專利名稱：治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑及其制備方法和應(yīng)用，屬于中藥的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腦血管疾病臨床上主要分為出血性腦血管病和缺血性腦血管病，缺血性腦血管病(動脈粥樣硬化性血栓性腦梗塞、腦栓塞和腔隙性腦梗塞)最為常見，約為出血性腦血管病的3倍。大量的流行病學(xué)研究表明，腦血栓形成又占到整個腦血管病的40～60％，腦出血占16～39％，蛛網(wǎng)膜下腔出血占10％左右，腦栓塞約占3～8％。世界衛(wèi)生組織1971～1974年統(tǒng)計(jì)的6391例按診斷分類的腦卒中，結(jié)果腦梗塞最常見，平均占40％以上；其次為腦內(nèi)出血，占16％；蛛網(wǎng)膜下腔出血在8％以上；腦栓塞占3.5～5％。美國Framingham18年隨訪發(fā)現(xiàn)腦血栓形成占57％，腦栓塞占15％，腦出血占5％，蛛網(wǎng)膜下腔出血占12％。隨著工業(yè)化程度的增長，以及人民群眾生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，高血壓，高血糖，高血脂，吸煙，飲酒等人群的增多，腦血管病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。缺血性腦血管病是中老年人的常見疾病，其發(fā)病急，死亡率、致殘率均較高，是中老年人三大主要死因之一。對于腦梗塞的治療原則以減少血栓形成，減少腦組織壞死，保護(hù)腦細(xì)胞為主，西醫(yī)藥的治療主要有溶栓、抗凝、抗血小板聚集、腦保護(hù)、血管擴(kuò)張、鈣拮抗治療。這些藥物如同大多數(shù)化學(xué)藥一樣，臨床應(yīng)用也受到越來越多顯現(xiàn)出來的副作用的限制。常用的抗血栓治療有溶栓劑(尿激酶，鏈激酶等)、抗凝劑(肝素、雙香豆素、華法令、新抗凝片等)、鈣離子拮抗劑(氟桂嗪、尼莫地平、尼卡地平、腦益嗪、硝苯地平、利多氟嗪等)，大多具有見效快的特點(diǎn)，但易出現(xiàn)出血性疾病、胃腸道反應(yīng)以及過敏、頭痛、頭暈、惡心、低血壓、皮疹等不良反應(yīng)，并常常受到并發(fā)癥的影響而應(yīng)用受限，故臨床應(yīng)用非常謹(jǐn)慎。而中國專利公報(bào)公開的專利申請?zhí)枮?3136116、名稱為“一種治療血液粘稠癥的中藥制劑及其制備方法”的申請，這份發(fā)明使用了比較多的中藥材配伍，制備比較復(fù)雜，特別是制備中藥注射劑是很困難的，不利于控制其生產(chǎn)質(zhì)量。鑒于此，十分有必要研發(fā)一種配伍簡單合理，療效可行的中藥組方。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛中藥制劑及其制備方法和應(yīng)用；本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)，本方根據(jù)風(fēng)痰流竄經(jīng)絡(luò)，血脈痹阻，經(jīng)隧不通，氣不能行，血不能濡，故肢體廢而不用成半身不遂的病因病機(jī)，遵“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)之滅”之理，采取活血化瘀通絡(luò)之法。以性味苦溫的燈盞細(xì)辛為君，用之化瘀通絡(luò)；赤芍味苦微寒，入血分，涼血熱，散瘀血，通經(jīng)絡(luò)，治血熱瘀滯，助君藥以達(dá)活血化瘀、散瘀通絡(luò)之效，用之為臣。二藥合用具有活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)的功能。組方有用藥精簡力專、作用途徑直接之長，無偏溫偏涼之弊，有較為明顯的用藥特色。本發(fā)明不僅對于治療心腦血管疾病如冠心病、心絞痛、心律失常、腦血栓、老年性癡呆等有較好的療效，還可以用于治療肝腎綜合癥、心肺病、糖尿病及其并發(fā)癥等疾病。而且本發(fā)明選用的燈盞細(xì)辛細(xì)辛、赤芍，主要含燈盞細(xì)辛花素、芍藥苷，工藝合理可行，制備過程中不會產(chǎn)生過敏性物質(zhì)，更加安全有效，可供病人長期使用。
本發(fā)明是這樣構(gòu)成的按照重量百分比計(jì)算，它是由燈盞細(xì)辛1～99％和赤芍99～1％與適當(dāng)?shù)妮o料制備而成。
優(yōu)選為按照重量百分比計(jì)算，它是由燈盞細(xì)辛20～80％和赤芍80～20％與適當(dāng)?shù)妮o料制作而成。
準(zhǔn)確的說按照重量百分比計(jì)算，它是由赤芍60％與燈盞細(xì)辛40％制作而成。
所述組方中的赤芍與燈盞細(xì)辛可以是藥材或者是由相應(yīng)比例藥材制備得到的提取物，其中燈盞細(xì)辛提取物可以是燈盞細(xì)辛醇提取物、燈盞細(xì)辛水提取物、燈盞細(xì)辛水提醇沉提取物、燈盞細(xì)辛半仿生提取物、燈盞細(xì)辛超臨界萃取物或者以上各提取物的精制品；赤芍提取物可以是赤芍醇提取物、赤芍水提取物、赤芍水提醇沉提取物、赤芍半仿生提取物、赤芍超臨界萃取物或者以上各提取物的精制品。
所述的制劑為直接用于注射給藥的小容量注射液、直接供靜脈滴注的靜脈輸液、需稀釋后用于靜脈滴注的注射用濃溶液和用冷凍干燥法或噴霧干燥法制得的注射用無菌粉末和無菌塊狀物，片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑、丸劑、軟膠囊劑、口服液體制劑、口腔崩解片或分散片劑。
制劑中含有黃酮類成分和苷類成分，以重量百分比計(jì)算，注射劑中黃酮類成分和苷類成分含量之和不低于制劑中扣除輔料量和水分量的總固體量的25％。
所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑的制備方法取赤芍藥材，粉碎后加入水或乙醇溶液提取，合并提取液，過濾，濃縮得赤芍粗提物，也可在此基礎(chǔ)上采用乙醇沉淀法、柱層析法、萃取法、絮凝沉淀法中的一種或幾種聯(lián)合使用進(jìn)行適當(dāng)精制，得赤芍精提物；取燈盞細(xì)辛藥材，粉碎后加入水或乙醇溶液提取，合并提取液，過濾，濃縮得燈盞細(xì)辛粗提物，也可在此基礎(chǔ)上采用乙醇沉淀法、柱層析法、萃取法、絮凝沉淀法中的一種或幾種聯(lián)合使用進(jìn)行適當(dāng)精制，得燈盞細(xì)辛精提物，將燈盞細(xì)辛粗提物或精提物與赤芍粗提物或精提物混合均勻，加輔料制成不同的制劑。
優(yōu)選為燈盞細(xì)辛加5～12倍量水煎煮1～5次，每次0.5～2小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)30～80％，不斷攪拌，靜置6～24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用鹽酸調(diào)pH值，保溫，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加3～10倍量水煎煮1～5次，每次0.5～2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)40～80％，攪拌均勻，靜置6～24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用水飽和的正丁醇提取1～5次，合并正丁醇液，用水洗1～3次，減壓回收正丁醇，殘留物加乙醇溶解，上聚酰胺柱，用乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與赤芍提取物混合均勻，加輔料制成不同的制劑。
準(zhǔn)確的說燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度50℃時1.09～1.11，加乙醇使含醇量達(dá)55％，不斷攪拌，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.10～1.12，用鹽酸調(diào)pH值至2，55℃保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值3～4，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度50℃時1.06～1.08，加乙醇使含醇量達(dá)60％，攪拌均勻，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.18～1.20，用1/2倍量水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加45％乙醇7500ml溶解，上聚酰胺柱，1500g，Φ12cm，徑高比1∶6，吸附流速0.5BV/h，BV-濕柱體積＝干樹脂重量的5倍體積，用45％乙醇22500ml洗脫，洗脫流速1BV/h，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與赤芍提取物混合均勻，加輔料制成不同的制劑。
所述制劑中的注射用無菌塊狀物這樣制備取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物和10g甘露醇，加1800ml注射用水，攪拌使溶解，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，加注射用水至2000ml，混勻，煮沸30分鐘，分裝于已處理好的輸液瓶中，塞入丁基橡膠塞及薄膜，軋鋁蓋，流通蒸汽滅菌30分鐘，冷藏24小時，在無菌條件下用0.45μm和0.22μm微孔濾膜濾過，濾液分裝，每瓶2.0ml，冷凍干燥，第一階段的平衡凍結(jié)溫度為0℃時的平衡時間為1.5小時，即擱板溫度與產(chǎn)品溫度基本一致的時間；第二階段凍結(jié)溫度從0℃到最低共熔溫度-16℃時，擱板溫度與產(chǎn)品溫度平衡時間為1.5小時；第三階段繼續(xù)降溫至-45℃，約需1.5小時，保持此溫度1.5小時，直至產(chǎn)品完全凍牢，即開始抽真空，進(jìn)入干燥程序，在45℃恒溫下-抽真空，使干燥室的氣壓降至13.332～266.64Pa，在此壓力下緩慢升溫，2～4℃/h，至最低共熔點(diǎn)溫度，時間約為12小時，升華干燥完成后，繼續(xù)在13.332Pa低壓條件下，升溫干燥以除去殘余水分，時間約為12～15小時，保持35℃以上干燥3小時，壓蓋，即得。
所述制劑中的注射液和注射用濃溶液這樣制備取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，加入適量注射用水溶解，按體積加入1.0％的活性炭，煮沸，保持微沸30min，稍冷濾過，濾液加注射用水至規(guī)定量，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，煮沸，4℃冷藏過夜，粗濾、精濾，加注射用水，分裝到安剖瓶，封口滅菌即得小容量注射液或注射用濃溶液。
所述制劑中的葡萄糖或氯化鈉靜脈輸液這樣制備取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，加入適量注射用水溶解，加入規(guī)定量的葡萄糖或氯化鈉，混合溶解后按體積加入1.0％的活性炭，煮沸，保持微沸30min，稍冷濾過，濾液加注射用水至規(guī)定量，再用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，煮沸，4℃冷藏過夜，粗濾、精濾，加注射用水，分裝，滅菌即得。
所述制劑中的注射用無菌粉末這樣制備取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，加1800ml注射用水，攪拌使溶解，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，加注射用水至2000ml，混勻，煮沸30分鐘，分裝到搪瓷盤中，冷凍干燥，第一階段的平衡凍結(jié)溫度為0℃時的平衡時間為1.5小時，即擱板溫度與產(chǎn)品溫度基本一致的時間；第二階段凍結(jié)溫度從0℃到最低共熔溫度-16℃時，擱板溫度與產(chǎn)品溫度平衡時間為1.5小時；第三階段繼續(xù)降溫至-45℃，約需1.5小時，保持此溫度1.5小時，直至產(chǎn)品完全凍牢，即開始抽真空，進(jìn)入干燥程序，在45℃恒溫下-抽真空，使干燥室的氣壓降至13.332～266.64Pa，在此壓力下緩慢升溫，2～4℃/h，至最低共熔點(diǎn)溫度，時間約為12小時，升華干燥完成后，繼續(xù)在13.332Pa低壓條件下，升溫干燥以除去殘余水分，時間約為12～15小時，保持35℃以上干燥3小時，在無菌條件下分裝到西林瓶中，即得。
所述制劑中的注射用無菌粉末還可以這樣制備取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，混勻，加入適量注射用水溶解，按體積加入1.0％的活性炭，煮沸，保持微沸30min，稍冷濾過，濾液加注射用水至規(guī)定量，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，煮沸，4℃冷藏過夜，粗濾、精濾，在進(jìn)風(fēng)溫度為150℃，出風(fēng)溫度為60℃，氣流速度為20m·s-1的條件下噴霧干燥得粉末，分裝，即得。
本發(fā)明中燈盞細(xì)辛提取物可以是黃酮類成分含量大于90％的總黃酮有效部位，赤芍提取物可以是苷類成分含量大于90％的總苷有效部位。
本發(fā)明中赤芍及赤芍提取物還可以用等量的白芍及白芍提取物替代。
所述的制劑也可以用于制備治療肝腎綜合癥、心肺病、糖尿病及其并發(fā)癥等疾病的藥物。
也就是說，本發(fā)明制備的產(chǎn)品可以用于治療肝腎綜合癥、心肺病、糖尿病及其并發(fā)癥等疾病。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方根據(jù)風(fēng)痰流竄經(jīng)絡(luò)，血脈痹阻，經(jīng)隧不通，氣不能行，血不能濡，故肢體廢而不用成半身不遂的病因病機(jī)，遵“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)之滅”之理，采取活血化瘀通絡(luò)之法。以性味苦溫的燈盞細(xì)辛為君，用之化瘀通絡(luò)；赤芍味苦微寒，入血分，涼血熱，散瘀血，通經(jīng)絡(luò)，治血熱瘀滯，助君藥以達(dá)活血化瘀、散瘀通絡(luò)之效，用之為臣。二藥合用具有活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)的功能。組方有用藥精簡力專、作用途徑直接之長，無偏溫偏涼之弊，有較為明顯的用藥特色，通過合理可行的工藝，制備過程中不會產(chǎn)生過敏性物質(zhì)，保證了產(chǎn)品的安全有效，可供病人長期使用。
本申請人在研制過程中，對每個環(huán)節(jié)都進(jìn)行了詳細(xì)的研究提取工藝路線研究通過對方中藥物所含化學(xué)成分研究，分析每味藥材的有效成分與藥理作用，結(jié)合不同提取溶劑、不同提取方法的藥效學(xué)試驗(yàn)研究及指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率，確定了本方的基本工藝路線。
組方配比及拆方研究我們以小鼠急性腦缺血的保護(hù)作用為評價指標(biāo)，對方中兩味藥材組成配比進(jìn)行最佳處方篩選，結(jié)果表明燈盞細(xì)辛與赤芍用量之比為1∶1.5為該方的最佳配方。同時以小鼠急性腦缺血作用為指標(biāo)進(jìn)行拆方研究，結(jié)果表明各給藥組均能延長急性腦缺血小鼠的呼吸維持時間，兩藥合用的作用強(qiáng)度顯著優(yōu)于單味用藥組(P＜0.01)。
提取方法和提取條件的選擇方中兩味藥材經(jīng)不同提取溶劑、不同提取方法以及單獨(dú)提取、合并提取，以化學(xué)指標(biāo)成分及藥效學(xué)試驗(yàn)等指標(biāo)進(jìn)行動態(tài)跟蹤，試驗(yàn)結(jié)果提示兩味藥材不宜混合提取，以水煎煮提取制備的樣品生理活性較強(qiáng)，制劑中有效成分的提取率高，制劑質(zhì)量易于控制。試驗(yàn)中對溶劑用量、提取時間、提取次數(shù)等進(jìn)行了正交試驗(yàn)，篩選最優(yōu)提取工藝。
分離、純化工藝在藥材的提取物中，除有效成分外，尚含許多雜質(zhì)成分，為保證產(chǎn)品的質(zhì)量和有利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制，需進(jìn)一步精制純化，盡可能地除去水提液中的大分子粘液質(zhì)、蛋白質(zhì)、淀粉及固體微粒等雜質(zhì)，提高有效成分的含量。經(jīng)不同方法對比試驗(yàn)，兩味藥材的煎煮液均可采用乙醇處理。燈盞細(xì)辛酸化精制；赤芍用正丁醇提取(試驗(yàn)采用大孔吸附樹脂吸附分離、正丁醇提取等方法進(jìn)行理化性質(zhì)研究及藥效學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果表明赤芍中的活性成分之一酚酸類成分主要存在于水洗液和流穿液中，而對大鼠局灶性腦缺血(MCAO)腦血流量的影響以及對小鼠急性腦缺血的保護(hù)作用試驗(yàn)結(jié)果均顯示水洗液和流穿液仍有較強(qiáng)的藥理活性，說明大孔吸附樹脂分離不能將有效成分有效富集)。經(jīng)純化精制的樣品綜合指標(biāo)好，主要成分的純度和收率較高，產(chǎn)品質(zhì)量易于控制，經(jīng)試驗(yàn)研究方法的考察和對精制組分(半成品)的藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝合理、可行。
除鞣質(zhì)方法選擇赤芍中含有鞣質(zhì)，必須進(jìn)行除鞣質(zhì)處理。經(jīng)各種除鞣質(zhì)方法的對比研究，采用對鞣質(zhì)吸附力極強(qiáng)的聚酰胺除鞣質(zhì)。結(jié)果表明，該法去除鞣質(zhì)效果較好，有效成分損失少，芍藥苷的轉(zhuǎn)移率高，樣品中的鞣質(zhì)檢查符合規(guī)定，小鼠的異常毒性檢查可達(dá)120倍以上(經(jīng)對市售幾種中藥注射劑進(jìn)行對比檢查，小鼠的異常毒性大多在60倍左右)，明顯高于其他除鞣質(zhì)方法。說明本品用聚酰胺去除鞣質(zhì)的方法可行，制劑的安全性得到有效保證。
半成品干燥方法的選擇經(jīng)對不同干燥條件的試驗(yàn)對比，結(jié)果表明，真空干燥對有效成分的影響較小，干燥速度快，溫度低，樣品質(zhì)地疏松，易于溶解。
制劑成型工藝研究經(jīng)對附加劑的選擇及用量、pH值的影響、滅菌條件的優(yōu)選、冷凍干燥工藝等試驗(yàn)，確定了制劑成型工藝的基本參數(shù)及制劑半成品投料的處方。
此外，本發(fā)明還在實(shí)施方式中提供了其他提取工藝、多種制劑的詳細(xì)制作工藝，可以直接用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。
申請人進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，可以證明本發(fā)明提供的藥物具有有效的效果。
實(shí)驗(yàn)例1不同配方的藥效學(xué)比較研究(1)對急性血瘀大鼠血液流變性的影響大鼠70只，雌雄各半，體重270±20g連續(xù)給藥12天，末次給藥后1h，除正常對照組外其余各組均sc注射腎上腺素0.8mg/kg，共兩次，兩次間隔4h。在兩次之間(前后各間隔2小時)，將大鼠浸入冰水中5min，禁食。次日晨股動脈采血，肝素鈉抗凝，測定血流變各指標(biāo)。
組別 血漿粘度 紅細(xì)胞壓積 還原粘度正常對照1.52±0.34 0.43±0.11 7.78±0.29模型對照2.15±0.18 0.55±0.04 8.39±3.43赤芍2g/kg 1.96±0.24 0.48±0.27 8.20±2.54燈盞細(xì)辛2g/kg 1.81±0.18 0.45±0.08 8.10±1.72白芍2g/kg 1.98±0.27 0.49±0.39 8.21±1.33燈盞白芍提取液 1.70±0.45 0.44±0.87 7.85±1.33燈盞赤芍提取液 1.68±0.19 0.43±0.15 7.81±1.64結(jié)果表明，燈盞花主要成分是燈盞花素總黃酮，化學(xué)名為4，5，6-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸甙，具有抑制血小板積聚、抑制凝血功能、改善微循環(huán)的作用，能抑制鈣泵對鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)；赤芍能降低血漿脂質(zhì)過氧化物，減少鈣沉積于動脈壁，影響鈣代謝，平衡抗動脈粥樣硬化；燈盞細(xì)辛和赤芍配伍后有較強(qiáng)改善血瘀模型血液狀態(tài)的能力，能使血瘀大鼠血漿粘度、紅細(xì)胞壓積、血小板聚集顯著降低，本發(fā)明組方能夠聯(lián)合增效。該實(shí)驗(yàn)還證明用等量的白芍及白芍提取物替代赤芍及赤芍提取物得到的制劑具有基本相同的效果。
(2)對血瘀模型家兔血液流變性的影響家兔64只，隨機(jī)分為8組，每組8只，♀♂各半。各組動物先耳緣靜脈注射(iv)給藥?？瞻准澳Ｐ蛯φ战M注射生理鹽水(NS)1ml/kg，陽性藥組iv葛根素注射液30mg/kg(以NS配成30mg/ml)，實(shí)驗(yàn)組分別注射0.25mg/ml的藥液(以NF配成)，給藥量均為1ml/kg，連續(xù)給藥兩周(14d)，于給藥的第2、13d，除空白對照組外，各兔分別經(jīng)耳緣靜脈注10％高分子右旋糖酐5ml/kg，每日兩次，造成血瘀模型。末次給藥后，再次注射10％高分子右旋糖酐5ml/kg，15min后，心臟采取空腹血6ml，進(jìn)行血液流變學(xué)指標(biāo)檢測，其中血小板聚集率用LBY-NJ2型血小板聚集儀，采用比濁法測定其它采用LBY-N6A+旋轉(zhuǎn)式錐板粘度儀測定。
對家兔血小板聚集和纖維蛋白原的影響(x±s，n＝6)組別 劑量 體重(kg) 血小板聚集(％) 纖維蛋白原(g/L)空白組- 2.41±0.2216.33±1.73 2.87±3.18模型組- 2.49±0.1639.06±17.13 2.65±1.29陽性藥組 30mg/kg 2.38±0.1512.48±0.36 3.04±2.88燈盞∶赤芍(1∶99) 2g/kg 2.40±0.2713.11±0.23 2.91±1.53燈盞∶赤芍(1∶4) 2g/kg 2.39±0.3513.02±3.05 2.95±1.32燈盞∶赤芍(2∶3) 2g/g 2.37±0.1312.50±0.40 3.03±0.87燈盞∶赤芍(4∶1) 2g/kg 2.40±0.1513.19±0.30 2.90±0.69燈盞∶赤芍(99∶1) 2g/g 2.41±0.2713.23±0.42 2.96±0.58初步實(shí)驗(yàn)表明，燈盞、赤芍配伍有效，本申請人還在工藝研究過程中進(jìn)行了詳細(xì)的組方配比與拆方研究。
實(shí)驗(yàn)例2提取工藝研究為了解本方對腦血管疾病作用的有效部位和主要有效成分，我們對本方提取溶劑、提取方法(合煎、單煎)，以及組方配比、不同給藥途徑、不同提取分離、精制純化方法的藥效學(xué)和化學(xué)成分的動態(tài)變化進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果表明其藥理活性與藥液中的物質(zhì)基礎(chǔ)有關(guān)，復(fù)方藥效優(yōu)于任何單味藥；血管內(nèi)給藥作用明顯優(yōu)于血管外給藥；兩味藥材純化精制后不但保留了有效成分，而且制劑質(zhì)量得到有效提高，達(dá)到靜脈注射用制劑的質(zhì)量要求。
1提取溶劑、提取方法的選擇 以小鼠急性腦缺血的保護(hù)作用為評價指標(biāo)，采用系統(tǒng)溶劑法，對兩味藥材分別提取、混合提取、分別提取后混合樣品進(jìn)行試驗(yàn)。
1.1樣品制備 取燈盞細(xì)辛、赤芍藥材，分別用醋酸乙酯、正丁醇、乙醇和水依次提取，分段制樣，得樣品TR1(A)、TR1(B)、TR1(C)、TR1(D)、TR2(A)、TR2(B)、TR2(C)、TR2(D)、TR3(A)、TR3(B)、TR3(C)、TR3(D)、TR4(A)、TR4(B)、TR4(C)、TR4(D)提取物。上述各樣品，于水浴上進(jìn)一步除去殘留溶劑，加適量水微熱溶解，調(diào)pH值至6，充分?jǐn)嚢?，滴?％明膠溶液至無沉淀產(chǎn)生，再加乙醇使含醇量為75％，靜置12小時，濾過，濾液回收乙醇，濃縮近干，加水稀釋至每1ml含2.0g生藥，調(diào)pH值至7.0，煮沸，放冷，濾過，冷藏24小時，用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液分裝，滅菌，備用。對上述樣品進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)比較，考察該方提取溶媒、提取方法。
1.2實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果取昆明種小鼠約180只，體重18～22g，雌雄兼用，隨機(jī)分為18組，每組10只(雌雄各半)。樣TR-12.4g生藥/kg；樣TR-23.6g生藥/kg；樣TR-36.0g生藥/kg；樣TR-46.0g生藥/kg；陽性對照藥4.0ml/kg；模型組給予等容積的生理鹽水。各組均通過尾靜脈給藥，給藥容積為10ml/kg。靜脈給藥15min后，仰臥位固定，用0號手術(shù)縫線兩端結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(合并迷走神經(jīng))后中間剪斷。記錄小鼠的呼吸維持時間，結(jié)果見下表。
試驗(yàn)結(jié)果表明，除TR-1(A)、TR-1(B)、TR-1(D)、TR-2(A)、TR-3(A)、TR-3(D)六個樣品外，各給藥組均能延長急性腦缺血的小鼠呼吸維持時間，與模型組比較差異顯著(P＜0.05、P＜0.01)。其中乙醇和正丁醇提取液作用比較明顯，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05、P＜0.01)，而醋酸乙酯和水提液的作用較上述兩種溶劑的作用差。
試驗(yàn)結(jié)果提示第一，該方中的有效成分主要為極性較大的物質(zhì)，同時說明有機(jī)溶劑提取后，水提液中仍有活性成分，為排除溶劑使用先后對藥理作用的影響，兩味藥材分別選擇水、乙醇等進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。第二，樣品4的作用明顯比樣品3強(qiáng)，說明兩藥分開提取比合并提取效果好。
對急性腦缺血小鼠呼吸維持時間的影響(x±s，n＝10)


