專(zhuān)利名稱(chēng)：作為3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶抑制劑的桔皮提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制哺乳動(dòng)物中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的藥物組合物，該組合物包括有效量之作為活性成分的桔皮提取物以及藥物學(xué)上可接受的載體，本發(fā)明還涉及用于抑制HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物，該組合物包含有效量的桔皮提取物。
背景技術(shù)：
近些年來(lái)，冠狀心血管循環(huán)疾病，例如動(dòng)脈粥樣硬化和高膽固醇血癥，已逐漸成為主要的致死原因。已有報(bào)道稱(chēng)，血漿膽固醇濃度增高導(dǎo)致脂肪、巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞沉積在血管壁上，此等沉積則導(dǎo)致斑塊形成，并由此引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化(Ross,R.,Nature,362,801-809(1993))。降低血漿膽固醇濃度的方法之一是飲食料法，以降低膽固醇和脂質(zhì)的攝入。另一種方法是降低在肝臟中進(jìn)行的膽固醇的生物合成速率。已有報(bào)道稱(chēng)，高膽固醇血癥可通過(guò)抑制HMG-CoA還原酶并由此降低膽固醇的生物合成速率來(lái)有效地治療，所述HMG-CoA還原酶介導(dǎo)3,5-二羥基-3-甲基戊酸的合成，該化合物是甾醇或類(lèi)異戊二烯之生物合成中的中間體(Cardiovascular Pharmacology,William W.Parmley and Kanu Chatterjee Ed.,Wolfe Publishing,pages8.6-8.7,1994)。
因此，已進(jìn)行了許多努力來(lái)研制可以抑制HMG-CoA還原酶的藥物；其結(jié)果是已有幾種從Penicillium sp.和Aspergillus sp.得到的化合物進(jìn)入市場(chǎng)銷(xiāo)售。具體而言，Merck Co.,USA研制的Lovastatin和Simvastatin以及Sankyo Co.,Japan研制的Pravastatin已在市場(chǎng)上銷(xiāo)售(C.D.R.Dunn,Stroke:Trends,Treatment and Markets,SCRIPT Report,PJB Publications Ltd.,1995)。但是，這些藥物非常昂貴，而且已知長(zhǎng)期給藥會(huì)誘發(fā)肝臟中肌酸激酶增加的副作用。因此，仍有必要繼續(xù)研制價(jià)格低廉而且無(wú)毒性的HMG-CoA還原酶抑制劑。
桔皮提取物已被用作助消化的藥物。但是，尚沒(méi)有報(bào)道桔皮提取物具有HMG-CoA還原酶抑制劑的活性。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于抑制哺乳動(dòng)物中HMG-CoA還原酶活性的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于抑制哺乳動(dòng)物中HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，其提供一種用于抑制哺乳動(dòng)物中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶之活性的藥物組合物，該組合物包括有效量之作為活性成分的桔皮提取物以及藥物學(xué)上可接受的載體。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種用于抑制HMG-CoA還原酶活性的藥物組合物，該組合物包括作為活性成分的桔皮提取物以及藥物學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
柑桔屬植物可為柑桔、橙、檸檬、葡萄柚和枸桔(Poncirus trifoliata)。
桔皮提取物可通過(guò)任何常規(guī)方法使用醇或水來(lái)制備。例如，5-100升醇或水加至1kg干燥桔皮中，然后使混合物在5-80℃(溶劑為醇時(shí))或20-140℃(溶劑為水時(shí))靜置10分鐘-48小時(shí)。該提取過(guò)程可重復(fù)1-3次。例如通過(guò)真空來(lái)濃縮所得的提取物，以得到濃縮桔皮提取物。另外，桔皮提取物也可如下制備用氫氧化鈣溶液處理桔皮，加入鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至4.0-4.5，然后離心所得溶液，得到作為桔皮提取物的沉淀物黃酮類(lèi)似物(FDA Report No.FDA-8F-82/62,“Evaluation of health aspects of hesperidin,naringin and citrusbiolfavonoide extracts as food ingredient”,Natl.Technical InformationService PB 82-192931(1982))。
