專(zhuān)利名稱：使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)在含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們，使骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的一種方法，以及含有神經(jīng)細(xì)胞作為有效成分用于治療神經(jīng)疾病的組合物。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞具有在培養(yǎng)中無(wú)限分裂的能力并且在特異性的分化刺激物的刺激下產(chǎn)生構(gòu)成組織的特化細(xì)胞。
根據(jù)它們的分化潛能，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和組織特異性干細(xì)胞。ES細(xì)胞是在胚泡期從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)分離而來(lái)，并且是多潛能的，即它們實(shí)際上能夠分化為在生物中發(fā)現(xiàn)的全部類(lèi)型的細(xì)胞。
相反，組織特異性干細(xì)胞在胚胎發(fā)育過(guò)程中器官形成的階段出現(xiàn)，并且它們是器官特異性的和多能的，即它們通常定向產(chǎn)生構(gòu)成特定器官的細(xì)胞。這些組織特異性干細(xì)胞在大多數(shù)成年人器官中保留并履行不斷補(bǔ)充正常或病理性發(fā)生的細(xì)胞損失的關(guān)鍵任務(wù)。代表性的組織特異性干細(xì)胞包括在骨髓中存在的造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。造血干細(xì)胞產(chǎn)生各種血細(xì)胞如紅細(xì)胞和白細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)締組織細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞。
近來(lái)，由于人胚胎干細(xì)胞的成功分離，干細(xì)胞的臨床應(yīng)用已經(jīng)吸引越來(lái)越多的興趣。干細(xì)胞最值得注意的潛在應(yīng)用是它們作為用于細(xì)胞置換治療的細(xì)胞供應(yīng)的理想來(lái)源。幾乎不可治愈的疾病，例如神經(jīng)變性疾病如帕金森氏病和阿爾茨海默氏病，由骨髓損傷，白血病，中風(fēng)，幼年發(fā)作性糖尿病，心梗塞和肝硬變引起的四肢麻痹，是由于構(gòu)成器官的細(xì)胞的破壞和永久性功能失調(diào)所導(dǎo)致，其中從外部補(bǔ)充細(xì)胞的損失的細(xì)胞置換治療已經(jīng)作為一種有效治療出現(xiàn)。
然而，盡管細(xì)胞置換治療的明顯益處，在它的臨床應(yīng)用中存在許多限制。具體地，其中將從供體組織分離的完全分化的細(xì)胞移植于患者中的常規(guī)方法，有難以獲得足夠量的提供給患者的細(xì)胞的問(wèn)題。為了解決該問(wèn)題，在細(xì)胞置換治療中可使用從分離的胚胎干細(xì)胞分化而來(lái)的特定組織的細(xì)胞或從分離的和增殖的組織特異性干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞。
到目前為止，已經(jīng)證明小鼠胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)皿上可以分化為各種細(xì)胞如造血細(xì)胞，心肌細(xì)胞，分泌胰島素的胰細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。另外，幾個(gè)報(bào)道已經(jīng)證明，從干細(xì)胞分化的細(xì)胞的移植在由細(xì)胞損失導(dǎo)致的疾病的治療中有效。例如，當(dāng)將從胚胎干細(xì)胞分化的合成髓鞘質(zhì)的少突膠質(zhì)細(xì)胞移植于小鼠中時(shí)，小鼠中的髓鞘質(zhì)的合成增加(Brustle等，Science，285754-756，1999)。通過(guò)將從胚胎干細(xì)胞分化的分泌胰島素的細(xì)胞移植于糖尿病小鼠模型中調(diào)節(jié)血糖水平(Soria等，Diabetes，49157-162，2000)。另外，通過(guò)將由胚胎干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞移植于有骨髓損傷的小鼠中顯著地治療了由骨髓損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙(McDonald等，Nat.Med.，5(12)1410-1412，1999)。
然而，由于只是最近才成功分離出人胚胎干細(xì)胞，并且沒(méi)有關(guān)于胚胎干細(xì)胞在培養(yǎng)皿上分化為除了神經(jīng)細(xì)胞以外的其它特化細(xì)胞的報(bào)道，由胚胎干細(xì)胞分化的特異性的組織細(xì)胞在細(xì)胞置換治療中的臨床應(yīng)用還保持在一個(gè)可能性的水平上。
另外，由于從胚胎干細(xì)胞分化為靶細(xì)胞的效率低，在移植中有由和靶細(xì)胞混合的其它細(xì)胞導(dǎo)致的有害副作用的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為了從胚胎干細(xì)胞分化的細(xì)胞更安全的臨床應(yīng)用，存在開(kāi)發(fā)一種精確分化方法的需要。