與模型組比較*P＜0.05 **P＜0.01注樣品TR1為燈盞細(xì)辛藥材單獨(dú)提取，樣品TR2為赤芍藥材單獨(dú)提取。樣品TR3為兩味藥材混合提取，樣品TR4為分別單獨(dú)提取后，提取物混合制樣。A-醋酸乙酯提取，B-正丁醇提取，C-為乙醇提取，D為水煮提取。陽性對照藥復(fù)方丹參注射液，上海通用藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號0302182。
2單獨(dú)提取或合并提取工藝選擇為進(jìn)一步確定本方的提取工藝，以小鼠急性腦缺血的保護(hù)作用為評價指標(biāo)，對方中兩味藥材單獨(dú)提取或合并提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)比較。
2.1樣品制備單獨(dú)水煎煮提取取燈盞細(xì)辛100g，加12倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濃縮至每1ml含生藥2g的濃度，加乙醇使含醇量為60％，攪拌，靜置24小時，濾過，濃縮，再加乙醇使含醇量為70％，靜置24小時，濾過，濾液回收乙醇，濃縮近干，得燈盞細(xì)辛提取物；再取赤芍藥材150g，加10倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，濃縮至每1ml含生藥2g的濃度，加乙醇使含醇量為60％，攪拌，靜置12小時，濾過，回收溶劑并濃縮至每1ml含2g生藥，滴加5％明膠溶液至無沉淀產(chǎn)生，再加乙醇使含醇量為75％，靜置12小時，濾過，濾液回收乙醇，濃縮近干，得赤芍提取物。取赤芍和燈盞細(xì)辛提取物加注射用水120ml微熱溶解，調(diào)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至125ml，煮沸，放冷，濾過，冷藏24小時，用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液分裝，滅菌，即得(每1ml含生藥2.0g)。
合并水煎煮提取取燈盞細(xì)辛100g、赤芍藥材150g，加10倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，濃縮至每1ml含生藥2g的濃度，加乙醇使含醇量為60％，攪拌，靜置24小時，濾過，濾液回收乙醇至并濃縮至每1ml含生藥2g，滴加5％明膠溶液至無沉淀產(chǎn)生，再加乙醇使含醇量為75％，靜置12小時，濾過，濾液回收乙醇，濃縮近干，得提取物，加注射用水120ml微熱溶解，調(diào)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至125ml，煮沸，放冷，濾過，冷藏24小時，用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液分裝，滅菌，即得(每1ml含生藥2.0g)。
陽性對照藥復(fù)方丹參注射液，規(guī)格2ml/支。上海通用藥業(yè)股份有限公司第三公司，批號0302182。
藥物稀釋方法 臨用前用0.9％的氯化鈉注射液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，備用?br> 2.2藥效學(xué)試驗(yàn)方法及結(jié)果對小鼠急性腦缺血的保護(hù)作用 取昆明種小鼠約40只，體重18～22g，雌雄兼用，隨機(jī)分為4組，每組10只(雌雄各半)。樣TF1、2給藥劑量為2.5g生藥/kg；陽性對照藥4.0ml/kg；模型組給予等容積的生理鹽水。各組均通過尾靜脈給藥，給藥容積為10ml/kg。靜脈給藥15min后，仰臥位固定，用0號手術(shù)縫線兩端結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(合并迷走神經(jīng))后中間剪斷。記錄小鼠的呼吸維持時間，試驗(yàn)結(jié)果見下表。
對急性腦缺血小鼠呼吸維持時間的影響(x±s，n＝10)

