專利名稱：金屬取代的非中心對稱型酞菁類似物，其制備方法以及在光動力治療和體內(nèi)診斷中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非中心對稱型Me-酞菁類似物，其具有能夠使它們與生物載體通過共價鍵連接的位置特異性反應(yīng)活性基團，并且具有良好的溶解性和得到增強的光動力特性。
本發(fā)明還涉及由如上定義的金屬-酞菁類似物與氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、多糖和適體組成的綴合物。
此外，本發(fā)明還涉及上述產(chǎn)物的制備方法以及含有這些產(chǎn)物的藥物組合物，該組合物可用于體內(nèi)/間接體內(nèi)(ex vivo)治療和體外/體內(nèi)診斷目的。
現(xiàn)有技術(shù)已知，由于光輻射而能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧的有機分子，可以具有光增強的殺生物活性。這種分子的殺生物特性基本上隨每個活體形式而出現(xiàn)，使得這些分子在治療性應(yīng)用中極其有意義。
光敏劑的實際應(yīng)用通常受到限制，因為這些產(chǎn)物是過敏原，在一些情形中會保留在人的皮膚中，或者非特異性地定位在發(fā)病組織中，由此在光照射后引起光毒性。
二十世紀(jì)七十年代的早期工作，以及隨后在二十世紀(jì)八十年代進行的研究，都表明可以使用光敏劑來抗病毒、真菌、細(xì)菌和真核細(xì)胞。Dougherty等(Cancer Res.，1978，38，262)充當(dāng)了PDT領(lǐng)域的先鋒，他們將可光活化的染料和長波長照射結(jié)合使用來治療腫瘤。
盡管在此領(lǐng)域人們已取得了大量的進展，但仍需要在感染性疾病和腫瘤疾病的PDT治療中均能使用的新化合物。
通過使用合成的化學(xué)純的可光活化產(chǎn)物，可以解決早期以天然存在的起始物料為基礎(chǔ)的藥劑的不足，因為這些合成產(chǎn)物更容易進行進一步的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾。
在值得進一步開發(fā)的各種新的光敏劑中，所謂的“第二代光敏劑”，酞菁，四苯并四氮雜卟啉的簡稱，似乎是用于治療應(yīng)用的最重要的光敏劑之一。
EP 906 758中描述了具有光動力治療(PDT)和診斷用途的Zn(II)-酞菁類化合物，此專利申請是以相同申請人的名義申請的。其中所描述的產(chǎn)品顯示出非常值得注意的特性，因為它們易于制備，具有低的內(nèi)在毒性(暗毒性)，但同時又可以作為產(chǎn)生單線態(tài)氧或自由基的光敏劑，在增殖的細(xì)胞中可被選擇性吸收，在施用后可從非靶組織中快速降解并且最終消除，可作為化學(xué)純的和穩(wěn)定的化合物得到，最后易于進一步合成修飾，以便更具選擇性。
為進一步改進這種光敏劑的治療潛力，需要對它們進行特定性的設(shè)計，以便使其容易與本身能夠特異性識別生物靶的載體相連，由此提供到達(dá)需要根除的活體形式、同時又不影響周圍健康細(xì)胞的方式。
具體說，為允許與生物學(xué)相關(guān)的大分子載體化學(xué)綴合，應(yīng)當(dāng)使酞菁帶有反應(yīng)活性官能團，該反應(yīng)活性官能團僅對大分子的一個官能團和親水性基團具有特異性，目的是不引起綴合物整體親水性質(zhì)的變化。此外，這種適宜取代基的存在應(yīng)當(dāng)不妨礙酞菁的光動力。
必須注意的是，前述的酞菁不適宜于連接生物學(xué)相關(guān)的載體，因為它們?nèi)狈μ禺愋苑磻?yīng)活性基團，因此不能發(fā)生反應(yīng)，除非使用特別設(shè)計的交聯(lián)試劑，或者它們具有一個以上的反應(yīng)活性基團并且因此在綴合過程中使用它們會導(dǎo)致蛋白質(zhì)不受控制地聚合和交聯(lián)，從而進一步導(dǎo)致難以純化和分析綴合物制品。
可溶于有機溶劑的帶有一個反應(yīng)活性基團的疏水性酞菁，以前已有描述(H.Kliesh等Liebigs Ann.1995，1269-1273)，然而這種酞菁的整體疏水特性可引起大分子親水性平衡的改變，對綴合物的穩(wěn)定性具有不利影響，可以引起不可逆的聚集問題并導(dǎo)致載體變性。
鑒于以上所述，提供同時具有物理-化學(xué)特性和光動力增強特性的新的產(chǎn)物是必要的，由此允許使用它們來抗更廣譜的病變，同時降低不期望的副作用，這兩方面可以通過使用本發(fā)明所述的產(chǎn)物來實現(xiàn)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及下式(I)的Me-酞菁類似物及其可藥用鹽 其中n是1、2或4；M選自Zn、Si(OR7)2和AlOR7，其中R7選自H、C1-15烷基；R選自-COOH、-SH、-OH、-NH2、-CO-CH2-Br、-SO2Cl、馬來酰亞胺、酰肼、苯酚、亞胺酸酯、生物素(biotine)，其可能通過適宜的連接基與酞菁母核相結(jié)合，并且R1是H或者，當(dāng)n＝2并且兩個R1基團在第9、10、16、17、23、24位時，所說的兩個R1基團可以形成飽和或不飽和的雜環(huán)，其可能是取代的，該雜環(huán)可以含有最多兩個選自N、O、S的雜原子；或者R1由基團(X)pR2表示，其中X選自O(shè)、S、-NR5和-CH2-，并且R2是