桔皮提取物在10mg/kg/天或更高的劑量時(shí)對(duì)HMG-CoA還原酶具有抑制作用，該抑制作用隨劑量而增高。
而且，盡管有強(qiáng)的效力，但桔皮提取物在鼠實(shí)驗(yàn)中幾乎沒(méi)有表現(xiàn)出毒性或促有絲分裂性。更具體而言，當(dāng)以1000mg/kg的劑量給鼠口服給藥時(shí)，桔皮提取物沒(méi)有產(chǎn)生毒性，對(duì)于50kg重的人來(lái)說(shuō)，上述劑量相當(dāng)于口服給藥50-100g桔皮提取物/kg體重。另外，桔皮提取物對(duì)肝功能沒(méi)有副作用。
可使用上述組合物根據(jù)任何常規(guī)方法來(lái)制備藥物制劑。在制備制劑時(shí)，活性成分優(yōu)選與載體混合或用載體稀釋?zhuān)蛘甙庠谀z囊、小藥囊或其他容器之形式的載體中。如果載體為稀釋劑，其可為固體、半固體或液體物質(zhì)，作為活性成分的載體、賦形劑或介質(zhì)。因此，制劑可為片劑、丸劑、粉末、小藥囊劑、甘香酒劑、混懸劑、乳劑、溶液、糖漿、氣霧劑、軟和硬明膠膠囊、無(wú)菌注射液、無(wú)菌包裝的粉末等劑型。
合適的載體、賦形劑和稀釋劑的例子是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹(shù)膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。藥物制劑可另外包括填料、抗附聚劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。本發(fā)明的組合物可用任何本領(lǐng)域已知的方法配制成在給藥于哺乳動(dòng)物后快速、持續(xù)或延遲釋放活性成分的制劑。
本發(fā)明的藥物制劑可通過(guò)各種途徑給藥，包括口服、透皮、皮下、靜脈和肌肉給藥。對(duì)于人，桔皮提取物的典型日劑量是約10-500mg/kg體重，優(yōu)選為20-100mg/kg，而且該劑量可以單劑量或多份劑量給藥。但是，實(shí)際給藥的活性成分的量應(yīng)根據(jù)各種相關(guān)因素來(lái)確定，所述因素包括待治療的疾病、所選擇的給藥途徑、每個(gè)患者的年齡、性別和體重、以及患者癥狀的嚴(yán)重程度；因此，上述劑量絕不是用于限制本發(fā)明的范圍。
另外，本發(fā)明的桔皮提取物可摻入在食品或飲料中，用于抑制HMG-CoA還原酶活性。因此，本發(fā)明還提供用于抑制HMG-CoA還原酶活性的食品或飲料組合物，該組合物包括有效量的桔皮提取物。在此情況下，食品或飲料中的桔皮提取物含量可在0.1-50％之間。
如上所述，桔皮提取物可用作有效抑制HMG-CoA還原酶活性的非毒性藥物。
以下實(shí)施例用于進(jìn)一步闡明本發(fā)明，而不是限制其范圍。
另外，以下固體混合物中之固體、液體中之液體、以及液體中之固體的百分比分別是以wt/wt、vol/vol和wt/vol計(jì)算，而且所有的反應(yīng)都是在室溫下進(jìn)行，除非另有說(shuō)明。實(shí)施例1桔皮提取物的制備和分析在室溫下干燥桔皮，然后在6.7kg的干燥桔皮中加入80升的95％乙醇。該混合物在室溫下靜置24小時(shí)，然后過(guò)濾得到提取液和固體殘?jiān)?。該固體殘?jiān)孟嗤姆椒ㄔ俦惶崛∫淮巍：喜⑺玫奶崛∫?，使用大容量蒸發(fā)器(EYELA旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器N-11)在減壓下濃縮，得到濃縮提取物(d=1.3g/ml)。
用DMSO/甲醇混合物(1∶1)稀釋該濃縮提取物至濃度為10mg/ml。將100μl所得溶液注入高效液相色譜(HPLC)中，該色譜使用Phenomenex Prodigy柱(5μO(píng)DS(3)100，4.6×250mm)，所述色譜柱用0.01M磷酸/甲醇(70∶30)混合物預(yù)平衡。樣品用0.01M磷酸/甲醇(70∶30)混合物以0.6ml/min的流速洗脫55分鐘，其中逐漸增加甲醇的濃度至45％。使用100μl(1mg/ml)橙皮苷和柚皮苷(SigmaChemical Co.,USA)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。在280nm下檢測(cè)洗脫液，發(fā)現(xiàn)1kg的桔皮提取物包含5950mg橙皮苷和280mg柚皮苷。