與模型組比較*P＜0.05、**P＜0.01TF-1合并提取樣，TF-2單獨(dú)提取樣，下同試驗(yàn)結(jié)果表明，各給藥組均能延長急性腦缺血的小鼠呼吸維持時間，與模型組比較差異顯著(P＜0.05、P＜0.01)，其中兩味藥材分開提取作用較明顯(P＜0.01)，組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。
2.3樣品中指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率分別取上述樣品，依法測定燈盞細(xì)辛中野黃芩苷和赤芍中芍藥苷的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見下表。
不同提取方法指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率試驗(yàn)結(jié)果 分開提取樣品的野黃芩苷和芍藥苷轉(zhuǎn)移率均明顯高于合并提取樣品，主要是由于在煎煮過程中，提取液pH值較低(pH＝4～5)，影響有效成分的提取，尤其對野黃芩苷的影響較大。
綜上，乙醇和水是燈盞細(xì)辛和赤芍的有效提取溶劑，單獨(dú)提取和合并提取的提取物均能延長急性腦缺血小鼠呼吸維持時間。盡管組間比較無顯著性差異，但單獨(dú)提取的作用明顯優(yōu)于合并提取；水煎煮提取野黃芩苷和芍藥苷在樣品中的轉(zhuǎn)移率較高，分開提取野黃芩苷和芍藥苷轉(zhuǎn)移率明顯高于合并提取。結(jié)合藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果分析，本品中野黃芩苷和芍藥苷為本方有效物質(zhì)，故本方宜以價廉的水為溶劑煎煮提取，兩味藥材不宜合并煎煮。
3組方配比與拆方研究 本方為驗(yàn)方，臨床應(yīng)用組方配比不盡相同，為進(jìn)一步探討本發(fā)明產(chǎn)品(凍干粉針)組方配比及組方的合理性，以小鼠急性腦缺血、缺氧的保護(hù)作用為評價指標(biāo)，對方中兩味藥材組成配比及拆方進(jìn)行藥效學(xué)試驗(yàn)研究。
3.1組方配比研究3.1.1處方-1(燈盞細(xì)辛∶赤芍＝1∶1)取燈盞細(xì)辛120g，加12倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濃縮至每1ml含生藥2g的濃度，加乙醇使含醇量為60％，攪拌，靜置24小時，濾過，濃縮，再加乙醇使含醇量為70％，靜置24小時，濾過，濾液回收乙醇，濃縮近干，得燈盞細(xì)辛提取物。再取赤芍120g，加10倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，濃縮至每1ml含生藥2g的濃度，加乙醇使含醇量為60％，攪拌，靜置12小時，濾過，濃縮，滴加5％明膠溶液至無沉淀產(chǎn)生，再加乙醇使含醇量為75％，靜置12小時，濾過，濾液回收乙醇，濃縮近干，得赤芍提取物。取赤芍和燈盞細(xì)辛提取物加注射用水適量微熱溶解，調(diào)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至120ml，煮沸，放冷，濾過，冷藏24小時，用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液分裝，滅菌，即得(每1ml含生藥2g)。
處方-2(燈盞細(xì)辛∶赤芍＝1∶1.5)取燈盞細(xì)辛120g，赤芍180g，分別按上法操作得提取物。取兩提取物加適量注射用水微熱溶解，調(diào)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至150ml，同法操作即得。
處方-3(燈盞細(xì)辛∶赤芍＝1∶2)取燈盞細(xì)辛120g，赤芍240g，分別按上法操作。取兩提取物加適量注射用水微熱溶解，調(diào)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至180ml，同法操作即得。
處方-4(燈盞細(xì)辛∶赤芍＝2∶1)取燈盞細(xì)辛180g，赤芍90g，分別按上法操作。取兩提取物加適量注射用水微熱溶解，調(diào)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至135ml，同法操作即得。
藥物稀釋方法臨用前用0.9％的氯化鈉注射液(廣西浦北制藥廠，批號A0301153)稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，備用?br> 3.1.2試驗(yàn)方法及結(jié)果對小鼠急性腦缺血的保護(hù)作用取昆明種小鼠約210只，體重18～22g，雌雄兼用，隨機(jī)分為21組，每組10只(雌雄各半)。各劑量組按下表給藥；模型組給予等容積的生理鹽水。各組均通過尾靜脈給藥，給藥容積為10ml/kg。靜脈給藥15min后，仰臥位固定，用0號手術(shù)縫線兩端結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(合并迷走神經(jīng))后中間剪斷。記錄小鼠的呼吸維持時間，試驗(yàn)結(jié)果見下表。
對急性腦缺血小鼠呼吸維持時間的影響(x±s，n＝10)


與模型組比較*P＜0.05、**P＜0.01，與處方2比較#P＜0.05、##P＜0.01CF-1～CF-4處方1～處方4，下同。
結(jié)果表明，4種不同配比組方的提取物均能不同程度延長急性腦缺血小鼠呼吸維持時間。按改進(jìn)寇氏法計(jì)算各配比組方的半數(shù)有效量(ED50)由小到大依次為處方2(1.09g生藥/kg)＜處方3(1.54g生藥/kg)＜處方1(1.60g生藥/kg)＜處方4(1.66g生藥/kg)。處方2的ED50顯著小于處方1、4；處方2小于處方3，但差別不顯著。由上可知，處方2效果最佳，即燈盞細(xì)辛與赤芍用量之比為1∶1.5。
3.2組方拆方研究3.2.1樣品制備燈盞細(xì)辛樣品取燈盞細(xì)辛300g，加12倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濃縮至每1ml含生藥2g的濃度，加乙醇使含醇量為60％，攪拌，靜置24小時，濾過，濃縮，再加乙醇使含醇量為70％，靜置24小時，濾過，濾液回收乙醇，濃縮近干，得燈盞細(xì)辛提取物。加注射用水適量微熱溶解，調(diào)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至150ml，煮沸，放冷，濾過，冷藏24小時，用0.45μm微孔濾膜濾過，分裝，滅菌，即得(每1ml含生藥2g)。
赤芍樣品取赤芍450g，加10倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，濃縮至每1ml含生藥2g的濃度，加乙醇使含醇量為60％，攪拌，靜置12小時，濾過，濃縮，滴加5％明膠溶液至無沉淀產(chǎn)生，再加乙醇使含醇量為75％，靜置12小時，濾過，濾液回收乙醇，濃縮近干，得赤芍提取物。加注射用水適量微熱溶解，調(diào)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至225ml，煮沸，放冷，濾過，冷藏24小時，用0.45μm微孔濾膜濾過，分裝，滅菌，即得(每1ml含生藥2g)。
二藥合用樣品取燈盞細(xì)辛300g、赤芍450g，分別按上述方法提取，得提取物。兩提取物合并，加注射用水適量微熱溶解，調(diào)pH值至7.0，補(bǔ)加注射用水至375ml，煮沸，放冷，濾過，冷藏24小時，用0.45μm微孔濾膜濾過，分裝，滅菌，即得(每1ml含生藥2g)。
3.2.2試驗(yàn)方法及結(jié)果3.2.2.1對小鼠急性腦缺血的保護(hù)作用取昆明種小鼠50只，體重18～22g，雌雄兼用，隨機(jī)分為5組，每組10只(雌雄各半)。樣CFYJ-1給藥劑量為1.0g生藥/kg，樣CFYJ-2給藥劑量為1.5g生藥/kg，樣CFYJ-3給藥劑量為2.5g生藥/kg；陽性對照組4.0ml/kg；模型組給予等容積的生理鹽水。各組均通過尾靜脈給藥，給藥容積為10ml/kg。靜脈給藥15min后，仰臥位固定，用0號手術(shù)縫線兩端結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(合并迷走神經(jīng))后中間剪斷。記錄小鼠的呼吸維持時間，試驗(yàn)結(jié)果見下表。
對急性腦缺血小鼠呼吸維持時間的影響(x±s，n＝10)