另一方面，在當(dāng)組織特異性干細(xì)胞被用于細(xì)胞置換治療中的情形下，在長(zhǎng)期培養(yǎng)中，可能出現(xiàn)細(xì)胞增殖能力降低或分化為不利的細(xì)胞的問(wèn)題。另外，為了治療神經(jīng)變性疾病如帕金森氏病需要移植神經(jīng)細(xì)胞。因?yàn)橹苯訌幕颊攉@得神經(jīng)干細(xì)胞是困難的，它們通常通過(guò)培養(yǎng)從死胎腦組織分離的神經(jīng)干細(xì)胞并且使它們分化為神經(jīng)細(xì)胞而獲得。然而，胎腦的使用引起倫理問(wèn)題并且被不充足的供應(yīng)所限制，并且可能導(dǎo)致免疫排斥。另外，大部分的神經(jīng)干細(xì)胞易于分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞而不是神經(jīng)元。
因此，如果可能使在患者自身骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為在細(xì)胞置換治療中使用的神經(jīng)細(xì)胞，可以很容易地供應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞并且象免疫排斥的問(wèn)題在治療中將不會(huì)出現(xiàn)。
到目前為止，已認(rèn)為一種類(lèi)型的干細(xì)胞只分化為屬于一個(gè)特定系統(tǒng)的組織細(xì)胞。據(jù)報(bào)道在各種生長(zhǎng)因子如血小板衍生生長(zhǎng)因子，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的存在下，間充質(zhì)干細(xì)胞體外形成集落(Kuznetsov等，Br.J.Haematol.，97561，1997；和van den Bos C.等，Human Cell，1045，1997)，并且大約三分之一的原始貼壁細(xì)胞具有多潛能性，從而分化為結(jié)締組織細(xì)胞如成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞(Pittenger MF等，Science，284143，1999)。另外，F(xiàn)errari G.等報(bào)道骨髓是形成新肌的生肌前體細(xì)胞的來(lái)源(Science，2791528，1998)。
最近的研究報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞還能分化為神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。例如，Sanchez-Ramos等報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞在視黃酸和腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的存在下經(jīng)培養(yǎng)分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞(Exp.Neurology，164247-256，2000)。Dale Woodbury等報(bào)道在骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞在抗氧化劑如β-巰基乙醇和二甲基亞砜(DMSO)的存在下分化為神經(jīng)細(xì)胞(J.Neuro.Res.，61364-370，2000)。然而，強(qiáng)分化誘導(dǎo)試劑如DMSO的使用在臨床應(yīng)用中可能導(dǎo)致問(wèn)題。
本發(fā)明者已努力發(fā)現(xiàn)高度安全和能夠使骨髓中的干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的物質(zhì)，并且已發(fā)現(xiàn)HGF促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，還發(fā)現(xiàn)將EGF和bFGF加入培養(yǎng)基中，與HGF一起，不但顯著地促進(jìn)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，而且增強(qiáng)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞的擴(kuò)增。
已報(bào)道當(dāng)將它們加入到用于培養(yǎng)從腦組織分離的神經(jīng)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基中時(shí)，EGF和bFGF刺激神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞(Melissa等，Exp.Neurology，158265-278，1999)。
已報(bào)道HGF增強(qiáng)在海馬和中腦中的神經(jīng)元的生存力，并且誘導(dǎo)在新大腦皮質(zhì)移植(neocortical explant)中軸突的生長(zhǎng)(Hamanoue M等，J.Neurosci.Res.，43554-564，1996)。另外，在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中，它作為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存因子起作用(Ebens A等，Neuron，171157-1172，1996)，并且參與感覺(jué)神經(jīng)元和副交感神經(jīng)元的生長(zhǎng)和生存(Fleur Davey等，Mol.Cell Neurosci.，1579-87，2000)。
