專利名稱：一種人鼠嵌合型抗人CD19抗體Hm2E8b及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，主要涉及抗⑶19人鼠嵌合抗體Hm2E8b的研制及在制備B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤靶向治療藥物中的用途。
背景技術(shù)：
自1975年，Milstein和Kohler成功建立了制備單克隆抗體的方法以來，隨著抗體工程技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體已經(jīng)廣泛用于基礎(chǔ)研究和臨床診斷及治療。單克隆抗體分子量小，毒性小，特異性高，但是目前大多數(shù)高親和力的單抗是鼠源性的，在臨床導(dǎo)向治療中可能發(fā)生血清病或產(chǎn)生人抗鼠免疫球蛋白抗體(human anti-mouse antibody，HAMA)，只有將其進(jìn)行人源化的改造，將抗體分子中部分鼠源片段替換為人源片段，以大大降低或基本消除抗體的免疫原性?？贵w與抗原的結(jié)合位點(diǎn)位于可變區(qū)Fv段，而免疫原性主要位于恒定區(qū)Fc段。最簡(jiǎn)單的改造就是棄Fc段，保留Fv段，但是由于天然走向的Fv抗體片段，VH 和VL容易發(fā)生自由解離，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，故現(xiàn)在較為多見的就是構(gòu)建單鏈抗體(single chain Fv antibody fragments， scFv)0ScFv是由一個(gè)攜帶了完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的單基因編碼而成，由抗體重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)通過一段彈性短肽(Linker)相連而成，是最小的功能性抗體片段，僅有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，擁有與原代抗體相似的抗原結(jié)合力，分子量約27-30 kDa。與天然走向的Fv抗體片段相比，由于減少了 VH和VL的自由解離，更為穩(wěn)定，局部濃度更高。Linker約 10-25個(gè)氨基酸，大多是由甘氨酸和絲氨酸組成，最常用的是(GlyJer)3，可以提供足夠的彈性和抑制蛋白酶的作用。scFv分子量小，僅為完整抗體的1/6，與后者相比，它最大的優(yōu)勢(shì)就是對(duì)腫瘤的穿透率高，靜脈給藥分布更廣泛，加速了與靶位的結(jié)合，可以攜帶藥物和某些毒性物質(zhì)快速到達(dá)組織和腫瘤部位。因?yàn)槿鄙俸愣▍^(qū)和某些抗體的結(jié)合部位，單鏈抗體具有較低的免疫原性，能夠較少非特異性的結(jié)合。另外單鏈抗體半衰期短，體內(nèi)可以快速清除，因此可廣泛應(yīng)用于藥物解毒實(shí)驗(yàn)和反射免疫治療等。但與典型的抗體不同，scFv分子的最大缺陷就是與靶抗原的單價(jià)結(jié)合，即使其單價(jià)結(jié)合具有較高的親和力，解離也總是很快發(fā)生，這使得在體內(nèi)這樣的非平衡環(huán)境中不能在靶位長(zhǎng)時(shí)間停留。近年來許多設(shè)計(jì)通過交聯(lián)的方法或者重組融合的方法將scFv改造成二聚體或其它多聚分子，這些多聚體可以與單一的靶抗原結(jié)合或同時(shí)和多種靶抗原結(jié)合， 分子量在60-120kDa，親和力強(qiáng)，從細(xì)胞表面和多價(jià)抗原上解離的速度慢，半衰期長(zhǎng)，并且保持了較強(qiáng)的腫瘤穿透力。其中一個(gè)有效的辦法就是將scFv與Ig的Fc段結(jié)合，與免疫球蛋白超家族成員相比，scFv-Fc在腫瘤中的濃度較高，而且通過Fc受體的交聯(lián)作用，可以延長(zhǎng)scFv-Fc在體內(nèi)的半衰期。、鏈的Fc段包含IgG的鉸鏈區(qū)，CH2和CH3片段，其中鉸鏈區(qū)包含了樹木不等的半胱氨酸，參與重鏈間二硫鍵的形成，有助于二聚體的形成，而CH2片段可以和各種各樣的效應(yīng)細(xì)胞的Clq和Fc受體結(jié)合，與Clq發(fā)生反應(yīng)后可以激活補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒反應(yīng)(CDC)，與Fc受體結(jié)合可以激活抗體依賴細(xì)胞毒反應(yīng)(ADCC)和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP) 以及通過與Fc新生受體結(jié)合控制IgG的分解代謝，通過ADCC和CDC效應(yīng)，吞噬免疫復(fù)合物介導(dǎo)抗原遞呈，釋放細(xì)胞因子和促炎癥因子。CD19是一種跨膜糖蛋白，約95kDa大小，屬于免疫球蛋白超家族，存在于B細(xì)胞成熟的各個(gè)階段，在大多數(shù)的非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas, NHL)和許多白血病包括急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)和慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)中高表達(dá)，而且CD19在造血干細(xì)胞以及其它非B系的正常組織中不表達(dá)，因此⑶19是淋巴細(xì)胞起源腫瘤的一個(gè)重要的靶位。