專利名稱：花青素提取物抑制PKC-α和NF-κB活化中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花青素提取物的新應(yīng)用，具體是指花青素提取物在以rac-α和 NF-K B為靶標的臨床疾病治療中的新應(yīng)用，更具體是指花青素提取物在細胞中抑制 PKC- α和NF- κ B活化中的應(yīng)用，以及在抑制腫瘤細胞的遷移中的應(yīng)用，還涉及花青素提取物在研制治療腫瘤侵潤和轉(zhuǎn)移，以及與HiC- α和/或NF- κ B相關(guān)的新的適應(yīng)癥的原創(chuàng)性藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
花青素提取物的抗癌功效國內(nèi)外有許多研究報道，花青素有非常強大的抗氧化和清除自由基的能力，據(jù)報道其在體內(nèi)抗氧化能力是％的50倍，&的20倍(LV LS, Cao D.Study on the antioxidant activity of oligermeric proanthocyanidins. Food Sci Tech, 2000,4 :41-42)；具有多種藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、抗輻射、保護心血管系統(tǒng)、抗衰老等(DebasisBagchi, Manashi Bagchi, Sidney J Stohs, et al. Free radicals and grape seed proanthocyanidinextract importance in human health and disease prevention. Toxicology, 2000,148 :187-197)。也有研究發(fā)現(xiàn)花青素能明顯抑制 NCI-H460 細胞的增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制裸鼠腫瘤的生長(高愛霞，羅巨東，吳慶婷，李厚達，薛智謀.花青素能明顯抑制NCI-H460細胞.實驗動物與比較醫(yī)學(xué)，2008，2 (1)85-89)。花青素專利申請多以提純技術(shù)為主，有防治老年癡呆藥物用途、防治糖尿病及血管并發(fā)癥和治療結(jié)腸炎等功能的專利申請O00510042958.8《原花青素在制備治療結(jié)腸炎藥物的新用途》；200710061216. 9《原花青素B2在制備防治糖尿病及血管并發(fā)癥藥物的應(yīng)用》； 200710037280. 3《原花青素類化合物用于制備防治幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的藥物和保健食品》)°蛋白激酶C-α (protein kinase C-α ,PKC-α)是PKC家族成員之一，通常處于失活狀態(tài)，在胞質(zhì)中豐富表達，PKC-α的核轉(zhuǎn)位可能是細胞凋亡調(diào)控機制中的一個重要事件， 能夠使眾多蛋白質(zhì)中的絲氨酸和蘇氨酸發(fā)生磷酸化而發(fā)揮作用。因此，PKC-α的活化不僅與正常細胞和異常細胞的生長、分化、凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)，更在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、 轉(zhuǎn)移和多藥耐藥等方面發(fā)揮重要作用。PKC-α與腫瘤細胞的增殖、細胞周期調(diào)控及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。并且H(C-a參與了多種疾病如心血管疾病、腫瘤、自身免疫病等的發(fā)生發(fā)展，是這些疾病治療的重要藥物靶標之一。在心肌肥厚與心衰期，大鼠心肌中可檢測HiC-a高表達的磷酸化水平增加；另夕卜，在異丙腎上腺素與苯腎上腺素引起心肌肥厚，HiC-a表達亦增加。研究表明H(C-a 在包括腸細胞、胰腺細胞和乳腺細胞等多種細胞中均表現(xiàn)出抗增殖作用。通過HiC-α對低分化的肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力的調(diào)節(jié)[Frankel LB, Lykkesfeldt AE, Hansen JB, Stenvang J. Protein Kinase C—alpha is a marker for antiestrogen resistance and is involved in thegrowth of tamoxifen resistant human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat. 2007,104(2) :165-79]。