然而，尚未報(bào)道通過(guò)在含有EGF，bFGF和HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)它們，能夠使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞或單核細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過(guò)所述方法分化的神經(jīng)細(xì)胞和一種包括神經(jīng)細(xì)胞作為有效成分的用于治療神經(jīng)疾病的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于治療哺乳動(dòng)物中神經(jīng)疾病的方法，其包括將通過(guò)上述方法生產(chǎn)的神經(jīng)細(xì)胞施用于需要其的受治療者。
因此，依照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種用于使骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其包括在含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。


本發(fā)明上述和其它的目的和特征從結(jié)合下述附圖的本發(fā)明的下述描述中將變得明顯，其中所述附圖分別表示圖1來(lái)源于在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周的骨髓單核細(xì)胞的貼壁細(xì)胞的顯微照片(×100；以下，使用相同的放大率)；圖2從在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周的骨髓單核細(xì)胞分化來(lái)的神經(jīng)細(xì)胞的顯微照片；圖3A和3B分別為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞顯微照片，其是從圖2的神經(jīng)細(xì)胞分離而來(lái)；圖4A到4C圖2分化的神經(jīng)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，其中圖4A是NSE-陽(yáng)性細(xì)胞；圖4B，NeuN-陽(yáng)性細(xì)胞和圖4C，GFAP-陽(yáng)性細(xì)胞
圖5A至圖5C分別為從間充質(zhì)干細(xì)胞分化的成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的顯微照片；圖6在其接種在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培養(yǎng)基上之后即刻拍攝的間充質(zhì)干細(xì)胞的顯微照片；圖7由在含有10ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和20ng/ml HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周的間充質(zhì)干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞的顯微照片；圖8A至8C圖7分化的神經(jīng)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，其中圖8A是NSE-陽(yáng)性細(xì)胞；圖8B，NeuU-陽(yáng)性細(xì)胞和圖8C，GFAP-陽(yáng)性細(xì)胞。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種使從骨髓分離的間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其包括在含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。
另外，還提供通過(guò)所述方法分化的神經(jīng)細(xì)胞和一種包括神經(jīng)細(xì)胞作為有效成分用于治療神經(jīng)疾病的藥物組合物。
如在此使用，術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)細(xì)胞”指包括神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的類(lèi)神經(jīng)細(xì)胞(nerve-like cell)。
為了使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞，優(yōu)選在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞超過(guò)一周時(shí)間，所述培養(yǎng)基含有1-1,000ng/ml，優(yōu)選5-10ng/ml的EGF，1-1000ng/ml，優(yōu)選10-20ng/ml的bFGF和1-1000ng/ml，優(yōu)選5-20ng/ml的HGF。更優(yōu)選培養(yǎng)干細(xì)胞超過(guò)4周時(shí)間。在培養(yǎng)開(kāi)始大約4周后，形成幾個(gè)細(xì)胞組成的神經(jīng)細(xì)胞集落，在大約8周后，通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞集落的連續(xù)生長(zhǎng)和增殖產(chǎn)生大量的神經(jīng)細(xì)胞。
