專利名稱：綠原酸在制備增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及綠原酸的新用途，具體來(lái)說是綠原酸在制備具有升高白細(xì)胞和增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途。
背景技術(shù)：
綠原酸廣泛存在于各種藥用植物如金銀花等中，目前對(duì)它的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)清楚，已有人對(duì)其進(jìn)行藥用研究，報(bào)道了綠原酸可以應(yīng)用于治療腫瘤等疾病。盡管如此，我們通過藥理實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)它還具有許多其他新的醫(yī)療功效，而這些新的醫(yī)療功效在現(xiàn)有文獻(xiàn)中還從來(lái)沒有報(bào)導(dǎo)過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供綠原酸在制備具有增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供綠原酸在制備具有升高白細(xì)胞功效藥物的用途。
經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)綠原酸可升高白細(xì)胞；可刺激犬骨髓細(xì)胞增生，包括對(duì)骨髓干細(xì)胞的增加作用，并且綠原酸對(duì)60Co-γ射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷有顯著地保護(hù)作用。
機(jī)體的造血過程是一個(gè)活躍的細(xì)胞增殖、分化、成熟與釋放的過程。它是由多潛能造血干細(xì)胞的自我更新維持其數(shù)量的恒定，并由多潛能造血干細(xì)胞到各系定向祖細(xì)胞，再進(jìn)一步增殖、分化、釋放到外周血循環(huán)。藥物可通過影響造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞的增殖分化等多種環(huán)節(jié)影響造血過程。因此，造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的建立為我們探討藥物的作用提供了手段和方法。
SAM小鼠是由日本學(xué)者竹田俊男教授開發(fā)培殖的一種快速老化模型小白鼠，其特征是隨月齡增加自然出現(xiàn)老化諸特征，這些特征包括外在表現(xiàn)和病理、生化、免疫諸方面。其中SAM P8亞系小鼠又是以學(xué)習(xí)記憶障礙并伴有免疫功能降低為主要特征的老化模型，其造血功能也隨月齡增加出現(xiàn)低下狀態(tài)，因此我們選用9月齡的SAM P8小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⒁酝慢g的SAM R1為對(duì)照探討了綠原酸對(duì)其造血功能的影響。研究結(jié)果顯示SAM P8小鼠CFU-S、CFU-GM、CFU-E和BFU-E的增殖分化能力和外周血WBC數(shù)明顯低于同月齡的SAMR1小鼠。而綠原酸可使SAM P8小鼠降低的CFU-S數(shù)明顯增加，說明綠原酸可刺激造血干細(xì)胞的增殖，同時(shí)綠原酸可明顯促進(jìn)SAM P8小鼠骨髓粒單系祖細(xì)胞，早期、晚期紅系祖細(xì)胞的增殖分化，并可使其外周血WBC數(shù)升高，提示綠原酸可影響小鼠造血的整個(gè)過程。因此我們有理由推測(cè)綠原酸可能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)造血調(diào)控系統(tǒng)。小鼠血清集落刺激活力的測(cè)定結(jié)果說明綠原酸可通過促進(jìn)小鼠機(jī)體產(chǎn)生集落刺激因子來(lái)增強(qiáng)其祖細(xì)胞的增殖分化。組織學(xué)的研究結(jié)果則進(jìn)一步證實(shí)了綠原酸確能增強(qiáng)SAM P8小鼠的造血功能。
由此，綠原酸可治療各種原因引起的貧血，如但不僅僅限于失血性貧血、溶血性貧血，造血不良性貧血包括巨細(xì)胞性貧血、再生障礙性貧血和脾功能亢進(jìn)，對(duì)各種原因引起的白細(xì)胞減少狀態(tài)、粒細(xì)胞減少癥、粒細(xì)胞缺乏癥有治療作用，對(duì)各種原因引起的巨核系統(tǒng)改變?nèi)绲粌H僅限于特發(fā)性血小板減少性紫癜有治療作用；對(duì)各種原因引起的骨髓纖維化，骨髓感染有一定治療作用。
基于上述發(fā)現(xiàn)，綠原酸可以單獨(dú)或與其他具有已知功效的藥物一起采用各種制藥技術(shù)制備成各種藥用劑型如但不僅僅限于口服劑型、靜脈給藥劑型和外用劑型。
另外，本發(fā)明所述的“其他具有已知功效的藥物”是指現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報(bào)道的具有升高白細(xì)胞功效的藥物和增加骨髓細(xì)胞功效的藥物。
以下通過實(shí)驗(yàn)對(duì)綠原酸所具有的上述功效加以證實(shí)。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
實(shí)驗(yàn)例1綠原酸對(duì)外周血象的影響用環(huán)磷酰胺將犬制成白細(xì)胞減少的犬模型。
將綠原酸對(duì)犬給藥治療7天，陽(yáng)性藥(甘露聚糖肽)組和綠原酸各劑量組的白細(xì)胞WBC均升高，其中給藥第13天和14天大、中劑量組中白細(xì)胞WBC的增長(zhǎng)率與模型組有顯著性差異(P＜0.05)。見表1，綠原酸對(duì)犬白細(xì)胞的影響。表2，綠原酸對(duì)犬血小板的影響。
表1 綠原酸對(duì)犬白細(xì)胞的影響