其中Y選自C1-10烷基和苯基，其可能是取代的，或者它和與之相結(jié)合的基團Z一起形成飽和或不飽和的雜環(huán)，其可能是取代的，該雜環(huán)可以含有最多兩個選自N、O和S的雜原子；Z選自-N、-CH2N和-CONHCH2CH2N；R3和R4彼此相同或不同，選自C1-15烷基和苯基，或者和與之相結(jié)合的基團Z一起形成飽和或不飽和的雜環(huán)，其可能是取代的，該雜環(huán)可以含有最多兩個選自N、O和S的雜原子；R5和R6彼此相同或不同，選自H和C1-15烷基；m、n、p、w、t和u彼此獨立地是0或1；并且v是1至3的整數(shù)；前提條件是R在1或2位當(dāng)n＝1時，R1在以下位置8(11)、15(18)、22(25)或9(10)、16(17)、23(24)，當(dāng)n＝2時，R1在以下位置8、11、15、18、22、25或9、10、16、17、23、24。
本發(fā)明還涉及與生物有機載體綴合的如上定義的式(I)化合物，所說的生物有機載體是例如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、多糖和適體(aptamer)。
附圖概述

圖1顯示了白色念珠菌的菌落形成單元(CFU)隨實施例7和8的化合物濃度(μM)的變化，實施例7和8的化合物在圖中分別作為MRLP 090和MRLP 091來表示。
發(fā)明詳述本發(fā)明由于有了如上定義的式(I)化合物，從而解決了上面所說的問題。
本發(fā)明中，Zn(II)-酞菁是優(yōu)選的，其中R如前所定義，并且R1由如前定義的基團(X)pR2表示。
本發(fā)明中，定義“適宜的連接基”意指在蛋白質(zhì)和核酸修飾領(lǐng)域中通常賦予這個定義的含義(S.S.Wang，蛋白質(zhì)綴合和交聯(lián)化學(xué)(Chemistry ofProtein Conjugation and Cross-Linking)，CRC Press，Inc.1993，G.T.Hermanson Bioconjugate Techniques Academic Press，1996)，即在酞菁母核和生物大分子之間起間隔基作用的脂族或芳族部分，以便滿足所需的空間和/或結(jié)構(gòu)要求。
在上述通式中定義的“飽和或不飽和的雜環(huán)，其可能是取代的”，優(yōu)選指的是以下化合物嗎啉、哌啶、吡啶、嘧啶、哌嗪、吡咯烷、吡咯啉、咪唑、苯胺和久洛尼定(2，3，6，7-四氫-1H，5H-吡啶并[3，2，1-ij]喹啉)。
本發(fā)明中，優(yōu)選的產(chǎn)物是其中的基團(X)pR2含有帶叔氮或季氮的取代基的化合物。具體地說，所說的基團(X)pR2優(yōu)選由下式來表示


本發(fā)明的化合物可以根據(jù)有機化學(xué)中已知的合成方法(并且在以上提及的專利中也有描述)以及通過使用亞酞菁(sub-phthalocyanine)途經(jīng)在均相以及多相體系中制備。
式(I)的陽離子酞菁可以通過將前述的相應(yīng)的中性化合物與過量的烷基碘反應(yīng)來制備，反應(yīng)在有或沒有有機溶劑的存在下、在室溫和回流溫度之間的溫度下進行，反應(yīng)時間為1小時至200小時。本發(fā)明的帶有堿性取代基的酞菁化合物的可藥用鹽包括，通過添加HCl、H3PO4、H2SO4、HBr等獲得的常規(guī)的酸加成鹽。
除此之外，通過將酞菁環(huán)內(nèi)的羧基官能團或酸性基團反應(yīng)獲得的鹽也屬于本發(fā)明的范圍。這種鹽包括，例如，羧酸和磺酸與胺衍生物、堿性氨基酸和無機堿的鹽。
本發(fā)明的化合物具有兩種價值，一是本身作為PDT劑，二是允許將其與能夠識別與疾病有關(guān)的生物靶的載體結(jié)構(gòu)結(jié)合，由此制備靶特異性衍生物。具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物可作為PDT染料用于治療由病毒、真菌和細(xì)菌引起的感染性疾病，并可用于治療癌癥和皮膚疾病，此外，它們還可以作為診斷助劑用于定位發(fā)生病理改變的區(qū)域。
通過常規(guī)化學(xué)過程，可將一羧基酞菁轉(zhuǎn)化成多種脂族和芳族酯或酰胺，其中在烷基或芳基上帶有一個或多個取代基。衍生物包括酯、酰胺、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)(特別是抗體)、糖、適體、磺酸酯等。酞菁多羥基化衍生物、如含有單糖或多糖的糖苷化合物，作為PDT劑有非常大的實用性，因為所得的衍生物，與不含這種取代基的很多疏水性酞菁不同，是親水性的。由于疏水性和親水性酞菁選擇性地濃縮于細(xì)胞環(huán)境中的不同部位，因此它們具有有用的應(yīng)用。
通過常規(guī)的化學(xué)過程，可將氨基酞菁轉(zhuǎn)化成烷基、脂環(huán)族、芳烷基或芳香族仲和叔胺或轉(zhuǎn)化成酰胺。也可以將伯氨基取代基轉(zhuǎn)化成重氮鹽，并且通過隨后的置換反應(yīng)，獲得鹵代和相關(guān)的衍生物。單氨基取代的酞菁中的氨基還有助于容易使酞菁環(huán)與具有如上所述的轉(zhuǎn)運和結(jié)合有益效果的肽和蛋白質(zhì)連接。
特別值得注意的是將其中不參與與載體連接的氨基用各種烷基化劑進一步轉(zhuǎn)化成季銨鹽的酞菁衍生物，因為發(fā)現(xiàn)這些化合物具有選擇性的抗革蘭氏-/+菌或酵母微生物的活性。