相反，如果在相同但缺少HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞不能分化為神經(jīng)細(xì)胞。另外，如果只用HGF處理它們，早期分化發(fā)生，因而抑制增殖。該結(jié)果暗示在培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞以獲得神經(jīng)細(xì)胞的本發(fā)明的方法中，EGF和bFGF刺激細(xì)胞增殖，HGF刺激干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞。另外，當(dāng)只使用所述因子的一種時(shí)不能獲得充足量的神經(jīng)細(xì)胞。
在8-周的培養(yǎng)后一旦神經(jīng)細(xì)胞完全分化和增殖，即使在只用EGF和bFGF處理的時(shí)候，它們也可以進(jìn)一步增殖而不丟失它們作為神經(jīng)細(xì)胞的獨(dú)特特征。在另一方面，如果只用HGF隨后處理完全分化和增殖的神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞繼續(xù)分化而不增殖，因此，細(xì)胞量減少。因此，在培養(yǎng)8周后，優(yōu)選通過(guò)在含有EGF和bFGF的培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)它們以使神經(jīng)細(xì)胞增殖。
依照使用EGF，bFGF和HGF的本方法，大于80％的總分化細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞，基于細(xì)胞量，其包含60-80％，優(yōu)選65-75％的神經(jīng)元和20-40％，優(yōu)選25-35％的星形膠質(zhì)細(xì)胞，并且不含有小膠質(zhì)細(xì)胞。
在本發(fā)明中，間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選從人骨髓獲得。源于骨髓的單核細(xì)胞包含造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)它們1-2周時(shí)，造血干細(xì)胞容易地分化為成熟血細(xì)胞。因此，此后增殖的干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞，其在20代的傳代培養(yǎng)后繼續(xù)增殖。間充質(zhì)干細(xì)胞分化為包括成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的各種結(jié)締組織細(xì)胞。
此外，當(dāng)在本發(fā)明方法中使用包含間充質(zhì)干細(xì)胞的骨髓單核細(xì)胞代替分離的間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，還可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的大量生產(chǎn)。
由于神經(jīng)細(xì)胞是通過(guò)使用在人體內(nèi)存在的特異的蛋白質(zhì)，即EGF，bFGF和HGF，而未使用有害的分化誘導(dǎo)物如DMSO，由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)，本方法特別在安全方面是有利的。另外，因?yàn)閺幕颊咦陨砉撬杩梢援a(chǎn)生對(duì)于疾病治療足夠量的神經(jīng)細(xì)胞，由于神經(jīng)細(xì)胞迅速的有效性和降低的免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)，它的臨床應(yīng)用將是可行的。
依照本發(fā)明從間充質(zhì)干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞可以作為一種細(xì)胞組合物的活性成分使用，該組合物用于神經(jīng)疾病的細(xì)胞置換治療?？梢酝ㄟ^(guò)使用本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞治療的神經(jīng)疾病的非限制性實(shí)施例包括神經(jīng)變性疾病如帕金森氏病，阿爾茨海默氏病，皮克病，亨廷頓舞蹈病，肌萎縮性側(cè)索硬化和局部缺血性腦病。本發(fā)明的神經(jīng)細(xì)胞還可以用于由神經(jīng)細(xì)胞的異常損失導(dǎo)致的各種疾病以及由脊髓損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙的治療。
通過(guò)將用本發(fā)明方法分化的神經(jīng)細(xì)胞和藥用賦形劑或載體混和，或通過(guò)按照任何常規(guī)程序使用藥用稀釋劑將其稀釋?zhuān)梢灾苽溆糜陬A(yù)防或治療神經(jīng)疾病的細(xì)胞組合物。合適載體，賦形劑和稀釋劑的實(shí)例是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤蘚糖醇，麥芽糖醇，淀粉，阿拉伯膠，藻酸鹽，明膠，磷酸鈣，硅酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羥基苯甲酸甲酯類(lèi)，羥基苯甲酸丙酯類(lèi)，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。制劑可另外包括填料，抗凝集劑，潤(rùn)滑劑，濕潤(rùn)劑，香料，乳化劑，防腐劑等。可通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的任何程序來(lái)配制本發(fā)明的藥物組合物，以便在將它們對(duì)哺乳動(dòng)物給藥后，提供活性成分的迅速，持續(xù)或延遲的釋放。因此，制劑可以是無(wú)菌的注射液，混懸液，乳劑，溶液等形式，其中無(wú)菌注射液是優(yōu)選的。