PKC 不僅在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力中發(fā)揮重要作用，在很多新的適應(yīng)癥中PKC均發(fā)揮重要的作用，例如腦缺血(CHEN Qun, ZENG Yin—Ming,WANG Iian—Guo. Protective role of breviscarpin on brain tissue and its effect on immunoreactivity of microtubulemotor protein. Chinese Pharmacological Bulletin. 2001,17(1) :117-8)、糖尿病(左祥生.DAG-PKC信號傳導(dǎo)通路與糖尿病血管并發(fā)癥.國外醫(yī)學(xué)內(nèi)分泌學(xué)分冊，2000，20(3) :126-132)、心肌血管病變(M. C. Schaub, MA. Hefti, BA. Harder. Various hypertrophiestimuli induce distinct phenotypes in cardiomycytes. J Mol Med 1997，75 :901-920)、阿爾茲海默病(吳哲，吳曉芝，孫黎光，姚麗.阿爾茨海默病大鼠海馬PKC和⑶NF的變化.中國老年學(xué)雜志，2004，7 04) =630-638) 等。目前已知的PKC抑制劑主要包括G06976、Staur0Sp0rine，而這兩種抑制劑主要是對細胞的侵襲作用和細胞增殖起作用。NF-κ B是一種能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，它在白血病等非實體瘤中可伴隨染色體擴增或易位發(fā)生遺傳學(xué)改變，而在肺癌等實體瘤中則主要由于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常導(dǎo)致其活性改變。NF-K B還可以調(diào)節(jié)炎癥和自身免疫反應(yīng)。其活化過程與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，如休克、腎小球腎炎、自身免疫型關(guān)節(jié)炎、肺纖維化、動脈硬化及艾滋病等。因此，NF-K B及其活化過程可以成為許多疾病治療的靶標。一些癌蛋白或異常的信號分子可激活NF- κ B,通過NF- κ B通路上調(diào)一系列抗凋亡蛋白的表達或抑制JNK的活性，抑制凋亡、促進轉(zhuǎn)化，并可造成腫瘤細胞對放化療誘導(dǎo)凋亡的抵抗性。故在臨床上將NF-K B抑制劑和放化療配合應(yīng)用，降低耐藥性，在腫瘤治療方面有著很好的應(yīng)用前景。 NF-κΒ的激活可調(diào)控很多基因的表達，CyclinDl也處于其下游，因此NF-κ B對細胞周期禾口生長也有一定景i響(Ismail HA, Lessard L, Mesmasson AM. Expression of NF-κ B in prostate cancerlymphnode metastases. J Prostate. 2004, 58(3) :308-313)。NF-κ B 激活是腫瘤發(fā)展過程中出現(xiàn)較早的改變，尤其是在與炎癥相關(guān)的腫瘤中，NF-K B在炎癥時期就已經(jīng)激活了，體外實驗顯示NF-K B的活性可使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，但在體內(nèi)實驗中這種轉(zhuǎn)化作用要等到腫瘤發(fā)展的晚期才有所表現(xiàn)。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中NF-K B的作用更是不容忽視，它的激活可上調(diào)VEGF、MMPs, uPA、CXCR4等的表達，促進腫瘤血管形成，促進腫瘤細胞的遷移能力，降解周圍基質(zhì)，促進上皮間變，對腫瘤的轉(zhuǎn)移及再生長起促進作用(Helbig G， ChristophersonKff. NF- κ B promotes breast cancer cell miration and metastasis by inducing the expression ofthe chemokine receptor CXCR4J J. Biol Chem. 2003, 278 (24) :21631-21638)。因此通過抑制NF- κ B活性，可阻礙腫瘤血管形成，從而抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移這可能成為腫瘤治療的一項新策略。