ser16權(quán)利要求
1.下列任意一種物質(zhì)在制造用于刺激組織和器官中的平滑肌細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用編碼包含圖1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含所述核酸分子的表達(dá)載體、包含圖1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體、或包含所述核酸分子、載體或所述VEGF-X多肽中任意一種物質(zhì)的藥物組合物。
2.下列任意一種物質(zhì)在制造用于治療或預(yù)防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙中的任意一種、或用于骨盆底重建的藥物中的應(yīng)用編碼包含圖1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含所述核酸分子的表達(dá)載體、包含圖1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體、或包含所述核酸分子、載體或VEGF-X多肽中任意一種物質(zhì)的藥物組合物。
3.下列任意一種物質(zhì)在制造用于刺激組織和/或器官中的平滑肌細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用包含圖1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物或衍生物的CUB結(jié)構(gòu)域、或編碼所述CUB結(jié)構(gòu)域或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含所述核酸分子的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述CUB結(jié)構(gòu)域包含圖1(a)所描述的氨基酸序列的40-150位的多肽。
5.下列任意一種物質(zhì)在制造用于治療或預(yù)防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙中的任意一種、或用于骨盆底重建的藥物中的應(yīng)用圖1(a)的VEGF-X多肽的CUB結(jié)構(gòu)域、或編碼所述CUB或其功能等同物或衍生物的核酸分子、包含所述核酸分子或所述CUB結(jié)構(gòu)域中任意一種物質(zhì)的藥物組合物。
6.一種刺激組織或器官中的平滑肌細(xì)胞增殖、或刺激受試者中的組織修復(fù)的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的下列任意一種物質(zhì)編碼包含圖1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽的VEGF-X核酸分子、或圖1(a)的VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體，其濃度足夠刺激平滑肌細(xì)胞增殖。
7.一種治療或預(yù)防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、骨盆底重建、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的下列任意一種物質(zhì)包含圖1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體、編碼該多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含該核酸分子的表達(dá)載體，和包含所述核酸分子或所述多肽中任意一種物質(zhì)的藥物組合物。
8.一種通過施用治療有效量的下列任意一種物質(zhì)治療尿道功能障礙、膀胱功能障礙、或用于骨盆底重建、治療括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙的方法包含圖1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體、包含該多肽連同其藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
9.一種刺激組織或器官中的平滑肌細(xì)胞增殖、或刺激受試者中的組織修復(fù)的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的包含圖1(a)描述的核苷酸序列的40-150位的序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物或衍生物的CUB結(jié)構(gòu)域，其濃度足夠刺激平滑肌細(xì)胞增殖。
10.一種治療或預(yù)防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、骨盆底重建、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的下列任意一種物質(zhì)編碼包含圖1(a)描述的氨基酸序列的40-150位的序列的CUB結(jié)構(gòu)域或其功能等同物或衍生物的核酸分子、包含該核酸分子的表達(dá)載體，和包含意所述核酸分子和所述CUB結(jié)構(gòu)域中任意一種物質(zhì)的藥物組合物。
11.一種治療尿道功能障礙、膀胱功能障礙、或用于骨盆底重建、治療括約肌功能障礙、或與CUB結(jié)構(gòu)域多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙的方法，該方法包括施用治療有效量的包含圖1(a)描述的氨基酸序列的40-150位的多肽的CUB結(jié)構(gòu)域多肽或其功能等同物或衍生物、包含該CUB結(jié)構(gòu)域及其藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或其賦形劑的藥物組合物中的任意一種物質(zhì)。
12.一種可結(jié)合于包含一個(gè)圖1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽或其表位的抗體在制造用于治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、因動(dòng)脈吻合術(shù)或球囊導(dǎo)管引起的新內(nèi)膜增生、因經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后動(dòng)脈擴(kuò)張引起的血管成形術(shù)后再狹窄中的任意一種的藥物中的應(yīng)用。