因此，本發(fā)明還提供一種在哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)疾病的方法，其包括以治療疾病有效的量對(duì)需要其的受試者給藥用本發(fā)明方法生產(chǎn)的神經(jīng)細(xì)胞。
通過(guò)任何常規(guī)方法可以將通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的神經(jīng)細(xì)胞注射于患者內(nèi)。例如，可使用Douglas Kondziolka的方法(D.Kondziolka等，Neurology55556-569，2000)。具體地，將患者的顱骨切除以產(chǎn)生一個(gè)具有大約1cm直徑的孔，將含有神經(jīng)細(xì)胞的HBSS(Hank’s平衡鹽溶液)注射于大約3個(gè)位點(diǎn)。注射是通過(guò)用于將所需的細(xì)胞溶液在正確位置注射于腦的深層部分的具有長(zhǎng)針頭和立體定位支架的注射器進(jìn)行的?？梢酝ㄟ^(guò)包括透皮，皮下，靜脈內(nèi)和肌內(nèi)輸入，外科定向輸入，通過(guò)血管導(dǎo)管插入術(shù)的損害內(nèi)的輸入的各種途徑給藥本發(fā)明的細(xì)胞組合物。
神經(jīng)細(xì)胞的典型單位劑量可從1×106細(xì)胞至1×109細(xì)胞變化，并且可每周或每月給藥。然而，應(yīng)該理解實(shí)際給藥的活性成分的量應(yīng)該根據(jù)各種相關(guān)因素確定，所述因素包括待治療的疾病，患者癥狀的嚴(yán)重程度，選擇的給藥途徑，個(gè)體患者的年齡，性別和體重；因此，上述劑量不應(yīng)該是想以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
下列實(shí)施例是打算進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明而不限制其范圍。
另外，下面給出的對(duì)于固體在固體混合物中，液體在液體中和固體在液體中的百分比是分別基于重量/重量(wt/wt)，體積/體積(vol/vol)和重量/體積(wt/vol)，并且除非特別另外說(shuō)明，所有的反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
實(shí)施例1分離骨髓中的單核細(xì)胞從每個(gè)健康志愿者的骨盆取大約10ml的骨髓，并保存在含肝素的玻璃管中。將30ml磷酸緩沖鹽水(PBS)加至10ml骨髓中，將20ml得到的混合物緩慢轉(zhuǎn)移至10ml Ficoll-PaqueTM plus溶液(1.077g/ml，Amersham Pharmacia Biotech)之上，并在2000rpm進(jìn)行密度梯度離心20分鐘。回收位于頂層和Ficoll-PaqueTM plus層之間界面的單核細(xì)胞層，并在1800rpm進(jìn)行離心5分鐘以獲得單核細(xì)胞。
實(shí)施例2單核細(xì)胞的培養(yǎng)將實(shí)施例1中獲得的單核細(xì)胞以1×106細(xì)胞/cm2的密度接種于含有基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。在37℃，5％的CO2下孵育培養(yǎng)瓶。在4小時(shí)后，用新鮮基本培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)瓶以去除未貼壁細(xì)胞?；九囵B(yǎng)基為含有3.5μM氫化可的松(Sigma)，以相等的摩爾比與無(wú)脂肪酸的牛血清白蛋白(Gibco BRL)混合的50ng/ml的亞油酸(Sigma公司)，0.1μM CuSO4·5H2O(Sigma)，50pM ZnSO4·7H2O(Sigma公司)，3ng/ml H2SeO3(Sigma)，1.05mg/ml NaHCO3(Sigma公司)，1.19mg/ml HEPES(Sigma)，100U/ml青霉素(Gibco BRL)，10mg/ml鏈霉素(Gibco BRL)和25mg/ml兩性霉素(Gibco BRL)的Williams’E培養(yǎng)基(Gibco BRL)。
實(shí)施例3單核細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞為了證實(shí)實(shí)施例2獲得的單核細(xì)胞是否能分化為神經(jīng)細(xì)胞，在37℃，5％的CO2下在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(Gibco BRL)，20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(R&D系統(tǒng))和20ng/ml肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(R&D系統(tǒng))(“分化培養(yǎng)基”)。一周兩次補(bǔ)充分化培養(yǎng)基。
大約4周后，神經(jīng)細(xì)胞集落出現(xiàn)并不斷增殖(參見(jiàn)表1和圖1)。