PKC-α和NF-K B分別是重要的細胞信號分子和炎性介質(zhì)表達的主要轉(zhuǎn)錄因子， 參與細胞的多種活動，Ogata等發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮細胞中超氧化物可通過激活PKC而導(dǎo)致 NF-k B 活化并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)(Ogata N, Yamamoto H, Kugiyama K. Involvement of proteinkinase C in superoxide anion-induced activation of nuclear factor-kappa B in human endothelialcells. Cardiovase Res. 2000，45 :513-521) ；Newton 等發(fā)現(xiàn) PKC 激動劑PMA可使人肺癌細胞系A(chǔ)549的NF- κ B激活(Ogata N, Yamamoto H，Kugiyama K.Involvement of protein kinaseC in superoxide anion-induced activation of nuclear factor-kappa B in human endothelial cells. Cardiovase Res. 2000,45 513-521)。以往研究顯示，PKC主要作用的靶蛋白是I κ B和MAP激酶，磷酸化的I κ B迅速分解并釋放一種小分子蛋白NF-K B，該蛋白為許多細胞的核轉(zhuǎn)錄因子。PKC活性的高低直接影響其下游物質(zhì)NF- κ B的活性。因此PKC是NF- κ B的一種上游激酶。通過參與I κ B的磷酸化，使I κ B與NF- κ B解離而使NF- κ B激活。SignoreUi等發(fā)現(xiàn)，在MCF-7乳癌細胞中， PKC njil 1 NF- κ B ygfi (Newton R, Adcock IM, Barnes PJ. Superinduction of NF-kappa B by actinomycin D and cycloheximide in epithelial cells. BiochemBiophys Res Commun. 1996,218 :518-523)。有研究發(fā)現(xiàn)，PKC和NF-κ B的異常激活在腦血管痙攣的形成中有重要意義，PKC抑制劑能顯著改善實驗性腦血管痙攣的程度及其炎性改變，其作用可能是通過同時抑制PKC及NF- κ B實現(xiàn)的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于首次研究提出花青素提取物對腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵性分子之一的HiC- α和NF- κ B活性的影響，提供花青素提取物的一種新應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供花青素提取物在抑制腫瘤細胞遷移中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于為研制治療腫瘤侵潤和轉(zhuǎn)移的原創(chuàng)性藥物提供一定的理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。本發(fā)明的另一目的在于提供花青素提取物在制備治療與H(C- α和/或NF- K B相關(guān)的新的適應(yīng)癥的藥物中的應(yīng)用。腫瘤細胞的異常增殖和惡化常伴隨著H(C-α的過度表達?；ㄇ嗨啬芊裢ㄟ^抑制胞內(nèi)H(C-a表達來實現(xiàn)其抗腫瘤的活性是本發(fā)明關(guān)注的重點。本發(fā)明利用國家人類基因組北方研究中心構(gòu)建的HiC-a -GFP融合質(zhì)粒，用不同濃度的花青素提取物處理轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞，通過在熒光顯微鏡下觀測在PMA激活H(C- α -GFP后觀測熒光轉(zhuǎn)位的變化，并用 Western-blot驗證上述結(jié)果。最后利用熒光素酶報告基因pNF- κ B-Iuc表達質(zhì)粒檢測胞內(nèi) NF- κ B活性變化，并以此反映花青素提取物對NF- κ B通路的影響。本發(fā)明還通過細胞劃痕模擬腫瘤細胞的遷移，并加入花青素提取物對比實驗組與正常組細胞遷移能力的變化并計算出細胞遷移率。通過實驗，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)所述花青素提取物對I3KC- α和NF- κ B活性的影響是指抑制其活化，并且顯示其對腫瘤細胞遷移能力的抑制。本發(fā)明提供了花青素提取物的一種新應(yīng)用，具體是指花青素提取物在以H(C-a 和NF-κ B為靶標的臨床疾病治療中的新應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，所述應(yīng)用為花青素提取物抑制I3KC- α和/或NF- κ B的活化中的應(yīng)用。并且，本發(fā)明還基于花青素提取物對腫瘤細胞的遷移能力有抑制作用，而提供了花青素提取物在抑制腫瘤遷移中的應(yīng)用。