進(jìn)一步根據(jù)常規(guī)方法鑒定桔皮提取物的成分。例如，用干法在105℃下測(cè)定水含量；用Kjeldahl法測(cè)定粗蛋白；用Soxhlet法測(cè)定粗脂質(zhì)；用Bertrand法測(cè)定游離糖；在550-600℃下燃燒測(cè)定粗灰份；以及用HPLC法測(cè)定橙皮苷和柚皮苷。結(jié)果見(jiàn)下表Ⅰ。
表Ⅰ
實(shí)施例2向動(dòng)物給藥桔皮提取物隨機(jī)將體重為90-110g的20只4周齡Sprague-Dawley小鼠(Taihanlaboratory animal center,Korea)平均分成2個(gè)組。兩個(gè)組的小鼠分別用兩種不同的高膽固醇食物喂養(yǎng)，即包含1％膽固醇的AIN-76實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼料(ICN Biochemicals,Cleveland,OH,USA)(對(duì)照組)，以及1％膽固醇加16.7％桔皮提取物。兩個(gè)組所用飼料的成分見(jiàn)下表Ⅱ。
表Ⅱ
*1從TEKLAD Premier Co.(Madison,WI,USA)購(gòu)得*20.1％橙皮苷等價(jià)物無(wú)限制地用具體飼料和水喂養(yǎng)小鼠共6周，每日記錄攝取量，然后每7天稱(chēng)重，并分析記錄數(shù)據(jù)。所有小鼠都顯示正常的生長(zhǎng)速度，而且兩個(gè)組之間在食物攝取量和體重增加方面沒(méi)有顯著差異。實(shí)施例3血漿中總膽固醇、HDL-膽固醇和中性脂質(zhì)含量的測(cè)定以下測(cè)定向小鼠給藥桔皮提取物對(duì)血漿膽固醇和中性脂質(zhì)含量的影響。
從上兩個(gè)組的小鼠中采取血樣，并用包含葡萄糖硫酸酯的HDL-膽固醇試劑(Sigma Chemical Co.,Cat.No.352-2)從中分離血漿HDL成分。用Sigma Diagnostic Kit Cat.No.352-100(Sigma Chemical Co.,USA)測(cè)定總膽固醇和HDL-膽固醇濃度(Allain et al.,Clin.Chem.,20,470-475(1974))。用Sigma Diagnostic Kit Cat.No.339-50(SigmaChemical Co.,USA)測(cè)定中性脂質(zhì)濃度(Bucolo,G.And David,H.,Clin.Chem.,19,476-482(1973))。結(jié)果見(jiàn)表Ⅲ，其中，與對(duì)照組小鼠相比，桔皮提取物飼養(yǎng)組中小鼠的總血漿膽固醇濃度下降35％。
表Ⅲ
TG甘油三酯實(shí)施例4桔皮提取物在HMG-CoA抑制中的活性(步驟1)制備微粒體為確定用桔皮提取物飼養(yǎng)小鼠對(duì)HMG-CoA還原酶活性的作用，從肝組織中制備微粒體作為酶源，所述還原酶是調(diào)節(jié)肝臟中膽固醇之生物合成的酶。
首先，將上述兩組小鼠斷頭處死，取出肝臟，并立即放置在冰冷卻的勻漿介質(zhì)(50mM KH2PO4(pH7.0),0.2M蔗糖，2mM二硫蘇糖醇(DTT))中。在勻漿介質(zhì)(2ml介質(zhì)/g肝臟)中用Waring混合器(三沖程的Potter-Elvehjem型玻璃勻漿器，帶有一個(gè)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的Teflon研杵)使肝臟勻漿15秒。在15000×g下離心勻漿10分鐘，由此得到的上清液在100000×g下離心75分鐘，得到微粒體沉淀，然后將該沉淀重新懸浮在包含50mM EDTA的勻漿介質(zhì)中，然后在100000×g下離心60分鐘。用包含微粒體的上清液作為酶源。(步驟2)HMG-CoA還原酶實(shí)驗(yàn)如下根據(jù)Shapiro等人的方法(Biochemical et Biophysica Acta,370,369-377(1974))使用[14C]HMG-CoA測(cè)定HMG-CoA還原酶的活性。
在37℃下活化含微粒體之上清液(步驟1中得到的)中的酶30分鐘。在反應(yīng)試管中加入20μl的HMG-CoA還原酶實(shí)驗(yàn)緩沖液(0.25MKH2PO4(pH7.0),8.75mM EDTA,25mM DTT,0.45MKCl和0.25mg/mlBSA)、5μl的50mM NADPH、5μl的[14C]HMG-CoA(0.05μCi/試管，最終濃度120μM)和10μl之經(jīng)活化的微粒體酶(0.03-0.04mg),然后混合物在37℃下培育該混合物30分鐘。在該混合物中加入10μl的6M鹽酸，由此使反應(yīng)停止，然后在37℃下培育該混合物15分鐘，使產(chǎn)物(甲羥戊酸)完全內(nèi)酯化。在10000×g下離心1分鐘，由此除去沉淀物，然后將上清液用在硅膠60G TLC板(Altech,Inc.,Newark,USA)上，并用苯∶丙酮(1∶1,v/v)展開(kāi)。用一次性載玻片刮下Rf值在0.65-0.75之間的區(qū)域，并用1450Microbeta液體閃爍計(jì)數(shù)器(Wallacoy,Finland)進(jìn)行放射活性實(shí)驗(yàn)。以pmol合成的甲羥戊酸/分鐘/mg蛋白計(jì)算酶活性。結(jié)果見(jiàn)表Ⅳ。