與模型組比較*P＜0.05、**P＜0.01與CFJY-3組比較#P＜0.05、##P＜0.01CFJY-1燈盞細(xì)辛CFJY-2赤芍CFJY-3燈盞細(xì)辛+赤芍試驗(yàn)結(jié)果表明，各給藥組均能延長急性腦缺血小鼠的呼吸維持時間，與模型組比較差異顯著(P＜0.05、P＜0.01)；燈盞細(xì)辛與赤芍合并用藥組，作用強(qiáng)度顯著優(yōu)于單味用藥組(P＜0.01)，說明復(fù)方的作用明顯優(yōu)于單方。
3.2.2.2處方交互作用分析為進(jìn)一步研究兩藥合用后可能存在的交互作用，采用L4(23)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行交互作用分析，結(jié)果見下表。
L4(23)正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果(x±s，n＝10)

從上表的結(jié)果直觀分析，各因素影響藥效的順序?yàn)?，燈盞細(xì)辛對于藥效的貢獻(xiàn)略大于赤芍(A＞B)；正交實(shí)驗(yàn)方差分析表明，燈盞細(xì)辛或赤芍對于藥效均有極顯著影響(P＜0.01)，而且兩藥存在明顯的交互作用(P＜0.01)。交互作用分析如下

將不用藥試驗(yàn)組作為基數(shù)(23.60)，燈盞細(xì)辛藥效＝(32.66-23.60)，赤芍藥效＝(32.23-23.60)，燈盞+赤芍藥效＝(58.73-23.60)。由于(58.73-23.60)＞(32.66-23.60)+(32.23-23.60)，故燈盞細(xì)辛與赤芍存在交互作用，說明兩藥合用具有協(xié)同效果。
4.系統(tǒng)工藝研究4.1燈盞細(xì)辛提取工藝研究
4.1.1煎煮工藝的正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)因素水平表設(shè)計(jì)根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)是影響煎煮效率的主要因素，按每個因素3水平，用L9(34)正交表安排試驗(yàn)。以野黃芩苷收率為考察指標(biāo)，對提取工藝進(jìn)行探討。
因素水平表

燈盞細(xì)辛煎煮工藝條件L9(34)正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

方差分析表

F0.05(2，2)＝19.00 F0.01(2，2)＝99.00結(jié)果分析從上表中的結(jié)果直觀分析，各因素影響提取效率的順序?yàn)镃＞B＞A，其中提取次數(shù)和提取時間對提取工藝影響較大；方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)有極顯著性差異(P＜0.01)，提取時間有顯著性差異(P＜0.05)，兩者結(jié)論一致。最佳工藝條件為A3B1C3，在A因素中最佳工藝和次佳工藝的極差較小，從節(jié)省能源和時間的角度考慮，次佳工藝為A2B1C3。故以最佳工藝A3B1C3和次佳工藝A2B1C3進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)(結(jié)果見下表)。
正交試驗(yàn)重復(fù)結(jié)果

從上表結(jié)果可見，甲乙兩工藝的野黃芩苷收率無明顯差異，從省工省時、降低能耗的角度，選擇乙工藝進(jìn)行生產(chǎn)。即加藥材重量10倍的水(第一次多加3倍量)，煎煮3次，每次0.5小時。
4.1.2燈盞細(xì)辛純化方法的選擇燈盞細(xì)辛的有效成分為黃酮類化合物，該類化合物為多元酚類，可溶于水、乙醇，在酸性條件下析出沉淀，不溶于水，在中性和弱堿性條件下溶解，故采用乙醇沉淀、酸化處理的方法精制除雜。
4.1.2.1醇沉工藝的正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)因數(shù)水平表設(shè)計(jì)藥液的相對密度、醇沉濃度(根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，野黃芩苷在50％乙醇中溶解度較好，故醇濃度范圍定在45-65％試驗(yàn))、放置時間是影響醇沉工藝的主要因素，按每個因素3水平，用L9(34)正交表安排試驗(yàn)(下表)。以野黃芩苷提取率為考察指標(biāo)，對提取工藝進(jìn)行探討。
因素水平表

樣品制備取相當(dāng)于100g生藥的水煎液9份，分別濃縮至所需濃度，按正交試驗(yàn)表所示條件進(jìn)行試驗(yàn)。取樣測定野黃芩苷濃度，計(jì)算野黃芩苷量，以野黃芩苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)進(jìn)行評價，結(jié)果見下表。
燈盞細(xì)辛醇沉工藝條件L9(34)正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

方差分析表

F0.05(2，2)＝19.00 F0.01(2，2)＝99.00。
結(jié)果分析從上表中的結(jié)果直觀分析，各因素影響醇沉效率的順序?yàn)锳＞B＞C，其中相對密度和乙醇濃度對轉(zhuǎn)移率影響較大；方差分析結(jié)果表明，相對密度對轉(zhuǎn)移率有極顯著性影響(P＜0.01)，乙醇濃度對轉(zhuǎn)移率有顯著性影響(P＜0.05)，兩者結(jié)論一致，最佳工藝條件為A3B1C3，次佳工藝A2B2C2。在A、B因素中，最佳工藝和次佳工藝的極差較小，B因素中乙醇濃度低于50％時醇沉液濾過較困難，C因素為次要因素，綜合考慮，以最佳工藝A3B1C3和次佳工藝A2B2C2進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)(結(jié)果見下表)。
正交試驗(yàn)重復(fù)結(jié)果

從上表結(jié)果可見，甲乙兩工藝的野黃芩苷轉(zhuǎn)移率無明顯差異，但甲工藝由于乙醇濃度過低，溶液不易沉清，樣品過濾時較困難，故選擇乙工藝進(jìn)行生產(chǎn)。即煎煮液濃縮至相對密度為1.10(50℃)、加乙醇使含醇量為55％，攪拌，放置12小時，濾過，濾液減壓回收乙醇。
4.1.2.2酸化條件的優(yōu)化燈盞細(xì)辛中黃酮類為多元酚類，在酸性條件下可析出沉淀，不溶于水，在中性和弱堿性條件下溶解，故采用酸化處理的方法制備燈盞細(xì)辛提取物。
酸化工藝正交試驗(yàn)因數(shù)水平表設(shè)計(jì)藥液的相對密度、pH值、保溫溫度、放置時間是影響酸化工藝的主要因素，按每個因素3水平，用L9(34)正交表安排試驗(yàn)(下表)。以野黃芩苷提取率考察指標(biāo)，對酸化工藝進(jìn)行考察。
因素水平表

樣品制備取相當(dāng)于50g生藥的藥液18份，濃縮至所需濃度，按正交試驗(yàn)表所示條件試驗(yàn)，收集沉淀物，用70％乙醇溶解至500ml，測定野黃芩苷含量，以野黃芩苷的轉(zhuǎn)移率為評價指標(biāo)進(jìn)行評價。
正交工藝試驗(yàn)結(jié)果酸化工藝條件L9(34)正交試驗(yàn)安排及結(jié)果


方差分析表

F0.05(2，9)＝4.26 F0.01(2，9)＝8.02。
結(jié)果分析從結(jié)果直觀分析，各因素影響酸化效率的順序?yàn)锽＞C＞A＞D，其中pH值、保溫溫度和相對密度對工藝影響較大；方差分析結(jié)果表明，各因素均有極顯著性差異(P＜0.01)，最佳工藝條件為A2B2C3D2，在C、D因素中最佳工藝和次佳工藝的極差較小，綜合考慮，選次佳工藝為A2B2C2D1。以最佳工藝A2B2C3D2和次佳工藝A2B2C2D1進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見下表。
正交試驗(yàn)重復(fù)結(jié)果

從上結(jié)果可見，甲乙兩工藝的野黃芩苷收率無明顯差異，從省工省時的角度，選擇乙工藝進(jìn)行生產(chǎn)。即藥液濃縮至相對密度1.11(50℃)，用鹽酸調(diào)pH值至2，于55℃保溫6小時。
4.1.3燈盞細(xì)辛提取物干燥方法的選擇取燈盞細(xì)辛1500g，加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度1.10(50℃)，加2倍量85％乙醇，不斷攪拌，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度1.10(50℃)，用鹽酸調(diào)pH值至2，55℃保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值3～4，均分為3份。按條件進(jìn)行干燥，取干燥品測定提取物在不同條件下干燥后野黃芩苷的損失率，試驗(yàn)結(jié)果見下表。
不同干燥條件對野黃芩苷的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，在各干燥條件下野黃芩苷的轉(zhuǎn)移率無明顯差異，真空干燥速度快，干燥時間短，樣品質(zhì)地疏松，故選用60～80℃真空干燥。
4.2赤芍的提取工藝研究4.2.1煎煮工藝的正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)因素水平表設(shè)計(jì)加水量、煎煮時間、煎煮次數(shù)是影響煎煮效率的主要因素，按每個因素3水平，用L9(34)正交表安排試驗(yàn)。以芍藥苷提取率和固體物收率為考察指標(biāo)，對提取工藝進(jìn)行探討。
因素水平表

赤芍煎煮工藝條件L9(34)正交試驗(yàn)安排及結(jié)果


芍藥苷收率方差分析表

F0.05(2，2)＝19.00 F0.01(2，2)＝99.00。
總固體收率方差分析表

F0.05(2，2)＝19.00 F0.01(2，2)＝99.00。
結(jié)果分析從結(jié)果直觀分析，以芍藥苷收率為考察指標(biāo)時，各因素影響提取效率的順序?yàn)镃＞B＞A，其中提取次數(shù)和提取時間對提取工藝影響較大；方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)有極顯著性差異(P＜0.01)，提取時間有顯著性差異(P＜0.05)，兩者結(jié)論一致，最佳工藝條件為A3B2C3，在A因素中最佳工藝和次佳工藝的極差較小，從節(jié)省能源和時間的角度考慮，次佳工藝為A2B2C3。從結(jié)果直觀分析，以總固體收率為考察指標(biāo)時，各因素影響提取效率的順序?yàn)镃＞B＞A，其中提取次數(shù)和提取時間對提取工藝影響較大；方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)及提取時間有顯著性差異(P＜0.05)，兩者結(jié)論一致，最佳工藝條件為A2B2C3，此工藝條件與以芍藥苷收率為考察指標(biāo)的次佳工藝一致。綜合分析上述兩項(xiàng)考察指標(biāo)，以最佳工藝甲A3B2C3和乙A2B2C3進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)(結(jié)果見下表)。
正交試驗(yàn)重復(fù)結(jié)果

從結(jié)果可見，甲乙兩工藝的芍藥苷及總固體收率無明顯差異，從省工省時、降低能耗的角度，選擇乙工藝進(jìn)行生產(chǎn)。即加藥材重量8倍的水(第一次多加2倍量)，煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，適當(dāng)濃縮，備用。
4.2.2 赤芍提取液分離純化分離純化方法的選擇在赤芍水煎煮提取物中，除有效成分外，尚含許多雜質(zhì)成分，為保證產(chǎn)品的質(zhì)量和有利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制，需進(jìn)一步精制純化，盡可能地除去水提液中的大分子粘液質(zhì)、蛋白質(zhì)、淀粉及固體微粒等雜質(zhì)。試驗(yàn)曾采用乙醇沉淀、放置冷藏、離心、正丁醇萃取、過D101樹脂等提取方法處理，試驗(yàn)結(jié)果表明，用乙醇沉淀、正丁醇提取的方法純化樣品的綜合指標(biāo)好，主要成分的收率較高，產(chǎn)品質(zhì)量易控制。
4.2.2.1醇沉工藝的正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)因數(shù)水平表設(shè)計(jì)藥液的相對密度、醇沉濃度、放置時間是影響醇沉工藝的主要因素，按每個因素3水平，用L9(34)正交表安排試驗(yàn)。以芍藥苷轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，對醇沉工藝進(jìn)行考察。
因素水平表