大約8周后，觀察到由長(zhǎng)突出物如軸突和短突出物如樹(shù)突組成的神經(jīng)元狀細(xì)胞和只包括短樹(shù)突的星形膠質(zhì)細(xì)胞狀的細(xì)胞(參見(jiàn)圖2和3)。另外，在8周后，即使在只含有EGF和bFGF的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，細(xì)胞增殖而它們的形狀不變(參見(jiàn)表2)。
然而，當(dāng)在只含有EGF和bFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞不分化為神經(jīng)細(xì)胞。另外，當(dāng)在只含有HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞早期分化，因此它們既不生長(zhǎng)也不增殖(參見(jiàn)表1)。
表1.間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)8周后細(xì)胞數(shù)/ml培養(yǎng)物

表2.通過(guò)在含有EGF，bFGF和HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周從間充質(zhì)干細(xì)胞分化的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)4或8周后細(xì)胞的增殖(接種細(xì)胞數(shù)1×105)

實(shí)施例4免疫細(xì)胞化學(xué)使實(shí)施例3中獲得的神經(jīng)細(xì)胞以1×104細(xì)胞/cm2的密度附著在1cm2的蓋玻片上，所述神經(jīng)細(xì)胞是通過(guò)在含有EGF，bFGF和HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周從骨髓的單核細(xì)胞分化而來(lái)。用0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞5分鐘，用含有4％低聚甲醛的0.1M磷酸鹽緩沖液固定15分鐘，并用0.1M磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次。用含1％BSA和2％Triton X-100的0.1M PBS處理細(xì)胞5分鐘，然后使其與第一抗體小鼠抗人神經(jīng)元特異性的烯醇化酶(NSE)(Chemico公司)，小鼠抗人神經(jīng)元特異性的核蛋白(NeuN)(Chemicon公司)，小鼠抗人β-微管蛋白III(Sigma公司)和小鼠抗人膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)(Sigma公司)反應(yīng)16小時(shí)。
在與第一抗體的反應(yīng)完成后，除去殘余抗體并用含有0.5％BSA的0.1M PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次15分鐘。另外加入第二抗體，兔抗鼠IgG(Sigma公司)并孵育30分鐘。用含0.5％BSA的0.1 M PBS洗滌細(xì)胞，一次5分鐘。通過(guò)使用含有抗生物素蛋白-生物素的Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector Laboratory公司)進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。用0.1M的磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，每次5分鐘，另外加入DAB(脫水3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽，Sigma公司)作為顯色底物，使混合物反應(yīng)5分鐘。通過(guò)用0.1M磷酸鹽緩沖液處理反應(yīng)物5分鐘并用該緩沖液洗滌它們兩次，每次5分鐘來(lái)終止反應(yīng)。將得到的反應(yīng)物干燥，并用蒸餾水洗滌5分鐘。通過(guò)依次使用蒸餾水，70％，80％，95％和100％的乙醇處理將細(xì)胞脫水和固定。
上述免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果在圖4A至4C中顯示，其中，對(duì)于神經(jīng)元標(biāo)記NeuN，NSE和β-微管蛋白III，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP，分化的細(xì)胞顯示陽(yáng)性結(jié)果。這些結(jié)果顯示細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，其是通過(guò)它們的生物化學(xué)以及形態(tài)特征來(lái)判斷。然而，對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記OX-42細(xì)胞顯示陰性，證明單核細(xì)胞不分化為小膠質(zhì)細(xì)胞。
檢驗(yàn)神經(jīng)元(對(duì)NeuN和NSE為陽(yáng)性)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(對(duì)GFAP為陽(yáng)性)在細(xì)胞中的比例并在在表3中顯示，所述細(xì)胞是通過(guò)在含有EGF+bFGF+HGF或EGF+bFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周從骨髓的單核細(xì)胞分化而來(lái)。
表3