表Ⅳ
從表Ⅳ的結(jié)果可以看出，對(duì)照組小鼠具有相對(duì)較高的HMG-CoA還原酶活性，而桔皮提取物組小鼠中觀察到的HMG-CoA活性則低于對(duì)照組34％。實(shí)施例5口服給藥桔皮提取物的毒性在22±1℃的溫度、55±5％的濕度和光照周期12L/12D的條件下，飼養(yǎng)7-8周齡、無(wú)特定病原的ICR雌鼠(8只)和雄鼠(8只)，雌鼠重量在25-29g，雄鼠重量在34-38g。將飼料(Cheiljedang Co.，鼠飼料)和水消毒，然后喂給小鼠。
將桔皮提取物溶解在0.5％Tween80中，至濃度為100mg/ml，然后將該溶液口服給藥至小鼠，用量為0.2ml/20g小鼠體重。給藥所述溶液后，按以下程序觀察小鼠10天并記錄副作用或死亡現(xiàn)象給藥后1、4、8和12小時(shí)，以后則每隔12小時(shí)觀察。每天記錄小鼠體重變化，以檢查桔皮提取物的作用。另外，在第10天時(shí)，將小鼠處死，并肉眼檢查內(nèi)部器官。
在第10天時(shí)所有小鼠都存活，而且1000mg/kg劑量的桔皮提取物沒(méi)有毒性。尸檢結(jié)果是，小鼠沒(méi)有形成任何病理非正常性，而且在10天的檢查期間沒(méi)有觀察到體重減輕。因此，可得出以下結(jié)論桔皮提取物在口服給藥動(dòng)物時(shí)沒(méi)有毒性。
以下制劑實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而絕不是限制本發(fā)明的范圍。制劑實(shí)施例使用以下成分制備硬明膠膠囊量(mg/膠囊)活性成分(桔皮提取物)20干燥淀粉 160硬脂酸鎂20總計(jì) 200mg雖然已參考上述具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)還可進(jìn)行各種改進(jìn)和變化，而本發(fā)明的范圍為以下權(quán)利要求書(shū)所限定。
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動(dòng)物中抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的藥物組合物，其包括有效量之作為活性成分的桔皮提取物以及藥物學(xué)上可接受的載體。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述哺乳動(dòng)物是人。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中，所述柑桔屬植物是柑桔、橙、檸檬、葡萄柚和枸桔。
4.如權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其中，桔皮提取物的有效量為10-500mg/kg體重/天。
5.一種用于抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的食品組合物，其包括有效量的桔皮提取物。
6.一種用于抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶活性的飲料組合物，其包括有效量的桔皮提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于抑制哺乳動(dòng)物中3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶活性的藥物組合物,其包括有效量之作為活性成分的桔皮提取物以及藥物學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涉及用于抑制3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶活性的食品或飲料組合物,其包括有效量的桔皮提取物。
文檔編號(hào)A61P3/06GK1233182SQ97198801
公開(kāi)日1999年10月27日 申請(qǐng)日期1997年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月14日
發(fā)明者卜成海, 孫光熙, 鄭泰淑, 權(quán)柄穆, 金永國(guó), 崔度一, 金成郁, 裴基煥, 樸鏞福, 崔明淑, 黃仁奎, 文錫植, 權(quán)容國(guó), 安貞娥, 李恩淑 申請(qǐng)人:韓國(guó)科學(xué)技術(shù)研究院