通過使用固相有機合成的策略，可以將酞菁部分結(jié)合到與固相相連的預(yù)裝配的側(cè)鏈?zhǔn)鼙Ｗo的多肽或多核苷酸上，使得酞菁可以與肽或核苷酸的N-末端特異性的結(jié)合而不擾亂其結(jié)構(gòu)，由此改進靶的整體識別性。
正如可從式(I)中看到的，本發(fā)明的酞菁衍生物是芳族化合物，其顯出改進的吸收性和單線態(tài)氧光敏化特征。這些化合物中含有能夠改進其光致敏特性和/或能夠在光吸收中引起紅移、同時保留光動力特性的取代基。這些化合物具有能夠與預(yù)定官能團連接的側(cè)鏈，這些預(yù)定的官能團起把柄的作用，用于連附蛋白質(zhì)或其它可以識別生物結(jié)構(gòu)上特異性靶點的載體。
無論是引入取代基，還是將酞菁與蛋白質(zhì)綴合，都可以通過與光的相互作用加速酞菁部分的代謝，由此在體內(nèi)破壞吸光發(fā)色團，以便產(chǎn)生不可被光活化的代謝物，這種代謝物是光化學(xué)無害的，因此不會引起PDT后的光毒性。
例如，親水性取代基的存在和綴合都能夠加速沒有到達(dá)體內(nèi)靶的那些分子的消除。吸光發(fā)色團可以被體內(nèi)消除，由此避免出現(xiàn)延遲型皮膚或全身中毒，產(chǎn)生不可被光活化的、無毒的光解產(chǎn)物。
諸如季銨鹽或磺酸鹽的衍生物也是重要的，因為陽離子和陰離子染料能夠濃縮于細(xì)胞的不同區(qū)域。通過肽鍵與肽或蛋白質(zhì)共價結(jié)合的酞菁，提供了具有有價值的特異性轉(zhuǎn)運和選擇性結(jié)合特性的PDT劑。
因此，本發(fā)明的化合物，在施用后從體內(nèi)快速清除方面，優(yōu)于簡單衍生的酞菁。由于它們在發(fā)病區(qū)域中的特異性定位而導(dǎo)致所用的劑量較少，因而它們在與特定載體綴合后的毒性方面也是優(yōu)秀的。本發(fā)明化合物分子的一個重大改進是它們具有紅移的吸光性。波長大于670nm的紅光對安全治療各種疾病來說是非常適宜的。由于波長低于650nm的光在穿入人組織后會喪失其大部分能量，在諸如腫瘤和感染性疾病這些非表面定位疾病的應(yīng)用中，較長的波長比低穿透性的較短波長更適合用于染料活化。
與大分子綴合提供了進一步增加最大吸收波長的方式。
可以用于與本發(fā)明的肽菁綴合的化合物是，例如氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖苷、適體；例如抗生物素蛋白、伴刀豆球蛋白A、琥珀酰伴刀豆球蛋白A、單克隆和重組抗體或其片段。此外，由于轉(zhuǎn)運、遷移、與細(xì)胞受體的結(jié)合與染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)、特別是染料的親水性或疏水性特征有關(guān)，因此具有可對其進行進一步的化學(xué)結(jié)構(gòu)處理的一級化學(xué)結(jié)構(gòu)顯然是有益的。
當(dāng)化合物含有連接的氨基酸、肽或蛋白質(zhì)時，它們通常是借助于酰胺鍵、硫醚鍵、二硫鍵或酯鍵與化合物結(jié)合的。例如，可以通過使酞菁上的羧基與氨基酸中存在的α-氨基或其它氨基形成酰胺鍵，將氨基酸與酞菁結(jié)合，或者可以將酞菁上的氨基與氨基酸上存在的羧基結(jié)合。
適宜的氨基酸包括20種天然存在的氨基酸，R和S形式的都包括，以及非天然存在的合成氨基酸。
可以類似地將肽結(jié)合至酞菁的環(huán)結(jié)構(gòu)上，并且所說的肽通常含有2-20個氨基酸，但也可以使用完整的蛋白質(zhì)(特別是對靶顯示特異性的蛋白質(zhì))作為載體。
可以通過上述的羧基或氨基，或者通過使用其它特異性官能團，如硫醇、馬來酰亞胺衍生物、α-溴代酯和酰胺、重氮鹽和疊氮化物衍生物，將酞菁與蛋白質(zhì)相連接。
在酞菁糖苷衍生物中，糖部分可以通過常規(guī)的糖苷鍵與酞菁環(huán)體系相連，所述的糖部分可以由單糖(無論是開鏈形式還是環(huán)狀的)、低聚糖或多糖組成。因此，可以使用任何普通單糖和低聚糖來制備本發(fā)明的酞菁糖苷。
通過使用密切相關(guān)的常規(guī)化學(xué)過程，可以制備由所述酞菁衍生物和適體構(gòu)成的綴合物。
很多可能的衍生物中全部都含有完整的大環(huán)酞菁發(fā)色團，并且在適當(dāng)?shù)妮椛錀l件下都能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧或自由基，因此都構(gòu)成了可用于PDT的有前景的光活化型染料。
使用上述過程，獲得了以下產(chǎn)物；具體地說，在實施例1-15中，描述了氨基反應(yīng)活性化合物(即，其中R是能夠與氨基反應(yīng)的基團的化合物)，在實施例16中，R是能夠與Tyr和His反應(yīng)的基團，在實施例17-19中，描述了生物素(biotine)官能化的衍生物，在實施例20-21中，R是能夠與硫羥基反應(yīng)的基團并且在實施例23中，R是能夠與碳水化合物反應(yīng)的基團。在實施例23中，R是能夠與羧基形成酯鍵的基團。
實施例12-[(4-羥基羰基)苯氧基]-{[9，10][16，17][23，24]-三苯并}鋅(II)酞菁。C51H26N8O3Zn；綠色-藍(lán)色固體；UV-vis(DMF)λmax746，725，339；ESI-MS，m/z 863[M+H]+。