與正常對(duì)照組比較**P＜0.001與模型對(duì)照組比較△P＜0.05△△P＜0.01表2 綠原酸對(duì)犬血小板的影響

與模型對(duì)照組比較△P＜0.05
實(shí)驗(yàn)例2對(duì)病理模型動(dòng)物骨髓的影響結(jié)果見表3、4、5。
表3 實(shí)驗(yàn)前正常骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)

各組犬給藥前正常骨髓象顯微鏡下觀察，各犬骨髓細(xì)胞增生活躍，未見異常。
中性粒細(xì)胞桿狀為主，占全片總數(shù)45～50％，其次為中幼、晚幼、分葉細(xì)胞。偶見嗜酸粒細(xì)胞，未見原始、早幼粒細(xì)胞。未見中幼和晚幼粒細(xì)胞。紅細(xì)胞系統(tǒng)以晚幼紅細(xì)胞為主，約占全片計(jì)數(shù)25～30％左右，其次為中幼紅細(xì)胞，全片鏡下未見原紅、早幼紅、早巨、中巨、晚巨紅細(xì)胞。淋巴系統(tǒng)以成熟淋巴細(xì)胞為主(約占9～12％)，未見原始和幼稚淋巴細(xì)胞。單核系統(tǒng)各組各犬未見有原始、幼稚、單核細(xì)胞。巨核細(xì)胞以成熟有血小板形成為主，成熟無(wú)血小板形成次之，未見幼稚巨核細(xì)胞。其它細(xì)胞未見漿細(xì)胞，未見網(wǎng)狀、內(nèi)皮、吞噬、寄生蟲、組織巨細(xì)胞、不明細(xì)胞以及特殊細(xì)胞。粒細(xì)胞系統(tǒng)與紅細(xì)胞系統(tǒng)之比各組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
表4 造模6天骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)


造模第7天36只犬骨髓增生低下，非造血細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多，粒系細(xì)胞，紅系細(xì)胞，巨核細(xì)胞總數(shù)減少，未見成熟有血小板形成和成熟無(wú)血小板形成。
表5 治療14天骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)


治療第14天，除模型組2只犬，小劑量組2只犬骨髓增生低下，非造血細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多，粒系細(xì)胞，紅細(xì)胞系統(tǒng)減少，骨髓增生未能恢復(fù)，其余各犬骨髓細(xì)胞增生活躍，已恢復(fù)正常。
實(shí)驗(yàn)例3對(duì)正常骨髓細(xì)胞的影響結(jié)果見表6、7、8。
表6 給藥90天骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)


給藥90天8只犬，顯微鏡下觀察，各犬骨髓細(xì)胞增生活躍和極度活躍。
表7 給藥180天骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)



給藥180天8只犬，顯微鏡下觀察，各犬骨髓細(xì)胞增生活躍和極度活躍。
表8 給藥270天骨髓細(xì)胞檢查(％，X±SD)