樣品制備取相當(dāng)于100g生藥的水煎液9份，分別濃縮至所需濃度。按正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，藥液濾過，測定總體積。取樣測定芍藥苷濃度，計(jì)算芍藥苷量，以芍藥苷的轉(zhuǎn)移率為評價指標(biāo)進(jìn)行評價，結(jié)果見下表。
赤芍醇沉工藝條件L9(34)正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

方差分析表


F0.05(2，2)＝19.00 F0.01(2，2)＝99.00。
結(jié)果分析從結(jié)果直觀分析，各因素影響醇沉效率的順序?yàn)锽＞A＞C，其中相對密度和乙醇濃度對提取工藝影響較大；方差分析結(jié)果表明，相對密度和乙醇濃度有顯著性意義(P＜0.05)，兩者結(jié)論一致，最佳工藝條件為A1B3C1。在有顯著性影響的B因素中，最佳工藝和次佳工藝的極差較小，C因素極差較小，從節(jié)能省時考慮，故次佳工藝為A1B2C2。為進(jìn)一步證實(shí)該工藝的合理性，以最佳工藝A1B3C1和次佳工藝A1B2C2進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。
正交試驗(yàn)重復(fù)結(jié)果

結(jié)果可見，甲乙兩工藝的芍藥苷轉(zhuǎn)移率無明顯差異，而乙工藝有明顯的省時，低耗的優(yōu)點(diǎn)，選擇乙工藝進(jìn)行生產(chǎn)。即煎煮液濃縮至相對密度為1.07(50℃)、加乙醇使含醇量為60％，攪拌，放置12小時，濾過，濾液減壓回收乙醇，濃縮，備用。
4.2.2.2正丁醇分離提取條件考察赤芍中主要含單萜類和酚酸類化合物，該類化合物極性較大，精制純化應(yīng)選擇極性較大的有機(jī)溶劑。試驗(yàn)結(jié)果表明，正丁醇對上述成分具有較好的選擇性溶解，故選擇正丁醇進(jìn)行精制純化。
正丁醇提取次數(shù)的研究取本品600g，水煎煮濃縮乙醇沉淀處理，回收乙醇，濃縮至相對密度1.19(50℃、每毫升含生藥1.5克；pH4)，均分為4份，1份用于測定總固體物重、芍藥苷含量，另3份分別用1/2倍量水飽和的正丁醇各萃取5次，分取正丁醇液，測定芍藥苷含量和總固體物重，計(jì)算芍藥苷和總固體物轉(zhuǎn)移率，試驗(yàn)結(jié)果見下表。
試驗(yàn)結(jié)果表明，正丁醇萃取5次，總固體物轉(zhuǎn)移率為17.37％，芍藥苷總量轉(zhuǎn)移率大于97％，說明正丁醇提取可除去大量的雜質(zhì)。正丁醇萃取4次，芍藥苷總量的轉(zhuǎn)移率已達(dá)95％以上，總固體物轉(zhuǎn)移率為16.39％，正丁醇萃取5次，芍藥苷總量的轉(zhuǎn)移率僅增加1.55％，總固體物轉(zhuǎn)移率增加0.98％。為降低生產(chǎn)成本，減少工序，保證質(zhì)量，可確定用1/2倍量水飽和正丁醇提取4次。為進(jìn)一步考察正丁醇提取的效率，對正丁醇萃取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。
正丁醇萃取提取次數(shù)考察試驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

水洗正丁醇提取液對芍藥苷含量的影響在上述工藝處理過程中，樣品中仍殘留部分糖和無機(jī)鹽等極性較強(qiáng)的成分，為盡可能純化樣品，正丁醇液用少量水洗，試驗(yàn)結(jié)果表明，水洗后總固體物可降低12％左右，芍藥苷總量的保留率達(dá)95％以上。
正丁醇提取液水洗用量的考察取正丁醇提取驗(yàn)證試驗(yàn)提取液混勻，精密測定總固體物重、芍藥苷含量。取正丁醇提取液4份，每份200ml，分別用不同量的水洗1次，分取正丁醇液，測定芍藥苷和總固體物，計(jì)算保留率，試驗(yàn)結(jié)果見下表。
不同量水洗正丁醇液試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，用1/8倍量(25ml)水洗正丁醇液，芍藥苷總量的保留率較高，總固體物減少相對較多。
正丁醇提取液水洗次數(shù)的考察取正丁醇提取液3份，每份200ml，分別用1/8倍量的水洗3次，分取水層液，測定芍藥苷和總固體物損失率，試驗(yàn)結(jié)果見下表。
正丁醇液水洗次數(shù)試驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

試驗(yàn)結(jié)果表明，正丁醇液用水洗1次，總固體物降低較明顯，水洗2次后，總固體物變化較小，而芍藥苷累計(jì)損失相對較大，故可確定用1/8倍量水洗正丁醇液1次。
4.2.2.3除鞣質(zhì)方法的選擇赤芍中含有鞣質(zhì)，正丁醇提取樣品在未經(jīng)處理前的鞣質(zhì)檢查不合格，必須進(jìn)行除鞣質(zhì)處理。除鞣質(zhì)的方法主要有石灰乳法、聚酰胺法、明膠法、改良明膠法和堿性醇沉淀法、酸性沉淀法等，根據(jù)本品的特點(diǎn)，試驗(yàn)中曾采用明膠法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芍藥苷的損失率較大，除鞣質(zhì)效果不理想。鞣質(zhì)為多元酚化合物，易被聚酰胺吸附，且吸附力極強(qiáng)，不易被醇洗脫，因此，利用單萜苷和小分子酚酸類物質(zhì)在醇溶液中不易被聚酰胺吸附，而鞣質(zhì)在醇溶液中仍能被吸附的性質(zhì)與鞣質(zhì)分離。試驗(yàn)結(jié)果表明，該法去除中藥注射液中的鞣質(zhì)效果較好，有效成分損失少，樣品中的鞣質(zhì)檢查符合規(guī)定。在異常毒性試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)殘留鞣質(zhì)對小鼠的毒性較大，通過聚酰胺除鞣質(zhì)，可以使小鼠的異常毒性(無小鼠死亡)從傳統(tǒng)的除鞣質(zhì)方法的30倍增加到120倍(致死濃度的倍數(shù))，說明本品用聚酰胺去除鞣質(zhì)的方法可行。下面通過試驗(yàn)對聚酰胺除鞣質(zhì)的條件進(jìn)行考察樣品制備 取赤芍藥材，按制備工藝制備回收正丁醇后的殘留物，減壓干燥，粉碎，備用。
吸附容量的考察 取樣品3.10g，加45％乙醇溶解至120ml，分別各取20ml(約0.6g生藥/ml)加入已處理好聚酰胺1、2、3、4、5、6g，不時攪拌，靜態(tài)吸附3小時，濾過，濾液水浴揮至近干，殘?jiān)铀m量溶解，調(diào)pH至7，加水定容至10ml，濾過，取濾液1ml，加新配制的1％雞蛋清5ml，搖勻，放置10分鐘，觀察溶液渾濁或沉淀情況，結(jié)果見下表。
聚酰胺吸附容量考察結(jié)果

“+”表示有渾濁或沉淀，“±”表示有不明顯渾濁，“-”即表示無渾濁或沉淀。
試驗(yàn)結(jié)果表明，聚酰胺吸附容量小于每1g吸附4.0g生藥時，可去除樣品中的鞣質(zhì)，吸附容量＝上柱液中生藥量/聚酰胺干重。為保證產(chǎn)品的質(zhì)量，規(guī)定吸附容量為每3g生藥使用1g聚酰胺。
洗脫溶媒濃度的選擇 取樣品若干份，每份分別用l20ml15％、30％、45％、60％、75％乙醇溶解，上已處理好聚酰胺柱(24g，徑高比1∶6，Φ3cm)，分別用15％、30％、45％、60％、75％乙醇各360ml洗脫，洗脫速度2ml/min。自下口流出有色液時，收集洗脫液，洗脫液用相應(yīng)濃度的乙醇定容至600ml，取樣測定芍藥苷濃度和總固體物重。再取樣品溶液100ml，水浴揮至近干，殘?jiān)铀m量溶解，調(diào)pH至7，加水定容至10ml，濾過，分別取濾液依法進(jìn)行鞣質(zhì)檢查。
試驗(yàn)結(jié)果和洗脫曲線表明，芍藥苷量和總固體物重隨乙醇濃度的增大而增加，當(dāng)乙醇濃度增大至45％時，芍藥苷含量趨于平衡，芍藥苷轉(zhuǎn)移率達(dá)95％以上，說明45％乙醇可使芍藥苷有效解析；在此條件下總固體物重也趨于平衡，總固體物轉(zhuǎn)移率為77.27％，降低了22.73％，達(dá)到純化精制的目的；且低于60％乙醇洗脫液鞣質(zhì)檢查均為陰性，說明選擇小于60％乙醇洗脫，鞣質(zhì)未被解析下來。綜合考慮，洗脫溶媒濃度定為45％乙醇。
洗脫溶媒濃度選擇試驗(yàn)結(jié)果


吸附流速 取樣品若干份，每份3.10g(合生藥72g，固形物4.3％)，加45％乙醇溶解至120ml，上已處理好的聚酰胺柱(24g，徑高比1∶6，Φ3cm)，分別以0.5、1、1.5、2、2.5、3ml/mi n的流速進(jìn)行動態(tài)吸附，補(bǔ)加45％乙醇液洗脫，自下口流出有色液時收集洗脫液120ml。取洗脫液20ml，水浴揮至近干，殘?jiān)铀m量溶解，調(diào)pH至7，加水定容至10ml，濾過，分別取濾液依法進(jìn)行鞣質(zhì)檢查，結(jié)果見下表。
聚酰胺吸附流速考察結(jié)果

注濕柱體積(BV)是干樹脂重量的5倍。
吸附時間240、120、80、60、48、40min試驗(yàn)結(jié)果表明，吸附流速小于1.5ml/min(0.75BV/h)時，鞣質(zhì)被聚酰胺有效吸附，吸附流速大于2ml/min(1BV/h)時，流穿液中鞣質(zhì)檢查不合格，為保證產(chǎn)品質(zhì)量，吸附流速應(yīng)控制在1ml/min(即每小時0.5BV)，直至成分開始流出。
洗脫溶媒用量 取樣品若干份，每份分別用45％乙醇溶解至120ml，上已處理好聚酰胺柱(24g，徑高比1∶6，Φ3cm)，以1ml/min吸附流速進(jìn)行動態(tài)吸附，分別用120、240、360、480、600ml，45％乙醇為洗脫劑，以2ml/min的流速進(jìn)行動態(tài)洗脫，自下口流出有色液時，分別收集洗脫液，取樣測定芍藥苷量和總固體物重，計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見下表。
聚酰胺洗脫劑用量考察結(jié)果