實施例22-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9(10)，16(17)，23(24)-三[2-(嗎啉-1-基)乙氧基]鋅(II)酞菁。C57H53N11O9Zn；綠色-藍(lán)色固體；UV-vis(DMF)λmax678，611，358，276；1H-NMR(DMSOd6)，δ9.5-9.3(m，1H)，9.3-9.0(m，4H)，9.0-8.8(m，3H)，8.2-8.0(m，2H)，7.8-7.6(m，4H)，7.5-7.3(m，2H)，4.8-4.5(m，6H)，3.85-3.65(m，12H)，3.1-2.9(m，6H)，2.8-2.6(m，12H)；ESI-MS m/z 1100.6[M+H]+，987.6[M+C6H13NO]+。
實施例32-[(4-羥基羰基)苯氧基]-2(3)，9(10)，16(17)，23(24)-三[2-(哌啶-1-基)乙氧基]鋅(II)酞菁。C60H59N11O6Zn；UV-vis(DMF)λmax(ε，M-1cm-1)678(1.308×105)，612，355；1H NMR(DMSO-d6)δ9.55-8.60(m，10H)，8.00-7.55(m，6H)，4.95-4.35(m，6H)，3.10-2.80(m，6H)，2.80-2.35(m，12H)，1.85-1.35(m，18H)；ESI-MS m/z 1094.7[M+H]+。
實施例4
2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-三[2-(嗎啉-1-基)乙氧基]鋅(II)酞菁。C57H53N11O9Zn；綠色-藍(lán)色固體；UV-vis(DMF)λmax762，691，623，340，268，259；1H-NMR(DMSOd6)δ9.5-8.6(m，4H)，8.3-7.1(m，12H)，5.2-5.0(m，2H)，5.0-4.75(m，4H)，3.75-3.65(m，8H)，3.65-3.5(m，4H)，3.3-3.15(m，2H)，3.0-22.85(m，8H)，2.8-2.7(m，4H)；FAB-MS m/z 1101[M+H]+，987[M+C6H13NO]+。
實施例52-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9(10)，16(17)，23(24)-三[3-(二甲基氨基)苯氧基]鋅(II)酞菁。C63H47N11O6Zn；綠色-藍(lán)色固體；UV-vis(DMF)λmax(ε，M-1cm-1)678(1.4680×105)，632，611，355；1H NMR(DMSO-d6)δ9.35-8.90(m，4H)，8.85-8.50(m，3H)，7.95-7.48(m，7H)，7.52-7.25(m，5H)，6.95-6.55(m，9H)，3.10-2.80(m，18H)；FAB-MS m/z 1118[M+H]+。
實施例62-[(4-羥基羰基)苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(二甲基氨基)苯氧基]鋅(II)酞菁。C63H47N11O6Zn；綠色-藍(lán)色固體；UV-vis(DMF)λmax(ε，M-1cm-1)689(1.5064×105)，620，333；1H NMR(DMSO-d6)δ9.50-8.70(m，6H)，8.68-7.72(m，6H)，7.58-6.95(m，5H)，6.85-6.45(m，9H)，6.40-6.30(m，2H)，3.10-2.79(m，18H)；FAB-MS m/z 1118[M+H]+。
實施例72-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9(10)，16(17)，23(24)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物。C66H56I3N11O6Zn；綠色-藍(lán)色固體。
實施例82-[(4-羥基羰基)苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物。C66H56I3N11O6Zn；綠色-藍(lán)色固體；UV-vis(DMF)λmax689，620，333；ESI-MS m/z 388[M-3I-]3+。
實施例92-[(4-羥基羰基)苯氧基]鋅(II)酞菁。C39H21N8O3Zn；藍(lán)色固體；UV-vis(DMF)λmax669，606，343；1H NMR(DMSO-d6)δ9.32-9.14(m，7H)，8.77(寬s，1H)，8.26-8.18(m，8H)，7.96-7.90(dd，1H，J1＝8.67Hz，J2＝1.73Hz)，7.53(d，1H，J＝8.59Hz)。
實施例102-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[3-(二甲基氨基)苯氧基]鋅(II)酞菁。C87H74N14O9Zn；綠色-藍(lán)色固體；FAB-MS m/z 1524[M+]。
實施例112-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁六碘化物。C93H92I6N14O9Zn；綠色-藍(lán)色固體。