13.一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、因動(dòng)脈吻合術(shù)或球囊導(dǎo)管引起的新內(nèi)膜增生、因經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后動(dòng)脈擴(kuò)張引起的血管成形術(shù)后再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的在高嚴(yán)格性條件下，可雜交于編碼圖1(a)的VEGF-X多肽的核酸分子、或其互補(bǔ)序列的反義多核苷酸分子，其濃度足夠治療或預(yù)防所述病癥。
14.一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、因動(dòng)脈吻合術(shù)或球囊導(dǎo)管引起的新內(nèi)膜增生、因經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后動(dòng)脈擴(kuò)張引起的血管成形術(shù)后再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的圖1(a)的VEGF-X多肽的拮抗劑，其濃度足夠治療或預(yù)防所述病癥。
15.一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、因動(dòng)脈吻合術(shù)或球囊導(dǎo)管引起的新內(nèi)膜增生、因經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后動(dòng)脈擴(kuò)張引起的血管成形術(shù)后再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的可結(jié)合于圖1(a)的VEGF-X多肽或其表位的抗體，其濃度足夠治療或預(yù)防所述病癥。
16.一種診斷受試者中病理學(xué)狀況或?qū)Σ±韺W(xué)狀況易感性的方法，該方法包括(a)測(cè)定生物樣品中圖1(a)的VEGF-X多肽或其受體的突變的存在與否；及(b)基于VEGF-X多肽或其受體的表達(dá)程度，診斷病理學(xué)狀況或?qū)Σ±韺W(xué)狀況的易感性。
17.一種鑒定抑制或增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞增殖的化合物的方法，該方法包括在圖1(a)的VEGF-X多肽的存在下，使表達(dá)VEGF-X受體的細(xì)胞接觸該化合物，并監(jiān)測(cè)與沒有和所述化合物接觸的細(xì)胞相比，所述化合物對(duì)所述細(xì)胞的作用。
18.一種用于直接遞送圖1(a)的VEGF-X多肽的拮抗劑，或編碼所述多肽的核酸分子的反義分子，或可結(jié)合于所述VEGF-X多肽或其表位的中和抗體的方法，該方法包括經(jīng)由栓子切除術(shù)導(dǎo)管的球囊尖端給予所述拮抗劑、反義分子或抗體，以限制牽張損傷后的新內(nèi)膜增生。
19.下列任意一種物質(zhì)在制造用于刺激組織和器官中的平滑肌細(xì)胞增殖的藥物中的應(yīng)用編碼VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含該核酸分子的表達(dá)載體、VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體、或者包含所述核酸分子、或所述VEGF-X多肽中任意一種物質(zhì)的藥物組合物。
20.下列任意一種物質(zhì)在制造用于治療或預(yù)防尿道、膀胱或括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙中的任意一種、或用于骨盆底重建的藥物中的應(yīng)用編碼VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含該核酸分子的表達(dá)載體、VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體、或者包含所述核酸分子、或所述VEGF-X多肽中任意一種物質(zhì)的藥物組合物。
21.下列任意一種物質(zhì)在制造用于刺激組織和/或器官中的平滑肌增殖的藥物中的應(yīng)用VEGF-X多肽的CUB結(jié)構(gòu)域、或編碼該CUB結(jié)構(gòu)域、或其功能等同物、或衍生物的核酸分子、包含該核酸分子的表達(dá)載體、包含該CUB結(jié)構(gòu)域、核酸分子或表達(dá)載體中的任意一種物質(zhì)的藥物組合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的應(yīng)用，其中所述CUB結(jié)構(gòu)域包含圖1(a)描述氨基酸序列的40-150位的多肽。
23.下列任意一種物質(zhì)在制造用于治療或預(yù)防尿道、膀胱或括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙、或用于骨盆底重建的藥物中的應(yīng)用VEGF-X多肽的CUB結(jié)構(gòu)域、或編碼該CUB結(jié)構(gòu)域、或其功能等同物、或衍生物的核酸分子、包含該核酸分子的表達(dá)載體、包含該CUB結(jié)構(gòu)域、核酸分子或表達(dá)載體中的任意一種物質(zhì)的藥物組合物。
24.一種刺激組織或器官中的平滑肌細(xì)胞增殖、或刺激受試者中組織修復(fù)的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的編碼VEGF-X多肽的核酸分子、或VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體，其濃度足夠刺激平滑肌細(xì)胞增殖。
25.一種治療或預(yù)防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、骨盆底重建、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的下列任意一種物質(zhì)VEGF-X多肽、編碼該多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含該核酸分子的表達(dá)載體和包含該核酸分子或該多肽中的任何一種物質(zhì)的藥物組合物。
26.通過施用治療有效量的下列任意一種物質(zhì)治療尿道功能障礙、膀胱功能障礙、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙或者用于骨盆底重建的方法VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體、一種包含該多肽連同其藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