試驗(yàn)結(jié)果表明，芍藥苷量和總固體物重隨45％乙醇用量的增大而增加，當(dāng)乙醇用量增大至3BV時，芍藥苷含量趨于平衡，芍藥苷轉(zhuǎn)移率達(dá)95％以上，說明3倍量45％乙醇可使芍藥苷解析基本完全；在此條件下總固體物重也趨于平衡，總固體物轉(zhuǎn)移率為76.51％，從提高工作效率和經(jīng)濟(jì)效率角度考慮，洗脫溶媒用量定為3倍柱體積45％乙醇。
洗脫流速 取樣品若干份，每份分別用45％乙醇溶解至120ml，上已處理好聚酰胺柱(24g，徑高比1∶6，Φ3cm)，以1ml/min吸附流速進(jìn)行動態(tài)吸附，用360ml(3BV)45％乙醇為洗脫劑，分別以1、2、3、4、5ml/min的流速進(jìn)行動態(tài)洗脫。收集洗脫液用45％乙醇定容至600ml，取樣測定芍藥苷濃度和總固體物重。取樣品溶液100ml，水浴揮至近干，殘?jiān)铀m量溶解，調(diào)pH至7，加水定容至10ml，濾過，分別取濾液依法進(jìn)行鞣質(zhì)檢查，結(jié)果見下表。
聚酰胺洗脫流速試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，洗脫流速為2ml/min(即1BV/h)時芍藥苷洗脫率和總固體物轉(zhuǎn)移率最高分別達(dá)96.78％、77.51％，隨洗脫流速加快而降低。洗脫流速大于3ml/min(即1.5BV/h)，芍藥苷洗脫率和總固體物轉(zhuǎn)移率下降明顯，而1ml/min、2ml/min洗脫流速的解析量無明顯差異，各洗脫流鞣質(zhì)檢查均為陰性，為縮短生產(chǎn)時間，提高生產(chǎn)效率，選用2ml/min(即1BV/h)的解析速度。
4.2.3赤芍半成品干燥方法的選擇取聚酰胺上柱工藝驗(yàn)證試驗(yàn)的剩余流穿液和洗脫液，合并，混勻，測定芍藥苷含量。取相當(dāng)于200g生藥的流穿液和洗脫液3份，分別減壓回收乙醇，殘留物按條件進(jìn)行干燥，取干燥品測定殘留物在不同條件下干燥后芍藥苷含量和總固體物重，計(jì)算芍藥苷損失率，試驗(yàn)結(jié)果見下表。
不同干燥條件對芍藥苷和總固體物的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，60～80℃真空干燥對芍藥苷的影響較小，損失率為1.5％左右，且真空干燥速度快，溫度低，樣品質(zhì)地疏松，易于粉碎，故選用60～80℃真空干燥。
4.3制劑成型工藝研究4.3.1附加劑選擇及其用量確定經(jīng)以甘露醇、葡萄糖、右旋糖苷對產(chǎn)品凍干劑的外觀性狀、色澤、疏松程度、是否有絨毛狀物質(zhì)形成等觀察比較，結(jié)果以加入一定量的甘露醇時，產(chǎn)品外觀形狀、成型性好，溶解性好，質(zhì)量穩(wěn)定，試驗(yàn)結(jié)果見下表。
填充劑加入量與凍干品成型的關(guān)系


試驗(yàn)結(jié)果表明，100ml藥液中加入甘露醇的量達(dá)到0.5g以上時，可保持樣品凍干前的體積和形狀，無硬殼，色澤好，不萎縮，樣品呈疏松多孔狀結(jié)構(gòu)，復(fù)水性好。從成品色澤、溶解性、成形性、經(jīng)濟(jì)等方面綜合考慮，故確定每處方量可加甘露醇10g。
4.3.2配液pH值確定本品處方中兩味藥材主要含黃酮類、單萜類、酚酸類化合物，在中性或堿性條件下溶解性較好，故在配液時調(diào)節(jié)適宜的pH值，有利于藥物的溶解，增加制劑的穩(wěn)定性，但pH值超過7.5時，藥液易變?yōu)闇\墨綠色，色澤加深，在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對配液時pH值的調(diào)節(jié)進(jìn)行了試驗(yàn)。
取提取物5份，每份10.0g(赤芍提取物7.20g，燈盞細(xì)辛提取物2.30g，甘露醇0.50g)，分別加注射用水60ml，攪拌用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)不同pH，使溶解，定容至100ml，加0.5％的活性碳，混勻煮沸滅菌30分鐘，放冷。用0.45μm和0.22μm微孔濾膜濾過，檢查滅菌后注射液的澄明度、色澤及pH值的變化，結(jié)果見下表。
不同pH值對注射劑澄明度及色澤的影響

注“+”表示不合格，“-”合格試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)配液pH值高于7.0以上時，注射劑澄明度均合格，配液pH值高于7.5以上時，藥液滅菌后色澤加深，易變?yōu)闇\墨綠色。滅菌后pH值下降0.6～1.0左右，故本品配液時pH值應(yīng)控制在6.50～7.50，成品pH值控制在5.50～7.0。
4.3.3冷凍干燥工藝4.3.3.1最低共熔點(diǎn)的測定為保證產(chǎn)品的質(zhì)量，預(yù)凍溫度應(yīng)控制在所測藥液低共熔點(diǎn)以下10～20℃左右，使溶劑、溶質(zhì)固化。最低共熔點(diǎn)采用電阻法測定。
最低共熔點(diǎn)的測定結(jié)果

從測定結(jié)果可知，本制劑的最低共熔點(diǎn)在-16℃。即在冷凍過程中，必須將物料預(yù)凍至-16℃以下，才能開始進(jìn)行升華干燥。
4.3.3.2預(yù)凍操作 預(yù)凍操作分為三個階段第一階段預(yù)凍至冰剛好形成的溫度，即平衡凍結(jié)溫度；第二階段預(yù)凍至產(chǎn)品的最低共熔溫度，使產(chǎn)品凍結(jié)；第三階段繼續(xù)降溫至最低共熔點(diǎn)溫度以下，使產(chǎn)品完全凍牢。預(yù)凍速度對產(chǎn)品的質(zhì)量有一定影響，因此，應(yīng)根據(jù)具體樣品對預(yù)凍三個階段的參數(shù)進(jìn)行測定，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，以指導(dǎo)生產(chǎn)。
凍結(jié)過程中擱板溫度、產(chǎn)品溫度與時間的關(guān)系