實施例122-[(4-磺酸根合)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[3-(二甲基氨基)苯氧基]鋅(II)酞菁。C86H74N14O10SZn；綠色-藍(lán)色固體；ESI-MS m/z 1562[(M+H)+]。
實施例132-[(4-磺酸根合)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁六碘化物。C92H92I6N14O10SZn；綠色-藍(lán)色固體。
實施例142-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[2-(N，N-二乙基氨基)乙硫基]鋅(II)酞菁。C75H98N14O3S6Zn，綠色-藍(lán)色固體。
實施例152-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[2-(N，N，N-三乙基銨)乙硫基]鋅(II)酞菁六碘化物。C81H116I6N14O3S6Zn；綠色-藍(lán)色固體。
實施例162-[(4-氨基苯甲酰氨基)-苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物。λmax668，607，345，藍(lán)色晶體。
實施例17N，N′-二甲基-N-2-(4-羥基(oxy)苯甲?；?-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁N′-生物素?；?1，2-二氨基乙烷三碘化物；λmax669，605，344，深藍(lán)色晶體。
實施例18N，N′-二甲基-N-2-(4-羥基(oxy)苯甲?；?鋅(II)酞菁N′-生物素?；?1，2-二氨基乙烷。綠色-藍(lán)色固體。
實施例19N，N′-二甲基-N-2-(4-羥基(oxy)苯甲酰氧基)-9，10，16，17，23，24-六[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁N′-生物素?；?1，2-二氨基乙烷六碘化物。綠色-藍(lán)色固體。
實施例202-[(4-溴甲基羰基)-苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物。
實施例21
2-[(4-馬來酰亞氨基甲基)-苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物。
實施例222-[(4-肼基甲基)-苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物；λmax669，605，344，藍(lán)色晶體。
實施例232-[(2-羥基)乙氧基]鋅(II)酞菁。C34H20N8O2Zn，綠色-藍(lán)色固體。
綴合物實施例24實施例9的化合物-牛血清白蛋白(BSA)將12.5和25當(dāng)量的實施例9化合物的琥珀酰亞氨基酯(預(yù)先通過將相應(yīng)的不對稱酸酐與N-羥基琥珀酰亞氨基酯反應(yīng)來制備)在DMSO中的溶液，緩慢添加至200μl 5mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中(pH＝8.5)，同時將形成的混懸液在室溫下輕微攪拌90分鐘。
通過凝膠過濾(Sephadex G25)從溶液中純化出綠色-藍(lán)色綴合產(chǎn)物，用PBS(pH＝7.2)洗脫，收集體積大約1ml的級分。通過分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度和每摩爾BSA中實施例9化合物的摩爾數(shù)，由此確定標(biāo)記比率。在實際的實驗條件下，所得的標(biāo)記比率在4.2和5.0之間。
實施例7的化合物-抗生物素蛋白將100μl 1.54mg/ml的實施例7化合物的琥珀酰亞氨基酯的DMSO溶液添加至2mg抗生物素蛋白(4mg/ml，于100mM PBS中，pH＝8.5)。將所形成的混懸液在4℃下輕微攪拌12小時，然后離心。純化步驟通過凝膠過濾來實施(Sephadex G25)，用100mM PBS洗脫(pH＝8.4)，收集有色級分，從中回收綴合產(chǎn)物。按前述實施例16中所述測得標(biāo)記比例為7。
按照類似方法制備以下綴合物實施例8的化合物-伴刀豆球蛋白A將100μl 1.5mg/ml的實施例8化合物的琥珀酰亞氨基酯的DMSO溶液緩慢添加至溶解于0.25ml 100mM磷酸緩沖液(pH8)中的2mg伴刀豆球蛋白A(Sigma)中。將所得的混懸液在4℃下于黑暗中輕微攪拌一夜。離心后將上清液通過在Sephadex G25上凝膠過濾進行純化，收集顯示特征性熒光的級分。用每摩爾蛋白質(zhì)中酞菁的摩爾數(shù)來表征此綴合物，結(jié)果測得該值的范圍為3至7之間。
實施例8的化合物-琥珀酰伴刀豆球蛋白A重復(fù)針對伴刀豆球蛋白A中所述的過程。結(jié)果測得比率的范圍為3至5。
實施例4的化合物-抗體使用實施例4的化合物標(biāo)記對人腱生蛋白(TN)的III型FN類的重復(fù)D單元具有特異性的單克隆抗體α-D(Balza等FEBS，332，39 1993)。
標(biāo)記過程用結(jié)合至瓊脂糖4b固定化抗原的單克隆抗體來完成，該抗體是含有III型FN類的重復(fù)單元B、C、D的重組TN中的代表。測得標(biāo)記比例Mab/實施例4的化合物為1∶5。