更具體地，其中所述抑制腫瘤遷移是通過抑制HiC-α的活化而實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，所述腫瘤為I3KC-Ci高表達的實體瘤。包括腎癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、 卵巢癌、宮頸癌、胃癌或胰腺癌。本發(fā)明還提供了花青素提取物在研制治療腫瘤侵潤和轉(zhuǎn)移的原創(chuàng)性藥物中的應(yīng)用，具體是為研制治療腫瘤侵潤和轉(zhuǎn)移的原創(chuàng)性藥物提供理論基礎(chǔ)和部分實驗依據(jù)。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，所述藥物能夠治療腫瘤，具體的說，所述藥物是是通過抑制腫瘤細胞中I3KC- α和/或NF- K B的活化或是抑制腫瘤細胞的遷移能力對腫瘤起到治療作用。能夠利用本發(fā)明的花青素提取物來研制抑制腫瘤細胞生長原創(chuàng)性新藥的腫瘤細胞優(yōu)選為I3KC-Ci高表達的實體瘤，包括腎癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、 宮頸癌、胃癌或胰腺癌等。本發(fā)明還提供了花青素提取物在與H(C- α和/或NF- K B相關(guān)的新的適應(yīng)癥中的應(yīng)用；具體是指花青素提取物在制備治療與HiC- α和/或NF- κ B相關(guān)的新的適應(yīng)癥的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述與I3KC-α和/或NF-κ B相關(guān)的新的適應(yīng)癥為腦缺血、糖尿病、 心肌血管病變、阿爾茲海默病、肝硬化或動脈粥樣硬化。在本發(fā)明的具體實施方案中，本發(fā)明所用的所述花青素提取物為篤斯越桔花青素提取物，但不限于從篤斯越桔提取的花青素。綜上所述，本發(fā)明首次提出了花青素提取物對疾病靶標HiC- α及NF- κ B活化的抑制作用，提示花青素可能在自身免疫疾病治療中得到應(yīng)用。另外，通過細胞劃痕模擬細胞遷移實驗，也首次證明花青素對腫瘤細胞的遷移有明顯的抑制作用，發(fā)現(xiàn)花青素提取物在抗腫瘤轉(zhuǎn)移上可能會起到更好的療效。這些可以為花青素提取物的綜合利用提供一些依據(jù)，具有重要的理論意義和實用價值。例如，針對本發(fā)明開發(fā)出新型的I3KC-α抑制劑，將對相關(guān)疾病的臨床治療起到深遠的意義。


圖1顯示不同濃度花青素提取物對I3KC- α活化的抑制作用；圖2顯示花青素提取物對過表達HiC-α蛋白表達的抑制作用；圖3顯示花青素提取物對內(nèi)源性HiC-α蛋白表達的抑制作用；圖4顯示花青素提取物對NF- κ B活化的抑制作用；圖5顯示花青素提取物對Η520內(nèi)源I3KC- α的mRNA水平的抑制；圖6顯示花青素提取物對H520內(nèi)源性I3KC- α的蛋白水平的抑制；圖7顯示花青素提取物對Η520細胞遷移能力的抑制作用。
具體實施例方式本發(fā)明考察了花青素提取物對轉(zhuǎn)染H(C- α -GFP融合質(zhì)粒后的ΗΕΚ293Τ的影響，并用熒光顯微鏡進行拍照?？梢杂^察到BBAE可以明顯抑制H(C-α-GFP的活化(請參見實施例1以及圖1所示)。進一步的蛋白免疫印記結(jié)果表明花青素提取物對過表達和內(nèi)源性的 PKC-α的蛋白表達及磷酸化均有明顯的抑制作用(請參見實施例2及圖2、圖3所示)。本發(fā)明還考察了花青素提取物對NF-K B通路活化的抑制作用。其中將 pNF- κ B-Luc 轉(zhuǎn)染 HEI^93T 細胞，同時共轉(zhuǎn)染內(nèi)參質(zhì)粒 pRL_TK_LUC (thymidine kinase romoter-Renillaluciferase)以便歸一化數(shù)據(jù)，消除細胞的存活情況以及細胞的轉(zhuǎn)染效率對實驗造成的誤差，增加數(shù)據(jù)的可靠性。轉(zhuǎn)染后6小時，分別用不同終濃度的花青素提取物 20 μ g/ml、40 μ g/ml、80 μ g/ml、160 μ g/ml、320 μ g/ml、640 μ g/ml 處理并繼續(xù)孵育 24 小時?？梢杂^察到花青素提取物明顯抑制NF- κ B通路的活化(請參見實施例3及圖4所示)。本發(fā)明中還采用腫瘤細胞系H520，觀察了花青素提取物對內(nèi)源H(C-a的mRNA 水平的影響。進一步的蛋白免疫印記結(jié)果表明在H520細胞系中花青素提取物對內(nèi)源性 PKC-α的mRNA及蛋白表達量均有明顯的抑制作用(請參見實施例4及圖5、圖6所示)。本發(fā)明中還采用腫瘤細胞系H520，觀察花青素提取物對其遷移能力的影響。結(jié)果表明花青素提取物對細胞遷移能力出現(xiàn)明顯的抑制作用(請參見實施例5及圖7所示)。