第一階段的平衡凍結(jié)溫度為0℃時的平衡時間為1.5小時，即擱板溫度與產(chǎn)品溫度基本一致的時間；第二階段凍結(jié)溫度從0℃到最低共熔溫度-16℃時，擱板溫度與產(chǎn)品溫度平衡時間為1.5小時；第三階段繼續(xù)降溫至-45℃，約需1.5小時，保持此溫度1.5小時，直至產(chǎn)品完全凍牢，即開始抽真空，進(jìn)入干燥程序。
4.3.3.3干燥程序 在恒溫下(-45℃)抽真空，使干燥室的氣壓降至13.332～266.64Pa，在此壓力下緩慢升溫(2～4℃/h)至最低共熔點(diǎn)溫度，時間約為12小時，升華干燥完成后，繼續(xù)在低壓條件下(13.332Pa)升溫干燥以除去殘余水分，時間約為12～15小時，保持35℃以上干燥3小時，記錄擱板溫度與產(chǎn)品溫度，繪制擱板溫度隨時間變化的曲線。
實(shí)驗(yàn)例3制劑藥效學(xué)研究(1)對血瘀模型家兔血液流變性的影響家兔40只，隨機(jī)分為4組，每組8只，♀♂各半，分別為空白對照組、模型對照組、陽性藥對照組及本發(fā)明注射液組。各組動物先耳緣靜脈注射(iv)給藥?？瞻准澳Ｐ蛯φ战M注射生理鹽水(NS)1ml/kg，陽性藥組iv葛根素注射液30mg/kg(以NS配成30mg/ml)，實(shí)驗(yàn)組分別注射0.25mg/ml的藥液(以NF配成)，給藥量均為1ml/kg，連續(xù)給藥兩周(14d)，于給藥的第2、13d，除空白對照組外，各兔分別經(jīng)耳緣靜脈注10％高分子右旋糖酐5ml/kg，每日兩次，造成血瘀模型。末次給藥后，再次注射10％高分子右旋糖酐5ml/kg，15min后，心臟采取空腹血6ml，進(jìn)行血液流變學(xué)指標(biāo)檢測，其中血小板聚集率用LBY-NJ2型血小板聚集儀，采用比濁法測定其它采用LBY-N6A+旋轉(zhuǎn)式錐板粘度儀測定。
對家兔血小板聚集和纖維蛋白原的影響(x±s，n＝6)組別劑量(mg/kg) 體重(kg) 血小板聚集(％) 纖維蛋白原(g/L)空白組 - 2.31±0.1515.54±2.46 2.53±1.16模型組 - 2.45±0.0838.27±15.05 2.73±1.41陽性藥組 30 2.37±0.1112.74±3.47 3.12±1.83本發(fā)明實(shí)驗(yàn)組 0.25 2.32±0.2414.80±1.36 2.69±2.32結(jié)果表明本發(fā)明制劑對血瘀型疾病療效好。
(2)對大鼠慢性肝損傷的作用健康Wistar大鼠，體重120～160g，隨機(jī)分為4組正常對照組、CCl4模型組、本發(fā)明粉針劑組。采用CCl4制備大鼠肝纖維化模型，秋水仙堿組、配伍組于造模的第1天開始給藥，均為灌胃給藥，本發(fā)明粉針劑3.40g/kg；正常對照組、CCl4模型組給予等量的0.9％NaCl溶液。各組動物于造模10w后斷頭處死。取血分離血清測定肝功能。
各組大鼠肝功能變化(x±s)組別 nALT(IU/L)Glb(ρB/g/L) Alb(ρB/g/L)正常組10 35.50±2.42 25.74±2.13 34.20±1.57模型組9115.27±11.2832.58±3.19 26.95±2.14本發(fā)明粉針劑組11 59.72±13.39 26.23±2.80 33.01±3.63結(jié)果表明，本發(fā)明制劑對大鼠慢性肝損傷有顯著改善作用。
具體的實(shí)施方式本發(fā)明的實(shí)施例1燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度50℃時1.09～1.11，加乙醇使含醇量達(dá)55％，不斷攪拌，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.10～1.12，用鹽酸調(diào)pH值至2，55℃保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值3～4，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度50℃時1.06～1.08，加乙醇使含醇量達(dá)60％，攪拌均勻，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.18～1.20，用1/2倍量水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加45％乙醇7500ml溶解，上聚酰胺柱，1500g，Φ12cm，徑高比1∶6，吸附流速0.5BV/h，BV-濕柱體積＝干樹脂重量的5倍體積，用45％乙醇22500ml洗脫，洗脫流速1BV/h，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物。
本發(fā)明的實(shí)施例2燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度50℃時1.09～1.11，加乙醇使含醇量達(dá)55％，不斷攪拌，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.10～1.12，用鹽酸調(diào)pH值至2，55℃保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值3～4，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度50℃時1.06～1.08，加乙醇使含醇量達(dá)60％，攪拌均勻，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.18～1.20，用1/2倍量水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加45％乙醇7500ml溶解，上聚酰胺柱，1500g，Φ12cm，徑高比1∶6，吸附流速0.5BV/h，BV-濕柱體積＝干樹脂重量的5倍體積，用45％乙醇22500ml洗脫，洗脫流速1BV/h，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物。
取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物和10g甘露醇，加1800ml注射用水，攪拌使溶解，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，加注射用水至2000ml，混勻，煮沸30分鐘，分裝于已處理好的輸液瓶中，塞入丁基橡膠塞及薄膜，軋鋁蓋，流通蒸汽滅菌30分鐘，冷藏24小時，在無菌條件下用0.45μm和0.22μm微孔濾膜濾過，濾液分裝，每瓶2.0ml，冷凍干燥，第一階段的平衡凍結(jié)溫度為0℃時的平衡時間為1.5小時，即擱板溫度與產(chǎn)品溫度基本一致的時間；第二階段凍結(jié)溫度從0℃到最低共熔溫度-16℃時，擱板溫度與產(chǎn)品溫度平衡時間為1.5小時；第三階段繼續(xù)降溫至-45℃，約需1.5小時，保持此溫度1.5小時，直至產(chǎn)品完全凍牢，即開始抽真空，進(jìn)入干燥程序，在45℃恒溫下-抽真空，使干燥室的氣壓降至13.332～266.64Pa，在此壓力下緩慢升溫，2～4℃/h，至最低共熔點(diǎn)溫度，時間約為12小時，升華干燥完成后，繼續(xù)在13.332Pa低壓條件下，升溫干燥以除去殘余水分，時間約為12～15小時，保持35℃以上干燥3小時，壓蓋，即得注射用無菌塊狀物，靜脈滴注，一次2支，一日1次，用250ml0.9％生理鹽水溶解后使用，每支裝200mg；以重量百分比計(jì)算，注射劑中黃酮類成分和苷類成分含量之和不低于制劑中扣除輔料量和水分量的總固體量的25％。
本發(fā)明的實(shí)施例3燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度50℃時1.09～1.11，加乙醇使含醇量達(dá)55％，不斷攪拌，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.10～1.12，用鹽酸調(diào)pH值至2，55℃保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值3～4，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度50℃時1.06～1.08，加乙醇使含醇量達(dá)60％，攪拌均勻，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.18～1.20，用1/2倍量水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加45％乙醇7500ml溶解，上聚酰胺柱，1500g，Φ12cm，徑高比1∶6，吸附流速0.5BV/h，BV-濕柱體積＝干樹脂重量的5倍體積，用45％乙醇22500ml洗脫，洗脫流速1BV/h，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物。
取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，加入適量注射用水溶解，按體積加入1.0％的活性炭，煮沸，保持微沸30min，稍冷濾過，濾液加注射用水至規(guī)定量，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，煮沸，4℃冷藏過夜，粗濾、精濾，加注射用水，分裝到安剖瓶，封口滅菌即得小容量注射液或注射用濃溶液。
本發(fā)明的實(shí)施例4燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g
燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度50℃時1.09～1.11，加乙醇使含醇量達(dá)55％，不斷攪拌，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.10～1.12，用鹽酸調(diào)pH值至2，55℃保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值3～4，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度50℃時1.06～1.08，加乙醇使含醇量達(dá)60％，攪拌均勻，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.18～1.20，用1/2倍量水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加45％乙醇7500ml溶解，上聚酰胺柱，1500g，Φ12cm，徑高比1∶6，吸附流速0.5BV/h，BV-柱體積＝干樹脂重量的5倍體積，用45％乙醇22500ml洗脫，洗脫流速1BV/h，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物。
取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，加入適量注射用水溶解，加入規(guī)定量的葡萄糖或氯化鈉，混合溶解后按體積加入1.0％的活性炭，煮沸，保持微沸30min，稍冷濾過，濾液加注射用水至規(guī)定量，再用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，煮沸，4℃冷藏過夜，粗濾、精濾，加注射用水，分裝，滅菌即得葡萄糖或氯化鈉靜脈輸液。
本發(fā)明的實(shí)施例5燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度50℃時1.09～1.11，加乙醇使含醇量達(dá)55％，不斷攪拌，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.10～1.12，用鹽酸調(diào)pH值至2，55℃保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值3～4，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度50℃時1.06～1.08，加乙醇使含醇量達(dá)60％，攪拌均勻，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.18～1.20，用1/2倍量水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加45％乙醇7500ml溶解，上聚酰胺柱，1500g，Φ12cm，徑高比1∶6，吸附流速0.5BV/h，BV-濕柱體積＝干樹脂重量的5倍體積，用45％乙醇22500ml洗脫，洗脫流速1BV/h，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物。
取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，加1800ml注射用水，攪拌使溶解，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，加注射用水至2000ml，混勻，煮沸30分鐘，分裝到搪瓷盤中，冷凍干燥，第一階段的平衡凍結(jié)溫度為0℃時的平衡時間為1.5小時，即擱板溫度與產(chǎn)品溫度基本一致的時間；第二階段凍結(jié)溫度從0℃到最低共熔溫度-16℃時，擱板溫度與產(chǎn)品溫度平衡時間為1.5小時；第三階段繼續(xù)降溫至-45℃，約需1.5小時，保持此溫度1.5小時，直至產(chǎn)品完全凍牢，即開始抽真空，進(jìn)入干燥程序，在45℃恒溫下-抽真空，使干燥室的氣壓降至13.332～266.64Pa，在此壓力下緩慢升溫，2～4℃/h，至最低共熔點(diǎn)溫度，時間約為12小時，升華干燥完成后，繼續(xù)在13.332Pa低壓條件下，升溫干燥以除去殘余水分，時間約為12～15小時，保持35℃以上干燥3小時，在無菌條件下分裝到西林瓶中，即得注射用無菌粉末。
本發(fā)明的實(shí)施例6燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度50℃時1.09～1.11，加乙醇使含醇量達(dá)55％，不斷攪拌，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.10～1.12，用鹽酸調(diào)pH值至2，55℃保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值3～4，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度50℃時1.06～1.08，加乙醇使含醇量達(dá)60％，攪拌均勻，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.18～1.20，用1/2倍量水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加45％乙醇7500ml溶解，上聚酰胺柱，1500g，Φ12cm，徑高比1∶6，吸附流速0.5BV/h，BV-濕柱體積＝干樹脂重量的5倍體積，用45％乙醇22500ml洗脫，洗脫流速1BV/h，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物。
取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，混勻，加入適量注射用水溶解，按體積加入1.0％的活性炭，煮沸，保持微沸30min，稍冷濾過，濾液加注射用水至規(guī)定量，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，煮沸，4℃冷藏過夜，粗濾、精濾，在進(jìn)風(fēng)溫度為150℃，出風(fēng)溫度為60℃，氣流速度為20m·s-1的條件下噴霧干燥得粉末，分裝，即得注射用無菌粉末。
本發(fā)明的實(shí)施例7燈盞細(xì)辛100g 赤芍9900g燈盞細(xì)辛加5倍量水煎煮0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)30％，不斷攪拌，靜置6小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用鹽酸調(diào)pH值，保溫，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加3倍量水煎煮0.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)40％，攪拌均勻，靜置6小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用水飽和的正丁醇提取1次，合并正丁醇液，用水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加乙醇溶解，上聚酰胺柱，用乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與赤芍提取物混合均勻，加入大豆油混勻，壓制法制丸，即得軟膠囊劑。
本發(fā)明的實(shí)施例8燈盞細(xì)辛9900g 赤芍100g燈盞細(xì)辛加12倍量水煎煮5次，每次2小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)80％，不斷攪拌，靜置24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用鹽酸調(diào)pH值，保溫，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加10倍量水煎煮5次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)80％，攪拌均勻，靜置24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用水飽和的正丁醇提取5次，合并正丁醇液，用水洗3次，減壓回收正丁醇，殘留物加乙醇溶解，上聚酰胺柱，用乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與赤芍提取物混合均勻，加入PEG400混勻，滴制法制丸，即得滴丸劑。
本發(fā)明的實(shí)施例9燈盞細(xì)辛2000g 赤芍8000g燈盞細(xì)辛加12倍量水煎煮5次，每次2小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)80％，不斷攪拌，靜置24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用鹽酸調(diào)pH值，保溫，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加10倍量水煎煮5次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)80％，攪拌均勻，靜置24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用水飽和的正丁醇提取5次，合并正丁醇液，用水洗3次，減壓回收正丁醇，殘留物加乙醇溶解，上聚酰胺柱，用乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與赤芍提取物混合均勻，加入2％羧甲基纖維素鈉，擠出-滾圓法制丸，即得微丸劑。
本發(fā)明的實(shí)施例10燈盞細(xì)辛8000g赤芍2000g燈盞細(xì)辛加5倍量水煎煮0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)30％，不斷攪拌，靜置6小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用鹽酸調(diào)pH值，保溫，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加3倍量水煎煮0.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)40％，攪拌均勻，靜置6小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用水飽和的正丁醇提取1次，合并正丁醇液，用水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加乙醇溶解，上聚酰胺柱，用乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與赤芍提取物混合均勻，，加入3％甲基纖維素，加水濕潤，制成顆粒，干燥，加入1％羧甲基淀粉鈉，壓片，即得分散片劑。
本發(fā)明的實(shí)施例11燈盞細(xì)辛100g 白芍9900g燈盞細(xì)辛加5倍量水煎煮0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)30％，不斷攪拌，靜置6小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用鹽酸調(diào)pH值，保溫，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；白芍加3倍量水煎煮0.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)40％，攪拌均勻，靜置6小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用水飽和的正丁醇提取1次，合并正丁醇液，用水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加乙醇溶解，上聚酰胺柱，用乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得白芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與白芍提取物混合均勻，制丸，即得丸劑。