標(biāo)記后，通過在人成纖維細(xì)胞(GM6114)上的免疫組織化學(xué)法測定標(biāo)記抗體的結(jié)合特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未標(biāo)記的是相同的。通過上述免疫組織化學(xué)實驗證實，實施例4的化合物和所用的標(biāo)記方法沒有引起聚集的發(fā)生或蛋白質(zhì)變性，并且因此可以用于生產(chǎn)光活性物免疫綴合物。
在固相上標(biāo)記的實施例7的化合物-肽使用FMOC化學(xué)法和各種適宜于這種合成類型的樹脂來裝配肽。將實施例7的化合物通過如下描述偶聯(lián)至肽、支鏈肽或低聚物的N-末端首先通過用0.5摩爾當(dāng)量存在于DMF中的二環(huán)己基碳二亞胺在室溫下將其羧基活化過夜，或者首先形成混合酸酐或琥珀酰亞氨基酯。將活化的化合物(比N-末端氨基的摩爾量過量5倍)在暗處添加至肽樹脂中并且在室溫下放置24小時讓反應(yīng)進行。將實施例7的化合物-肽從樹脂上分裂出來，使用固相合成標(biāo)準(zhǔn)工藝進行后處理并根據(jù)需要用G10或G25和PBS pH7.2脫鹽。通過質(zhì)譜或氨基酸組成對綴合物進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與預(yù)期的數(shù)值一致。
在溶液中標(biāo)記的實施例12的化合物-肽將實施例12的化合物(針對硫醇的酞菁衍生物)在DMF中溶解，并且于暗處直接添加至從半胱氨酸延伸的肽、支鏈肽和低聚物在脫氣、氮氣凈化的PBS pH 8.1溶液中的溶液中。在室溫下放置24小時讓反應(yīng)進行，然后根據(jù)需要用G10或G25和PBS pH 7.2將實施例12的化合物-肽脫鹽。通過質(zhì)譜或氨基酸組成對綴合物進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與預(yù)期的數(shù)值一致。
殺生物活性使用培養(yǎng)6天的人成纖維細(xì)胞來評價非特異毒性的缺乏。將實施例4化合物的各種濃度的等分試樣添加至存在于DMEM 10％FCS中的細(xì)胞中。處理后，將細(xì)胞用紅光照射10分鐘(Intralux 4000，配有濾光片BP700/100，Chroma Technology Corp.)。在平行實驗中，將細(xì)胞用相同量的實施例4化合物處理，但是不提供光照。經(jīng)檢測，在高達(dá)40μM的實施例4化合物濃度時，與未處理-未照射的細(xì)胞相比，死亡率或形態(tài)都沒有區(qū)別。
在第二個實驗中，用綴合的mAb-實施例4化合物的幾份等分試樣，以相當(dāng)于最多40μM實施例4化合物的濃度，處理同樣存在于DMEM 10％FCS中的不相關(guān)的細(xì)胞。保溫培養(yǎng)后，最終將細(xì)胞用紅光照射10分鐘(Intralux 4000，配有濾光片BP700/100，Chroma Technology Corp.)，并且與經(jīng)過處理但未照射的細(xì)胞和未處理、未照射的細(xì)胞進行存活率和形態(tài)的比較。沒有發(fā)現(xiàn)區(qū)別。
這些實驗表明，在大大高于用PDT使活體形式失活所用的標(biāo)準(zhǔn)濃度下，實施例4的化合物本身或其mAb綴合物，對成纖維細(xì)胞或?qū)Σ幌嚓P(guān)的細(xì)胞都沒有毒性。
本發(fā)明化合物的有用性通過其抗各種微生物的活性得到進一步證明。以下實施例涉及抗白色念珠菌的活性。
圖1顯示了實施例7和8的化合物(在圖中分別用MRLP 090和MRLP091來表示)對白色念珠菌的光滅活作用。
治療性制劑前述的化合物可以用于表面性疾病的局部治療或者非腸道給藥后的治療。
含有本發(fā)明化合物的治療組合物包括脂質(zhì)體或微泡制劑、分散劑、軟膏劑、非腸道注射用溶液等等，并且包括皮膚用局部制劑。
非腸道用溶液通常，將可光活化的酞菁與附加的溶劑和輔劑一起使用，來制備適于靜脈內(nèi)注射用的溶液?？梢允褂枚喾N可與水和適宜表面活性劑相混溶的溶劑和共溶劑，來獲得非腸道應(yīng)用的溶液。這些溶劑中最重要的溶劑是乙醇、液體系列的聚乙二醇和丙二醇。更全面地說，包括二甲亞砜，乙醇，甘油，聚乙二醇300和400，丙二醇，山梨醇，聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，如月桂酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯和油酸酯，聚氧乙基化植物油，脫水山梨醇一棕櫚酸酯，2-吡咯烷酮，N-甲基吡咯烷，N-乙基吡咯烷和四氫糠醇。
其它添加劑對增強或保持化學(xué)穩(wěn)定性和生理學(xué)適宜性來說可以是必要的。其實例是抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體、緩沖劑和等滲劑。
局部用制劑可以將本發(fā)明的酞菁化合物配制在滲透性溶劑中或者配制成含有對于PDT是有效的足夠量的酞菁化合物的洗液、乳液、軟膏或凝膠的形式用于局部應(yīng)用。
適宜的滲透性溶劑是能夠增強酞菁化合物經(jīng)皮滲透性的物質(zhì)。具有這種特性的溶劑包括二甲亞砜、1-甲基-2-吡咯烷酮、氮卓酮和丙二醇。含有0-50wt％水的DMSO溶液是特別合意的。