在過去的20年中，通過⑶20嵌合抗體美羅華(rituximab)的聯(lián)合化療，許多 B-NHL和B淋巴細(xì)胞白血病成功得到了治療。在美羅華的治療過程中，部分B細(xì)胞腫瘤的病人會(huì)出現(xiàn)CD20抗原丟失，部分病人會(huì)出現(xiàn)耐藥。而且相對(duì)于CD20來說，CD19在細(xì)胞表面出現(xiàn)較早且存在于整個(gè)B細(xì)胞的成熟期，在淋巴細(xì)胞惡性腫瘤中的表達(dá)譜也更廣，因此對(duì)許多早期B細(xì)胞腫瘤來如ALL以及部分CD20—對(duì)美羅華不敏感的腫瘤來說，CD19抗體可作為理想的靶向治療的藥物。ZCH (Zhejiang Children's Hospital )_4_2E8 (簡(jiǎn)稱 2E8)，為抗 CD19 單抗，屬鼠 IgM亞類，要應(yīng)用于臨床，需要對(duì)其進(jìn)行人源化的改造。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗CD19的人鼠嵌合型的抗體Hm2E8b，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所述，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所述。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的一種抗CD19的人鼠嵌合型的抗體Hm2E8b在制備治療B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用。CD19分子是B淋巴細(xì)胞特異性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)表面受體，存在于B細(xì)胞成熟的各個(gè)階段，在大多數(shù)的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和許多白血病包括急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)中高表達(dá)，目前已成為免疫治療的一個(gè)重要靶位。目前針對(duì)B系惡性腫瘤的治療，已經(jīng)有一些⑶19特異性抗體治療，包括非結(jié)合抗體，藥物共軛抗體以及雙特異性的抗體(CD19-CD3)，在體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型、以及早期的臨床實(shí)驗(yàn)中取得較為理想的成果。但是也存在不少的問題，因此有必要對(duì)更多的CD19抗體進(jìn)行優(yōu)化。ZCH-4-2E8 單抗具有良好的識(shí)別B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞膜CD19抗原而不識(shí)別其他組織、細(xì)胞成分的特性，體外實(shí)驗(yàn)表明，2E8免疫毒素對(duì)2E8陽性的急性B細(xì)胞性白血病細(xì)胞具有良好的選擇性殺傷作用，而對(duì)2E8陰性的細(xì)胞卻無作用，因此，該抗體具有潛在治療B細(xì)胞性惡性腫瘤包括白血病、淋巴瘤的應(yīng)用前景。但2E8是鼠源性的抗體，應(yīng)用于人體會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)其根本原因是鼠源性免疫球蛋白(抗體)的Fc段對(duì)人體具有免疫原性，因此，有必要對(duì)鼠源性抗體進(jìn)行人源化改造。本發(fā)明研制的嵌合抗體Hm2E8b，是通過一系列繁瑣而復(fù)雜的分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建帶有SCFv2E8-FC基因的分泌型真核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO獲得的。該抗體對(duì)2E8陽性的急性B細(xì)胞性白血病細(xì)胞具有良好的選擇性殺傷作用，對(duì)臨床B淋巴細(xì)胞性白血病及其它B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤靶向治療產(chǎn)生十分重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖1是2E8 1細(xì)胞的總RNA電泳圖。圖 2 是 PCR 產(chǎn)物 Leader_VH2E8 和 VL2E8 電泳圖。圖 3 是 PCR 產(chǎn)物 Leader_scFv2E8 電泳圖。圖 4 是 TA- Leader-scFv2E8 酶切鑒定圖。圖 5 是 TA- Leader-scFv2E8 測(cè)序結(jié)果。圖 6 是 TA- Leader-scFv2E8 和 pHMCH3 雙酶切電泳圖。圖7是pHMCH3-Hm2E8b雙酶切鑒定電泳圖。
圖8是轉(zhuǎn)染級(jí)純pHMCH3-Hm2E8b質(zhì)粒電泳。圖9是篩選第14天未轉(zhuǎn)染組CHO細(xì)胞(A)和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(B)。圖 10 是 CHO-Hm2Em3 RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖。圖11是CHO (A)和CH0_Hm2E8b (B)細(xì)胞免疫熒光圖。圖12是Hm2Em3-CHO亞克隆流式篩選圖。圖 13 是 Ηι 2Ε^3 SDS-PAGE 圖。圖 14 是 Ηι 2Ε^3 Western-Blot 圖。圖15是流式間標(biāo)法CH0-Hm2E8b細(xì)胞培養(yǎng)上清Hm2E8b嵌合抗體活性檢測(cè)結(jié)果。圖16是CH0-Hm2E8b細(xì)胞培養(yǎng)上清Hm2E8b嵌合抗體對(duì)直標(biāo)單抗2E8-FITC的流式細(xì)胞阻滯結(jié)果。圖 17 是 Hm2E8b 對(duì) Nalm6 的 CDC 作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例一真核表達(dá)載體pHMCH3-Hm2E8b的構(gòu)建