從表3可見(jiàn)，當(dāng)在含有EGF+bFGF+HGF的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周時(shí)約80％的總分化細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞由約70％的神經(jīng)元和約30％的星形膠質(zhì)細(xì)胞組成。
實(shí)施例5間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)為了了解在骨髓的單核細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞是否將分化為神經(jīng)細(xì)胞，培養(yǎng)單核細(xì)胞并從中分離間充質(zhì)干細(xì)胞。如下檢驗(yàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為各種細(xì)胞的能力。
將如在實(shí)施例2中培養(yǎng)的單核細(xì)胞以1×103細(xì)胞/cm2的密度接種于含有用10％FBS(胎牛血清)補(bǔ)充的DMEM(Gibco BRL)的培養(yǎng)瓶中。
將細(xì)胞在5％CO2的氣氛下37℃培養(yǎng)。在1～2周后，將增殖的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在20代傳代培養(yǎng)后增殖繼續(xù)。
由骨髓獲得的單核細(xì)胞包括成熟白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，脂肪細(xì)胞以及將分化為這些細(xì)胞的干細(xì)胞，所述干細(xì)胞分為造血和間充質(zhì)干細(xì)胞。產(chǎn)生血細(xì)胞如紅細(xì)胞，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的造血干細(xì)胞不能增殖，但在普通的培養(yǎng)基中容易分化為成熟血細(xì)胞。因此，可以看到如上繼續(xù)增殖的細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。
為了證實(shí)增殖的細(xì)胞的確是間充質(zhì)干細(xì)胞，用各種細(xì)胞因子和化學(xué)試劑處理細(xì)胞，并依照Pittenger等，Science，284143-147，1999的方法檢驗(yàn)它們分化為包括成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的各種結(jié)締組織細(xì)胞。
為了使干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，使用100mM地塞米松和10mM β-甘油磷酸(β-glycerol phosphate)和50nM抗壞血酸-2-磷酸酯和10％FBS處理細(xì)胞。
另外，為了證實(shí)干細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞的能力，將培養(yǎng)的干細(xì)胞離心以獲得細(xì)胞沉淀，用不含血清的100nM地塞米松和10ng/ml TGF-β3處理。
通過(guò)用0.5mM 1-甲基3-異丁基黃嘌呤，1mM地塞米松，10g/ml胰島素，100nM吲哚美辛(indomethacine)和10％FBS處理干細(xì)胞誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。
通過(guò)堿性磷酸酶染色(Jaiswal等，J.Cell Biochem.，64(2)295-312，1997)檢驗(yàn)成骨細(xì)胞；通過(guò)II型膠原的RT-PCR(Mackay等，Tissue Eng.，4(4)415-428，1998)和用甲苯胺藍(lán)染色檢驗(yàn)成軟骨細(xì)胞；通過(guò)用油紅O染色檢驗(yàn)脂肪細(xì)胞。
結(jié)果，從圖5A，5B和5C可見(jiàn)，在光學(xué)顯微鏡下在所有樣品中觀察到陽(yáng)性結(jié)果。這些結(jié)果證明體外培養(yǎng)和增殖的間充質(zhì)干細(xì)胞還保持能夠分化為各種結(jié)締組織細(xì)胞如成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的干細(xì)胞性能。
實(shí)施例6間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞為了檢驗(yàn)實(shí)施例5中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞是否能分化為神經(jīng)細(xì)胞，在用EGF，bFGF和HGF補(bǔ)充的培養(yǎng)基中，按照實(shí)施例3的方法培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞。
結(jié)果，與源于骨髓的單核細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞分化類(lèi)似，在4周后形成神經(jīng)細(xì)胞集落，并且神經(jīng)細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)和增殖直至第8周。圖6和圖7舉例說(shuō)明了分別在接種后和在8周培養(yǎng)后即刻拍攝的細(xì)胞的顯微照片。
在第8周后，即使只用EGF和bFGF處理，細(xì)胞繼續(xù)增殖而保持神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特征。