本發(fā)明中的各種質(zhì)?？梢酝ㄟ^購買或是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法來制備。例如，PCR可擴增出目的片段，利用分子克隆技術(shù)將其構(gòu)建到載體上。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)花青素提取物可以抑制I3KC-α和NF-κ B基因的活化，并且抑制腫瘤細胞的遷移。本發(fā)明的實施例證明了這種抑制作用，因而花青素提取物可以抑制I3KC-Ci高表達的實體瘤，例如腎癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌和胰腺癌。由于本發(fā)明花青素提取物可以抑制H(C-a和NF-K B基因的活性，并抑制腫瘤細胞的遷移，因此可以利用花青素提取物研制治療腫瘤侵潤和轉(zhuǎn)移的原創(chuàng)性新藥，為研制治療腫瘤侵潤和轉(zhuǎn)移的原創(chuàng)性藥物提供理論基礎(chǔ)和部分實驗依據(jù)。同時本發(fā)明提供了花青素提取物在其它HiC- α和/或NF- κ B相關(guān)新的適應(yīng)癥中的應(yīng)用，具體是指花青素提取物在制備治療與I3KC- α和/或NF- κ B相關(guān)的新的適應(yīng)癥的藥物中的應(yīng)用，所述與HiC- α和/ 或NF-κ B相關(guān)的新的適應(yīng)癥尤其包括腦缺血、糖尿病、心肌血管病變、阿爾茲海默病、肝硬化、動脈粥樣硬化等。所述藥物是通過抑制HiC-α和/或NF-κ B的活化或是抑制腫瘤細胞遷移，對腫瘤或是與I3KC-Ci和/或NF-κ B相關(guān)的新的適應(yīng)癥起到治療作用。下面結(jié)合具體實施例進一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)條件如 《分子克隆實驗指南》(2002年第三版[美]薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。實施例中未標明來源的試劑和材料均可商購獲得。以下實施例中所用的花青素提取物購自大興安嶺華野生物工程有限公司，為篤斯越桔(Vaccinium uliginosum L)花青素提取物(Bog bilberry anthocyanin extract, BBAE)。我國越桔資源豐富，其果實富含多種營養(yǎng)成份，其中每IOOg篤斯越桔鮮果中花青素含量高達約34;3mg。本發(fā)明所用到的篤斯越桔花青素提取物BBAE的成分主要包括多酚、 花青素、蛋白質(zhì)、糖、油脂和水分，具體含量分析請參見下表。其中，總蛋白質(zhì)含量測定用 Bradford法，總糖含量測定用蒽酮硫酸法糖類遇濃硫酸脫水生成糠醛或其衍生物，可與蒽酮試劑縮合產(chǎn)生顏色物質(zhì)，反應(yīng)后溶液呈藍綠色，于620nm處有最大吸收值，顯色與多糖含量呈線性關(guān)系。多酚含量測定采用i^olin-Ciocalteu比色法。篤斯越桔花青素提取物BBAE樣品中各組分含量
_ 成分多酚花青素總糖I蛋白質(zhì)I油脂水分
“含量(mg/g 駕斯越 616.6 ±16.9 178.0 ±3.3 37.6 ± 0.7 10.9 ±3.0 15.1 ± 1.3 34.7 ±3.9
桔花青素提取物)實施例1、花青素提取物(BBAE)對I3KC-α活化的影響ΗΕΚ293Τ細胞(購自美國ATCC)常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10 %胎牛血清(HyClone， SH30084. 03)的 DMEM 培養(yǎng)基(HyClone, SH30022. 01Β)中，37°C，5% CO2 孵箱中培養(yǎng)。按照 1. 1 X IO6細胞/ml的密度，接種于96孔板，每孔100 μ 1，置于孵箱培養(yǎng)18小時 24小時， 使細胞密度達到40% 60%，以備轉(zhuǎn)染。按照說明書，使用Vigoi^ect陽離子轉(zhuǎn)染試劑(威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司)將IOOng HiC-α -GFP (利用現(xiàn)有分子克隆技術(shù)(參考《分子克隆實驗指南》)將HiC-a基因克隆到pEGFP載體上，成功構(gòu)建了 H(C-a-GFP融合質(zhì)粒)轉(zhuǎn)入HEK293T細胞。培養(yǎng)他后，分別加入500ng PMA，24h后在熒光顯微鏡下觀察 PKC- α -GFP發(fā)生轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。此時分別加入20μ g/ml、40y g/ml、80y g/ml、160y g/ml的花青素提取物BBAE (將花青素提取物BBAE溶于生理鹽水中得到花青素提取物水溶液，各濃度以溶液中的花青素提取物BBAE含量計)處理細胞并用PKC抑制劑bisindolylmaleimide GF 109203X作為陽性對照。