脂質(zhì)體或微泡制劑脂質(zhì)體是在脂質(zhì)或高分子薄膜內(nèi)包封有液體的微泡；用于局部用和非腸道(可注射)用制劑的脂質(zhì)體的制備方法是本領(lǐng)域已知的。可以將本發(fā)明的具有親水性的酞菁化合物摻入脂質(zhì)體微泡中并且以此形式在局部和非腸道應(yīng)用中使用。
使用本發(fā)明酞菁化合物的光動力治療具有很多優(yōu)點。未激發(fā)態(tài)的酞菁化合物本身毒性很小。每個酞菁分子都可以被反復(fù)光活化并且每次活化都會導(dǎo)致細(xì)胞致死，即產(chǎn)生單線態(tài)分子氧或自由基。單線態(tài)氧的半衰期為可以使靶細(xì)胞受損，但不會使致命性的單線態(tài)氧向相鄰的健康組織細(xì)胞遷移。單線態(tài)氧分子會破壞細(xì)胞DNA、靶細(xì)胞壁中的化學(xué)鍵，或者毀壞細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，如線粒體，造成靶細(xì)胞的毀滅。當(dāng)酞菁化合物受到照射時，靶細(xì)胞組織的毀滅迅速開始，并且當(dāng)照射中止時馬上停止。
因此，使用本發(fā)明化合物的光動力治療是具選擇性的并且對健康細(xì)胞的毒性最小。所產(chǎn)生的不與相鄰分子迅速反應(yīng)的單線態(tài)氧分子會很快衰變。
各種光治療和照射方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且可以使用本發(fā)明的新酞菁化合物。醫(yī)生根據(jù)已知的光動力治療標(biāo)準(zhǔn)可以選擇治療的時間和持續(xù)時間以及照射治療的重復(fù)。酞菁化合物的劑量可以根據(jù)欲被摧毀的靶組織的大小和位置以及給藥的方法而有所不同。通常來說，劑量范圍為0.1-20mg酞菁化合物每千克體重，更優(yōu)選0.1-5.0mg/kg。
對于癌癥治療和感染性疾病的治療來說，通常在施用酞菁化合物之后不少于1小時并且不大于4天的時間開始照射。通常，在施用光動力治療劑后大約10小時至24小時便開始光治療。對于皮膚病應(yīng)用來說，如牛皮癬，照射治療可以在局部施用酞菁后立即開始或者最多12小時之后開始，對于感染性疾病或癌癥治療也是這樣。治療皮膚病的全身應(yīng)用是在系統(tǒng)給藥PDT劑后通常15至24小時開始進行照射。在光治療之后應(yīng)當(dāng)立即避免與非治療光源接觸，以便最大程度的減少光毒性?？梢越o患者使用適當(dāng)?shù)母采w物，來限制受光治療損害的區(qū)域。
適合PDT中所用的光源是本領(lǐng)域公知的，并且可以是與適宜濾光片相連的白色光源或設(shè)定成合適波長的激光。如上所述，優(yōu)選的波長是600至950nm，優(yōu)選約650至約750nm。施加給患病區(qū)域的光的總量可以根據(jù)所用的治療方法和損傷的位置而不同。通常來說，光的量在約50至1000Jcm-2的范圍內(nèi)，優(yōu)選100至350Jcm-2。
權(quán)利要求
1.下式(I)的金屬取代的非中心對稱型酞菁及其可藥用鹽 其中n是1、2或4；M選自Zn、Si(OR7)2和AlOR7，其中R7選自H、C1-15烷基；R選自-COOH、-SH、-OH、-NH2、-CO-CH2-Br、-SO2Cl、馬來酰亞胺、酰肼、苯酚、亞胺酸酯、生物素，其可能通過適宜的連接基與酞菁母核相結(jié)合，并且R1是H或者，當(dāng)n＝2并且兩個R1基團在第9、10、16、17、23、24位時，所說的兩個R1基團可以形成飽和或不飽和的雜環(huán)，其可能是取代的，該雜環(huán)可以含有最多兩個選自N、O、S的雜原子；或者R1由基團(X)pR2表示，其中X選自O(shè)、S、-NR5和-CH2-，并且R2是 其中Y選自C1-10烷基和苯基，其可能是取代的，或者它和與之相結(jié)合的基團Z一起形成飽和或不飽和的雜環(huán)，其可能是取代的，該雜環(huán)可以含有最多兩個選自N、O和S的雜原子；Z選自-N、-CH2N和-CONHCH2CH2N；R3和R4彼此相同或不同，選自C1-15烷基和苯基，或者和與之相結(jié)合的基團Z一起形成飽和或不飽和的雜環(huán)，其可能是取代的，該雜環(huán)可以含有最多兩個選自N、O和S的雜原子；R5和R6彼此相同或不同，選自H和C1-15烷基；m、n、p、w、t和u彼此獨立地是0或1；并且v是1至3的整數(shù)；前提條件是R在1或2位當(dāng)n＝1時，R1在以下位置8(11)、15(18)、22(25)或9(10)、16(17)、23(24)，當(dāng)n＝2時，R1在以下位置8、11、15、18、22、25或9、10、16、17、23、24。
2.權(quán)利要求1所述的金屬酞菁，其中M是Zn。
3.權(quán)利要求1所述的金屬酞菁，其中基團(X)pR2選自以下的基團