抽提2E8雜交瘤細(xì)胞RNA，以此為模板，通過SOE的方法擴(kuò)增Leader-SCFV2E8片段， 建立TA克隆，測(cè)序正確后插入PHMCH3載體(帶有人IgGl的Fc片段)，構(gòu)建真核表達(dá)載體 pHMCH3-Hm2E8b。1. 2E8雜交瘤細(xì)胞RNA的抽提和處理 1. 1總RNA的抽提
(1)計(jì)數(shù)細(xì)胞，共5XIO6個(gè)活細(xì)胞；
(2)常溫下IOOOrpm離心15分鐘，棄去上清；
(3)沉淀中加入無菌生理鹽水IOOOrpm離心15分鐘，洗滌2次；
(4)向沉淀中加入ImlTRIZOL (lml/5X IO6細(xì)胞)，立即用Iml移液槍反復(fù)吹吸數(shù)分鐘，將溶液轉(zhuǎn)入1. 5ml eppendorf管中，室溫下靜置5分鐘；
(5)加入0.2ml氯仿，劇烈搖動(dòng)15秒，室溫下靜置5分鐘；
(6)4° C下12000g離心15分鐘，將水相轉(zhuǎn)入新的1. 5ml的印pendorf管中，加入 0. 5ml異丙醇，立即搖勻，室溫下靜置5分鐘；
(7)4°C 下，12000g 離心 10 分鐘；
(8)棄去上清，加入1.5ml75%乙醇，混勻，4° C下，7500g離心5分鐘，棄去上清；
(9)無菌操作臺(tái)晾干，加入25μ 1無RNA酶的DEPC水溶解沉淀，-80° C冰箱保存。
1.2總RNA凝膠電泳及濃度的測(cè)定
抽提2組2E8細(xì)胞總RNA，分別瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示明顯的28S、18S及5S 3條條帶(參見圖1，M為分子標(biāo)志物，泳道1和泳道2均為抽提后的總RNA，其中泳道1加樣品過多，泳道2加樣品量適中，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。泳道1有雜帶，泳道2條帶清晰，純度高，選用泳道2的RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板)。取出2 μ 1新抽提的總RNA，加入98 μ 1 DEPC水混勻，紫外分光光度計(jì)測(cè)定Α260=0. 273，Α280=0. 150，計(jì)算其濃度為0. 569 ( μ g/μ 1)。1. 3 RT合成cDNA (按照逆轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行)2. PCR 反應(yīng)擴(kuò)增 Leader_scFv2E8 片段
2. 1設(shè)計(jì)引物通過PCR，擴(kuò)增出2E8的Leader-VH和VL片段，通過重疊延伸PCR的方法將Leader-VH和VL片段通過Linker (Gly4Ser) 3連接起來,構(gòu)建Leader_scFv2E8，同時(shí)在兩端引入酶切位點(diǎn)BamH I和EcoR I。(下劃線部分為酶切位點(diǎn)) 重鏈 5，端引物(Pl) (SEQ ID NO 3) CGCGGATCCATGGATTGGCTGTGG 輕鏈 3，端引物(P2) (SEQ ID NO 4) ATACAGACAAGTAGGATGAAGATTGTGTCATCTGGATGTC 重鏈 5，端引物(P3) (SEQ ID NO 5) GACATCCAGATGACACAATCTTCATCCTACTTGTCTGTAT 輕鏈 3，端引物(P4) (SEQ ID NO 6) CCGGAATTCTTTGATTTCCAGCTTGG 。2. 2 PCR 反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種人鼠嵌合型抗人⑶19抗體Hm2E8b，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人鼠嵌合型抗人CD19抗體Hm2E8b在制備治療B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供抗一種人鼠嵌合型抗人CD19抗體Hm2E8b，是鼠源性單克隆抗體ZCH-4-2E8的單鏈抗體和人IgG的Fc片段結(jié)合的嵌合抗體。本發(fā)明提供的單抗具有良好的識(shí)別B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞膜CD19抗原而不識(shí)別其他組織、細(xì)胞成分的特性，體外實(shí)驗(yàn)表明，該抗體對(duì)CD19陽性的細(xì)胞具有良好的選擇性殺傷作用，因此，可在制備治療B淋巴細(xì)胞性惡性腫瘤包括白血病、淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/02GK102250250SQ20111019134
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月9日
發(fā)明者湯永民, 沈笛穎 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)