同樣，按照實(shí)施例4的方法，對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
結(jié)果，與源于骨髓的單核細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞獲得的結(jié)果類(lèi)似，對(duì)于神經(jīng)元標(biāo)記(neural marker)NeuN，NSE和β-微管蛋白III以及星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記GFAP，分化細(xì)胞顯示陽(yáng)性結(jié)果。因此，證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞不僅分化為神經(jīng)元而且分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞(參見(jiàn)圖8A至8C)。圖8A至圖8C顯示免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果，圖8A代表NSE-陽(yáng)性細(xì)胞；圖8B，NeuN-陽(yáng)性細(xì)胞；和圖8C，GFAP-陽(yáng)性細(xì)胞。
雖然關(guān)于上述具體的實(shí)施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明，但應(yīng)承認(rèn)那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和改變，這些修改和改變也屬于如后附的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其包括在含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞在含有1-1000ng/mlEGF，1-1000ng/ml bFGF和1-1000ng/ml HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過(guò)一周的時(shí)間。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述培養(yǎng)進(jìn)行超過(guò)4周的時(shí)間。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞在含有EGF，bFGF和HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過(guò)一周時(shí)間，并且使產(chǎn)生的分化神經(jīng)細(xì)胞在含有EGF和bFGF的培養(yǎng)基中增殖。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述間充質(zhì)干細(xì)胞從人的骨髓分離。
6.權(quán)利要求1的方法，其中將從骨髓分離的并且包含間充質(zhì)干細(xì)胞的單核細(xì)胞用作間充質(zhì)干細(xì)胞的一種來(lái)源。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)細(xì)胞包含神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。
8.通過(guò)權(quán)利要求1至7任何一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的一組神經(jīng)細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8所述的神經(jīng)細(xì)胞組，其基于細(xì)胞數(shù)，含有60-80％神經(jīng)元和20-40％星形膠質(zhì)細(xì)胞。
10.一種治療神經(jīng)疾病的細(xì)胞組合物，其包含權(quán)利要求8的神經(jīng)細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的細(xì)胞組合物，其中所述神經(jīng)疾病是一種神經(jīng)變性疾病或由于脊髓損傷導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞組合物，其中所述神經(jīng)變性疾病選自帕金森氏病，阿爾茨海默氏病，皮克病，亨廷頓舞蹈病，肌萎縮性側(cè)索硬化和局部缺血性腦病。
13.一種用于在哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)疾病的方法，其包括以治療所述疾病有效的量對(duì)需要其的受試者給藥通過(guò)權(quán)利要求1的方法生產(chǎn)的神經(jīng)細(xì)胞。
全文摘要
一種使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的方法，其包括在含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，并且由此生產(chǎn)的神經(jīng)細(xì)胞可用于神經(jīng)疾病的治療。
文檔編號(hào)A61P25/16GK1549856SQ02808391
公開(kāi)日2004年11月24日 申請(qǐng)日期2002年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月19日
發(fā)明者金炫壽, 尹熙勛 申請(qǐng)人:金炫壽