本發(fā)明的實(shí)施例12燈盞細(xì)辛9900g 白芍100g燈盞細(xì)辛加12倍量水煎煮5次，每次2小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)80％，不斷攪拌，靜置24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用鹽酸調(diào)pH值，保溫，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；白芍加10倍量水煎煮5次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)80％，攪拌均勻，靜置24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用水飽和的正丁醇提取5次，合并正丁醇液，用水洗3次，減壓回收正丁醇，殘留物加乙醇溶解，上聚酰胺柱，用乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得白芍提取物，加入蒸餾水，即得口服液。
本發(fā)明的實(shí)施例13燈盞細(xì)辛2000g 白芍8000g燈盞細(xì)辛加12倍量水煎煮5次，每次2小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)80％，不斷攪拌，靜置24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用鹽酸調(diào)pH值，保溫，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；白芍加10倍量水煎煮5次，每次2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)80％，攪拌均勻，靜置24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用水飽和的正丁醇提取5次，合并正丁醇液，用水洗3次，減壓回收正丁醇，殘留物加乙醇溶解，上聚酰胺柱，用乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得白芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與白芍提取物混合均勻，制粒，即得顆粒劑。
本發(fā)明的實(shí)施例14燈盞細(xì)辛8000g 白芍2000g燈盞細(xì)辛加5倍量水煎煮0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)30％，不斷攪拌，靜置6小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用鹽酸調(diào)pH值，保溫，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；白芍加3倍量水煎煮0.5小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)40％，攪拌均勻，靜置6小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用水飽和的正丁醇提取1次，合并正丁醇液，用水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加乙醇溶解，上聚酰胺柱，用乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得白芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與白芍提取物混合均勻，加水濕潤，制成顆粒，裝膠囊，即得膠囊劑。
本發(fā)明的實(shí)施例15燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度50℃時1.09～1.11，加乙醇使含醇量達(dá)55％，不斷攪拌，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.10～1.12，用鹽酸調(diào)pH值至2，55℃保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值3～4，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度50℃時1.06～1.08，加乙醇使含醇量達(dá)60％，攪拌均勻，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.18～1.20，用1/2倍量水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加45％乙醇7500ml溶解，上聚酰胺柱，1500g，Φ12cm，徑高比1∶6，吸附流速0.5BV/h，BV-濕柱體積＝干樹脂重量的5倍體積，用45％乙醇22500ml洗脫，洗脫流速1BV/h，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物，混勻，乙醇制粒，即得顆粒劑。
本發(fā)明的實(shí)施例16燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度1.09～1.11(50℃)，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度1.06～1.08(50℃)，真空干燥，得赤芍提取物；將燈盞細(xì)辛提取物和赤芍提取物混合，制粒，壓片，即得片劑。
本發(fā)明的實(shí)施例17燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度1.09～1.11(50℃)，加乙醇醇沉兩次，第一次使含醇量達(dá)55％，第二次使含醇量達(dá)85％，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度1.10～1.12(50℃)，真空干燥得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度1.06～1.08(50℃)，加乙醇醇沉兩次，第一次使含醇量達(dá)50％，第二次使含醇量達(dá)80％，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度1.10～1.12(50℃)，真空干燥得赤芍提取物；將燈盞細(xì)辛提取物和赤芍提取物混合，加入糖漿，即得糖漿劑。
本發(fā)明的實(shí)施例18燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度1.09～1.11(50℃)，用鹽酸調(diào)pH值至4，加入等體積乙酸乙酯，萃取4次，合并乙酸乙酯，減壓回收溶劑，真空干燥得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加10倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度1.06～1.08(50℃)，用水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗1次，減壓回收正丁醇，真空干燥得赤芍提取物；將燈盞細(xì)辛提取物和赤芍提取物混合，加入煉蜜，制丸，即得丸劑。
本發(fā)明的實(shí)施例18燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，過AB-8大孔樹脂柱，先用6倍樹脂體積水和4倍樹脂體積10％乙醇沖洗，再用5倍樹脂體積50％乙醇解吸，收集解吸液，減壓回收乙醇，真空干燥得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加10倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，過ZTC-1型大孔樹脂柱，先用4倍樹脂體積水和3倍樹脂體積10％乙醇沖洗，再用5倍樹脂體積60％乙醇解吸，收集解吸液，減壓回收乙醇，真空干燥得赤芍提取物；將燈盞細(xì)辛提取物和赤芍提取物混合，加入蒸餾水，即得口服液。
本發(fā)明的實(shí)施例19燈盞細(xì)辛3000g 赤芍4500g燈盞細(xì)辛加10倍量80％乙醇回流提取3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇濃縮至相對密度1.09～1.11(50℃)，真空干燥得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加10倍量70％乙醇回流提取3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇濃縮至相對密度1.09～1.11(50℃)，真空干燥得赤芍提取物；將燈盞細(xì)辛提取物和赤芍提取物混合，制粒，即得顆粒劑。
燈盞細(xì)辛提取物可以是黃酮類成分含量大于90％的總黃酮有效部位或者按本發(fā)明制備方法制的或者市售的，赤芍提取物可以是苷類成分含量大于90％的總苷有效部位或者按本發(fā)明制備方法制的或者市售的。
權(quán)利要求
1.一種治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑，其特征在于按照重量百分比計(jì)算，它是由燈盞細(xì)辛1～99％和赤芍99～1％和適當(dāng)?shù)妮o料制作而成。
2.按照權(quán)利要求1所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑，其特征在于按照重量百分比計(jì)算，它是由燈盞細(xì)辛20～80％和赤芍80～20％和適當(dāng)?shù)妮o料制作而成。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑，其特征在于按照重量百分比計(jì)算，它是由赤芍60％與燈盞細(xì)辛40％和適當(dāng)?shù)妮o料制作而成。
4.按照權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑，其特征在于所述組方中的赤芍與燈盞細(xì)辛可以是藥材或者是由相應(yīng)比例藥材制備得到的提取物，其中燈盞細(xì)辛提取物可以是燈盞細(xì)辛醇提取物、燈盞細(xì)辛水提取物、燈盞細(xì)辛水提醇沉提取物、燈盞細(xì)辛半仿生提取物、燈盞細(xì)辛超臨界萃取物或者以上各提取物的精制品；赤芍提取物可以是赤芍醇提取物、赤芍水提取物、赤芍水提醇沉提取物、赤芍半仿生提取物、赤芍超臨界萃取物或者以上各提取物的精制品。
5.按照權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑，其特征在于所述的制劑為直接用于注射給藥的注射液、直接供靜脈滴注的靜脈輸液、需稀釋后用于靜脈滴注的注射用濃溶液和用冷凍干燥法或噴霧干燥法制得的注射用無菌粉末和無菌塊狀物以及片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑、丸劑、軟膠囊劑、口服液體制劑、口腔崩解片或分散片劑。
6.按照權(quán)利要求1～5中任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑，其特征在于制劑中含有黃酮類成分和苷類成分，以重量百分比計(jì)算，注射劑中黃酮類成分和苷類成分含量之和不低于制劑中扣除輔料量和水分量的總固體量的25％。
7.按照權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑，其特征在于燈盞細(xì)辛提取物可以是黃酮類成分含量大于90％的總黃酮有效部位，赤芍提取物可以是苷類成分含量大于90％的總苷有效部位。
8.按照權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑，其特征在于用等量的白芍及白芍提取物替代赤芍及赤芍提取物。
9.如權(quán)利要求1～5中任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑的制備方法，其特征在于取赤芍藥材，粉碎后加入水或乙醇溶液提取，合并提取液，過濾，濃縮得赤芍粗提物，或在此基礎(chǔ)上采用乙醇沉淀法、柱層析法、萃取法、絮凝沉淀法中的一種或幾種聯(lián)合使用進(jìn)行適當(dāng)精制，得赤芍精提物；取燈盞細(xì)辛藥材，粉碎后加入水或乙醇溶液提取，合并提取液，過濾，濃縮得燈盞細(xì)辛粗提物，或在此基礎(chǔ)上采用乙醇沉淀法、柱層析法、萃取法、絮凝沉淀法中的一種或幾種聯(lián)合使用進(jìn)行適當(dāng)精制，得燈盞細(xì)辛精提物，將燈盞細(xì)辛粗提物或精提物與赤芍粗提物或精提物混合均勻，加輔料制成不同的制劑。
10.按照權(quán)利要求9所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑的制備方法，其特征在于燈盞細(xì)辛加5～12倍量水煎煮1～5次，每次0.5～2小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)30～80％，不斷攪拌，靜置6～24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用鹽酸調(diào)pH值，保溫，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加3～10倍量水煎煮1～5次，每次0.5～2小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加乙醇使含醇量達(dá)40～80％，攪拌均勻，靜置6～24小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮，用水飽和的正丁醇提取1～5次，合并正丁醇液，用水洗1～3次，減壓回收正丁醇，殘留物加乙醇溶解，上聚酰胺柱，用乙醇洗脫，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與赤芍提取物混合均勻，加輔料制成不同的制劑。
11.按照權(quán)利要求10所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑的制備方法，其特征在于燈盞細(xì)辛加10倍量水煎煮3次，每次0.5小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至相對密度50℃時1.09～1.11，加乙醇使含醇量達(dá)55％，不斷攪拌，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.10～1.12，用鹽酸調(diào)pH值至2，55℃保溫6小時，傾棄上清液，抽濾，沉淀用水洗至pH值3～4，真空干燥，得燈盞細(xì)辛提取物；赤芍加8倍量水煎煮3次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓濃縮至相對密度50℃時1.06～1.08，加乙醇使含醇量達(dá)60％，攪拌均勻，靜置12小時，抽濾，濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度50℃時1.18～1.20，用1/2倍量水飽和的正丁醇提取4次，合并正丁醇液，用1/8倍量水洗1次，減壓回收正丁醇，殘留物加45％乙醇7500ml溶解，上聚酰胺柱，1500g，Φ12cm，徑高比1∶6，吸附流速0.5BV/h，BV-濕柱體積＝干樹脂重量的5倍體積，用45％乙醇22500ml洗脫，洗脫流速1BV/h，收集流穿液和洗脫液，回收乙醇，殘留物真空干燥，得赤芍提取物，將燈盞細(xì)辛提取物與赤芍提取物混合均勻，加輔料制成不同的制劑。
12.按照權(quán)利要求9～11中任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑的制備方法，其特征在于所述制劑中的注射用無菌塊狀物這樣制備取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物和10g甘露醇，加1800ml注射用水，攪拌使溶解，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，加注射用水至2000ml，混勻，煮沸30分鐘，分裝于已處理好的輸液瓶中，塞入丁基橡膠塞及薄膜，軋鋁蓋，流通蒸汽滅菌30分鐘，冷藏24小時，在無菌條件下用0.45μm和0.22μm微孔濾膜濾過，濾液分裝，每瓶2.0ml，冷凍干燥，第一階段的平衡凍結(jié)溫度為0℃時的平衡時間為1.5小時，即擱板溫度與產(chǎn)品溫度基本一致的時間；第二階段凍結(jié)溫度從0℃到最低共熔溫度-16℃時，擱板溫度與產(chǎn)品溫度平衡時間為1.5小時；第三階段繼續(xù)降溫至-45℃，約需1.5小時，保持此溫度1.5小時，直至產(chǎn)品完全凍牢，即開始抽真空，進(jìn)入干燥程序，在45℃恒溫下-抽真空，使干燥室的氣壓降至13.332～266.64Pa，在此壓力下緩慢升溫，2～4℃/h，至最低共熔點(diǎn)溫度，時間約為12小時，升華干燥完成后，繼續(xù)在13.332Pa低壓條件下，升溫干燥以除去殘余水分，時間約為12～15小時，保持35℃以上干燥3小時，壓蓋，即得。
13.按照權(quán)利要求9～11中任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑的制備方法，其特征在于所述制劑中的注射液和注射用濃溶液這樣制備取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，加入適量注射用水溶解，按體積加入1.0％的活性炭，煮沸，保持微沸30min，稍冷濾過，濾液加注射用水至規(guī)定量，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，煮沸，4℃冷藏過夜，粗濾、精濾，加注射用水，分裝到安剖瓶，封口滅菌，即得。
14.按照權(quán)利要求9～11中任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑的制備方法，其特征在于所述制劑中的葡萄糖或氯化鈉靜脈輸液這樣制備取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，加入適量注射用水溶解，加入規(guī)定量的葡萄糖或氯化鈉，混合溶解后按體積加入1.0％的活性炭，煮沸，保持微沸30min，稍冷濾過，濾液加注射用水至規(guī)定量，再用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，煮沸，4℃冷藏過夜，粗濾、精濾，加注射用水，分裝，滅菌即得。
15.按照權(quán)利要求9～11中任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑的制備方法，其特征在于所述制劑中的注射用無菌粉末這樣制備取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，加1800ml注射用水，攪拌使溶解，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，加注射用水至2000ml，混勻，煮沸30分鐘，分裝到搪瓷盤中，冷凍干燥，第一階段的平衡凍結(jié)溫度為0℃時的平衡時間為1.5小時，即擱板溫度與產(chǎn)品溫度基本一致的時間；第二階段凍結(jié)溫度從0℃到最低共熔溫度-16℃時，擱板溫度與產(chǎn)品溫度平衡時間為1.5小時；第三階段繼續(xù)降溫至-45℃，約需1.5小時，保持此溫度1.5小時，直至產(chǎn)品完全凍牢，即開始抽真空，進(jìn)入干燥程序，在45℃恒溫下-抽真空，使干燥室的氣壓降至13.332～266.64Pa，在此壓力下緩慢升溫，2～4℃/h，至最低共熔點(diǎn)溫度，時間約為12小時，升華干燥完成后，繼續(xù)在13.332Pa低壓條件下，升溫干燥以除去殘余水分，時間約為12～15小時，保持35℃以上干燥3小時，在無菌條件下分裝到西林瓶中，即得。
16.按照權(quán)利要求9～11中任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑的制備方法，其特征在于所述制劑中的注射用無菌粉末還可以這樣制備取燈盞細(xì)辛提取物、赤芍提取物，混勻，加入適量注射用水溶解，按體積加入1.0％的活性炭，煮沸，保持微沸30min，稍冷濾過，濾液加注射用水至規(guī)定量，用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.0～7.5，煮沸，4℃冷藏過夜，粗濾、精濾，在進(jìn)風(fēng)溫度為150℃，出風(fēng)溫度為60℃，氣流速度為20m·s-1的條件下噴霧干燥得粉末，分裝，即得。
17.如權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑的應(yīng)用，其特征在于所述的制劑用于制備治療肝腎綜合癥、心肺病、糖尿病及其并發(fā)癥等疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療心腦血管疾病的復(fù)方燈盞細(xì)辛制劑及其制備方法和應(yīng)用，它是由燈盞細(xì)辛1～99％、赤芍99～1％和適當(dāng)?shù)妮o料制作而成的，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方遵“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)之滅”之理，采取活血化淤通絡(luò)之法，以性味苦溫的燈盞細(xì)辛為君，用之化淤通絡(luò)；赤芍味苦微寒，入血分，涼血熱，散淤血，通經(jīng)絡(luò)，治血熱淤滯，助君藥以達(dá)活血化淤、散淤通絡(luò)之效，用之為臣；二藥合用具有活血化淤，通經(jīng)活絡(luò)的功能。組方有用藥精簡力專、作用途徑直接之長，無偏溫偏涼之弊，有較為明顯的用藥特色，通過合理可行的制備工藝，保證了產(chǎn)品的安全有效，可供病人長期使用。
文檔編號A61K36/28GK1762434SQ20051010625
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月24日
發(fā)明者于文勇 申請人:貴陽云巖西創(chuàng)藥物科技開發(fā)有限公司