4.權(quán)利要求1所述的金屬酞菁，其由以下化合物來表示2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-{[9，10][16，17][23，24]-三苯并}鋅(II)酞菁；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9(10)，16(17)，23(24)-三[2-(嗎啉-1-基)乙氧基]鋅(II)酞菁；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-2(3)，9(10)，16(17)，23(24)-三[2-(哌啶-1-基)乙氧基]鋅(II)酞菁；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-1(4)，8(11)，15(18)，22(25)-三[2-(嗎啉-1-基)乙氧基]鋅(II)酞菁；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9(10)，16(17)，23(24)-三[3-(二甲基氨基)苯氧基]鋅(II)酞菁；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(二甲基氨基)苯氧基]鋅(II)酞菁；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9(10)，16(17)，23(24)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]鋅(II)酞菁；2-[(4-氨基苯甲酰氨基)-苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物；N，N′-二甲基-N-2-(4-羥基苯甲酰氧基)-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁N′-生物素?；?1，2-二氨基乙烷三碘化物；2-[(4-溴甲基羰基)-苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物；2-[(4-馬來酰亞氨基甲基)-苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物；2-[(4-肼基甲基)-苯氧基]-8(11)，15(18)，22(25)-三[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁三碘化物；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[3-(二甲基氨基)苯氧基]鋅(II)酞菁；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁六碘化物；2-[(4-磺酸根合)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[3-(二甲基氨基)苯氧基]鋅(II)酞菁；2-[(4-磺酸根合)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁六碘化物；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[2-(N，N-二乙基氨基)乙硫基]鋅(II)酞菁；2-[(4-羥基羰基)苯氧基]-9，10，16，17，23，24-六[2-(N，N，N-三乙基銨)乙硫基]鋅(II)酞菁六碘化物；N，N′-二甲基-N-2-(4-羥基苯甲?；?鋅(II)酞菁N′-生物素?；?1，2-二氨基乙烷；N，N′-二甲基-N-2-(4-羥基苯甲酰氧基)-9，10，16，17，23，24-六[3-(三甲基銨)苯氧基]鋅(II)酞菁N′-生物素?；?1，2-二氨基乙烷六碘化物；2-[(2-羥基)乙氧基]鋅(II)酞菁。
5.由權(quán)利要求1-4所述的化合物和選自氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、抗體、糖苷和適體的化合物組成的綴合物。
6.權(quán)利要求5所述的綴合物，其由以下化合物來表示實施例9的化合物-牛血清白蛋白(BSA)；實施例7的化合物-抗生物素蛋白；實施例8的化合物-伴刀豆球蛋白A；實施例8的化合物-琥珀酰伴刀豆球蛋白A；實施例4的化合物-單克隆抗體α-D。
7.權(quán)利要求1-6的金屬酞菁化合物及其綴合物用于制備光動力治療用藥物組合物的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中的藥物組合物是可用于局部給藥的形式。
9.權(quán)利要求7的用途，其中的藥物組合物是可用于非腸道給藥的形式。
10.權(quán)利要求1-6所述的金屬酞菁化合物及其綴合物用于血液和血液衍生物滅菌的用途。
11.權(quán)利要求1-6所述的金屬酞菁化合物及其綴合物作為體內(nèi)/體外診斷劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了酞菁類似物，其具有能夠?qū)⑻寂c載體分子連接的活性基團，本發(fā)明還描述了酞菁－載體綴合物形式的酞菁類似物，它們顯示出增強的光動力特性、紅移吸收特性，并且全都可用于光動力治療。光敏劑本身和光敏劑－載體綴合物是用于治療各種感染性疾病、體內(nèi)根除微生物以及以細(xì)胞過度增殖為特征的疾病、特別是腫瘤、牛皮癬、光化性角化病、粉瘤、動脈內(nèi)增生和前列腺增生的有用的化合物。上述化合物還可用于血液和血液衍生物滅菌和作為體內(nèi)/體外診斷劑使用。
文檔編號A61P43/00GK1633437SQ02806846
公開日2005年6月29日 申請日期2002年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月21日
發(fā)明者G·龍庫奇, D·代, M·P·德菲利皮斯, L·凡泰蒂, D·尼斯特里 申請人:L.摩爾特尼公司和阿立提兄弟貿(mào)易公司股份公司