27.一種刺激組織或器官中的平滑肌細(xì)胞增殖，和所述受試者中組織修復(fù)的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的VEGF-X多肽或其功能等同物或衍生物的CUB結(jié)構(gòu)域，其濃度足夠刺激平滑肌細(xì)胞增殖。
28.一種治療或預(yù)防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、骨盆底重建、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的下列任意一種物質(zhì)編碼CUB結(jié)構(gòu)域或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含該核酸分子的表達(dá)載體、和包含該核酸分子和該CUB結(jié)構(gòu)域中的任意一種物質(zhì)的藥物組合物。
29.一種治療尿道功能障礙、膀胱功能障礙、括約肌功能障礙、或與CUB結(jié)構(gòu)域多肽的異常內(nèi)源活性相關(guān)的功能障礙，或者用于骨盆底重建的方法，該方法包括施用治療有效量的下列任意一種物質(zhì)CUB結(jié)構(gòu)域、包含該CUB結(jié)構(gòu)域多肽或其功能等同物、或其衍生物及藥學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
30.一種可結(jié)合于VEGF-X多肽或其表位的抗體在制造用于治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、因動(dòng)脈吻合術(shù)或球囊導(dǎo)管引起的新內(nèi)膜增生、因經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后動(dòng)脈擴(kuò)張引起的血管成形術(shù)后再狹窄中的任何一種的藥物中的應(yīng)用。
31.一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、因動(dòng)脈吻合術(shù)或球囊導(dǎo)管引起的新內(nèi)膜增生、因經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后動(dòng)脈擴(kuò)張引起的血管成形術(shù)后再狹窄中的任何一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的編碼VEGF-X多肽的核酸分子的反義分子，其濃度足夠治療或預(yù)防所述病癥。
32.一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、因動(dòng)脈吻合術(shù)或球囊導(dǎo)管引起的新內(nèi)膜增生、因經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后動(dòng)脈擴(kuò)張引起的血管成形術(shù)后再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的VEGF-X多肽的拮抗劑，其濃度足夠治療或預(yù)防所述病癥。
33.一種治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、因動(dòng)脈吻合術(shù)或球囊導(dǎo)管引起的新內(nèi)膜增生、因經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后動(dòng)脈擴(kuò)張引起的血管成形術(shù)后再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的可結(jié)合于VEGF-X多肽或其表位的抗體，其濃度足夠治療或預(yù)防所述病癥。
34.一種診斷受試者中的病理學(xué)狀況或?qū)Σ±韺W(xué)狀況的易感性的方法，該方法包括(a)測(cè)定生物樣品中VEGF-X多肽或其受體的突變的存在與否；及(b)基于VEGF-X多肽或其受體的表達(dá)程度，診斷病理學(xué)狀況或?qū)Σ±韺W(xué)狀況的易感性。
35.一種鑒定抑制或增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞增殖的化合物的方法，該方法包括在VEGF-X多肽的存在下，使表達(dá)VEGF-X受體的細(xì)胞接觸該化合物，并監(jiān)測(cè)與沒有和所述化合物接觸的細(xì)胞相比，所述化合物所述細(xì)胞的作用。
36.一種用于直接遞送VEGF-X多肽的拮抗劑，或編碼所述多肽的核酸分子的反義分子，或可結(jié)合于所述VEGF-X多肽或其表位的中和抗體的方法，該方法包括經(jīng)由栓子切除術(shù)導(dǎo)管的球囊尖端給予所述拮抗劑、反義分子或抗體，以限制牽張損傷后的新內(nèi)膜增生。
全文摘要
本發(fā)明提供了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，此處命名為VEGF－X，和VEGF－X的序列中的CUB結(jié)構(gòu)域的一種新應(yīng)用，它們?cè)鰪?qiáng)平滑肌細(xì)胞增殖，并且可用于治療與平滑肌細(xì)胞增殖減少相關(guān)的疾病。VEGF－X和CUB結(jié)構(gòu)域也可被用于組織工程應(yīng)用，增加特定組織內(nèi)部平滑肌細(xì)胞數(shù)量，以恢復(fù)該組織功能或結(jié)構(gòu)。本發(fā)明也公開了用于確定VEGF－X生物活性抑制劑的篩選方法，這些抑制劑包括中和性VEGF－X抗體，反義VEGF－X序列，或與VEGF－X生物活性競(jìng)爭(zhēng)的非蛋白拮抗劑。本發(fā)明也提供了與平滑肌細(xì)胞過度增殖相關(guān)病癥的治療方法，及對(duì)與平滑肌細(xì)胞過度增殖相關(guān)的病理學(xué)狀況、或與平滑肌細(xì)胞過度增殖相關(guān)的病理學(xué)狀況易感性的診斷方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1568194SQ02806185
公開日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2002年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月9日
發(fā)明者J·C·格辛, A·戈西夫斯卡, J·徐, R·戈?duì)栴D, J·約恩, S·N·哈納拉, I·哈里斯 申請(qǐng)人:詹森藥業(yè)有限公司