培養(yǎng)M小時后用熒光顯微鏡觀測熒光轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果參見圖1 所示(圖中的 A 對照；B :20 μ g/ml BBAE ；C :40 μ g/ml BBAE ； D 80 μ g/ml BBAE ；E 160 μ g/ml BBAE)，可以看出，花青素提取物在40 μ g/ml時開始對 PKC- α活化轉(zhuǎn)位有抑制作用，這種抑制作用隨著濃度升高而更加明顯，且通過觀測明場細胞狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞無明顯減少，表明對轉(zhuǎn)位的抑制作用并非由細胞減少造成。實施例2、花青素提取物對過表達及內(nèi)源性H(C-α蛋白表達及磷酸化的影響免疫印記檢測ΗΕΚ293Τ細胞內(nèi)H(C-a總蛋白和磷酸化蛋白的表達量。根據(jù)培養(yǎng)要求按轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將6 μ g PKC-a (構(gòu)建在pEGFP載體中)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入6孔板的一個孔HEK293T細胞中，然后用終濃度分別為40 μ g/ml、80 μ g/ml、160 μ g/ml、320 μ g/ml的花青素提取物處理PMA激活H(C- α的細胞樣品，24小時后提取蛋白免疫印記檢測HiC- α蛋白水平。各取約100萬個培養(yǎng)細胞使用100 μ 1細胞裂解液(1XPBS，1^^40,0.5%脫氧膽酸鈉，0. 1% SDS)裂解細胞，離心取上清用于免疫印記檢測。按標準的免疫印記程序進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作。一抗使用I3KC-α抗體和磷酸I3KC-α抗體(均購自CellSignaling 公司)，二抗使用HRP標記的羊抗兔抗體(Santa Cruz)。使用Pierce公司的發(fā)光檢測試劑盒進行檢測。結(jié)果參見圖2、圖3所示，可以看出在160μ g/ml的花青素提取物對H(C-a的磷酸化水平有明顯的抑制，而在總蛋白上表達上并無明顯差別。在抑制內(nèi)源性HiC-a實驗中， 在160 μ g/ml的花青素提取物不僅在活化I3KC-α上表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對I3KC-α總蛋白表達上也有一定的減弱作用。實施例3、花青素提取物對NF- κ B活化的抑制作用ΗΕΚ293Τ細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清(HyClone，SH30084. 03)的DMEM培養(yǎng)基(HyClone, SH30022. 01Β)中，37°C，5% CO2 孵箱中培養(yǎng)。按照 1. IX IO6 細胞/ml 的密度，接種于96孔板，每孔100 μ 1，置于孵箱培養(yǎng)18小時 M小時，使細胞密度達到40% 60%，以備轉(zhuǎn)染。按照說明書，使用Vigoi^ect陽離子轉(zhuǎn)染試劑(威格拉斯生物技術(shù)(北京) 有限公司)將80ng的pNF- κ B-Luc (購自美國Promega公司)和40ng的MEKK混合質(zhì)粒 (購自美國!Iomega公司)共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后6小時，HEK293T細胞分別用不同終濃度的花青素提取物 20 μ g/ml、40 μ g/ml、80 μ g/ml、160 μ g/ml、320 μ g/ml、640 μ g/ml 處理并繼續(xù)孵育對小時。最后檢測螢光素酶活性。按照雙螢光素酶報告系統(tǒng)(!Iomega，E1960)的說明書裂解細胞后，利用多功能微孔板檢測系統(tǒng)GENios Pro (Tecan)檢測螢光素酶強度。每個待篩基因設(shè)置3個復(fù)孔。結(jié)果如圖4所示，將MEKK激活NF- κ B通路的熒光素酶活性設(shè)為1 (100% )，計算出花青素提取物對NF- κ B通路的相對活性。結(jié)果表明花青素提取物對NF- κ B通路活化的抑制作用十分敏感，在低濃度的花青素提取物OO μ g/ml)作用下NF-κ B的激活即被明顯抑制，而在中高濃度花青素提取物的作用下，NF-kB的通路活性基本被完全抑制。
實施例4、花青素提取物對H520內(nèi)源H(C- α轉(zhuǎn)錄及蛋白水平抑制作用將Η520細胞(購自美國ATCC)以30萬/孔鋪于六孔板(NEST Biotecl, 703001)中常規(guī)培養(yǎng)18小時，將3 μ g PKC-α質(zhì)粒(pEGFP載體)按照說明書，使用Vigc^ect (Vigorous 公司)陽離子轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入H520細胞。繼續(xù)培養(yǎng)M小時按^witrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，上游引物 5，-CGACTGTCTGTAGAAATCTGG-3，(SEQID NO. 1)；下游引物 5，-CACCATGGTGCACTCCACGTC-3，(SEQ ID NO. :2)，PCR 擴增條件 94°C 5 分鐘， 94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s，30個循環(huán)。結(jié)果如圖5所示，通過RT-PCR檢測H520的內(nèi)源I3KC-α的mRNA水平，當(dāng)花青素提取物濃度達到320μ g/ml及以上時，H520內(nèi)源I3KC-α的mRNA水平出現(xiàn)了一定的減弱，而內(nèi)參GAPDH的轉(zhuǎn)錄水平未受影響。而圖6的flfestern-blot結(jié)果表明，在320 μ g/ml及以上濃度的花青素提取物作用下，PKC-α的蛋白表達有一定的下降，同時HiC-α磷酸化結(jié)果表明其活化也受到了一定的抑制作用。實施例5、花青素提取物對Η520細胞遷移能力的抑制作用將Η520細胞(購自美國ATCC)調(diào)整細胞濃度1. 5Χ 105/ml鋪于六孔板中 (NESTBiotecl，703001)，并用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔0.5-lcm—道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。并加入花青素提取物對比實驗組與正常組細胞遷移能力的變化并計算出細胞遷移率。放入37°C，5% C02培養(yǎng)，培養(yǎng)。按0h、24h，4 i取樣，拍照。由圖7可以看出，在劃痕后Mh，對比正常組細胞，花青素提取物處理組細胞遷移能力出現(xiàn)了明顯的抑制，即使在低濃度(80yg/ml)花青素提取物作用下，細胞的遷移能力也收到影響。劃痕后48h，正常細胞組出現(xiàn)了明顯的“傷口愈合”，花青素提取物處理組則對細胞遷移能力出現(xiàn)明顯的抑制作用。
權(quán)利要求
1.花青素提取物在抑制I3KC-α和/或NF- K B活化中的應(yīng)用。
2.花青素提取物在抑制腫瘤細胞遷移中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述抑制腫瘤細胞遷移是通過抑制H(C-α的活化而實現(xiàn)。
4.花青素提取物在研制治療腫瘤侵潤和轉(zhuǎn)移的原創(chuàng)性藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述藥物是通過抑制和/或NF-κ B的活化或是抑制腫瘤細胞遷移對腫瘤起到治療作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤為H(C-α高表達的實體瘤。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤為腎癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌或胰腺癌。
8.花青素提取物在制備治療與HiC-α和/或NF-κB相關(guān)的新的適應(yīng)癥的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述與H(C-α和/或NF-κB相關(guān)的新的適應(yīng)癥為腦缺血、糖尿病、心肌血管病變、阿爾茲海默病、肝硬化或動脈粥樣硬化。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或4或8所述的應(yīng)用，其中所述花青素提取物為篤斯越桔花青素提取物，但不限于從篤斯越桔提取的花青素。
全文摘要
本發(fā)明涉及花青素提取物的新應(yīng)用，具體是指花青素提取物在以PKC-α和NF-κB為靶標的臨床疾病治療中的新應(yīng)用，更具體涉及花青素提取物在抑制PKC-α和/或NF-κB的活化中的應(yīng)用，在抑制腫瘤細胞發(fā)生遷移中的應(yīng)用，以及在PKC-α和/或NF-κB相關(guān)適應(yīng)癥中的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/04GK102451216SQ20101051916
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月25日
發(fā)明者馬川 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司