給藥270天16只犬，顯微鏡下觀察，各犬骨髓細(xì)胞增生活躍和極度活躍。
實(shí)驗(yàn)例4綠原酸對(duì)60Co-γ射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷的保護(hù)作用1.、實(shí)驗(yàn)方法取健康C57小鼠60只，依性別體重隨機(jī)分成5組。按分組分別給藥，陰性組各鼠腹腔注射生理鹽水0.4ml/20g體重，陽(yáng)性組(粒細(xì)胞集落刺激因子)各鼠腹腔注射給予0.4ml/20g體重(2ug/kg)，其余三組分別以0.1％、0.05％和0.025％的綠原酸藥液給各組各鼠腹腔注射0.4ml/20g體重(劑量20、10和5mg/kg)。以上5組各鼠均每日給藥一次，連續(xù)7日，第7日稱存活動(dòng)物體重，末次給藥后1小時(shí)。各組小鼠全身一次照射后第9天頸椎脫臼處死，取出脾臟，除去粘連的脂肪，然后置于Bouins液中固定3min，用放大鏡觀察并進(jìn)行內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)(CFU-S)，骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)(BMNC)。組間比較顯著差異。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表9 綠原酸對(duì)60Co-γ射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

與模型對(duì)照組比較***P＜0.001 **P＜0.01 *P＜0.054、結(jié)論表9的結(jié)果表明，綠原酸20、10和5mg/kg給小鼠腹腔注射，每日一次，連續(xù)7日，對(duì)60Co-γ射線致小鼠脾臟造血干細(xì)胞損傷有較強(qiáng)的保護(hù)作用。
實(shí)驗(yàn)例5綠原酸小鼠造血功能的影響1實(shí)驗(yàn)方法快速老化模型小白鼠(簡(jiǎn)稱SAM)。其中根據(jù)老化速度與病狀特征又分為正常老化的R系和快速老化的P系。采用9月齡SAMR1和SAMP8兩品系。
骨髓細(xì)胞(BMC)的制備 將動(dòng)物斷脊處死后，酒精消毒，無(wú)菌剝?nèi)∫粋?cè)股骨，用RPMI-1640液通過6號(hào)針頭反復(fù)沖洗骨髓腔數(shù)次，再將沖出的骨髓細(xì)胞液通過4號(hào)針頭制備成單細(xì)胞懸液。
小鼠骨髓造血干細(xì)胞(CFU-S)的測(cè)定 活殺小鼠，無(wú)菌制備BMC懸液，計(jì)數(shù)有核細(xì)胞后配成每毫升5×104個(gè)細(xì)胞，給經(jīng)8.0 Gy60Go照射后小鼠尾靜脈輸注0.2ml細(xì)胞懸液，第9天活殺受體鼠，取脾用Bouin液固定24h后計(jì)數(shù)表面結(jié)節(jié)數(shù)。
骨髓粒單系祖細(xì)胞(CFU-GM)的測(cè)定 將定量(1×105)的骨髓細(xì)胞懸液加馬血清與RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃水浴中保溫10～20min，加入30g/L瓊脂后混勻，轉(zhuǎn)入含有0.2ml鼠肺條件刺激液的瓊脂培養(yǎng)皿中，于37℃，0.05％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7天，置低倍鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的集落(CFU-GM)數(shù)。
骨髓早期、晚期紅系祖細(xì)胞(BFU-E、CFUE)的測(cè)定 將培養(yǎng)體系配成終濃度為10％骨髓細(xì)胞懸液(5×104ml)，200g/L馬血清，100g/L小牛血清白蛋白，1×10-5mol/L二巰基乙醇、10％爆式集落促進(jìn)活性(BPA)，0.8％甲基纖維素及每毫升1U EPO等充分混合后，加10μl至微孔塑料培養(yǎng)板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，用聯(lián)苯胺染色后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)8個(gè)以上染色陽(yáng)性細(xì)胞集落計(jì)為紅系集落形成單位(CFU-E)，培養(yǎng)8天計(jì)數(shù)含50個(gè)以上聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞集落為爆式紅系集落形成單位(BFU-E)。
小鼠外周血象的測(cè)定 小鼠尾靜脈采血，Coulter血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。
小鼠骨髓組織學(xué)觀察 斷頭活殺小鼠取完整左側(cè)股骨，入Hellyps液固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。
2實(shí)驗(yàn)結(jié)果綠原酸小鼠骨髓造血干細(xì)胞的影響將SAM P8小鼠隨機(jī)分為3組1組為SAM P8對(duì)照組，2、3組為綠原酸10，20m g/kg/天×8天，靜脈注射。另取同月齡SAMR1與SAMP8對(duì)照組，每天給予生理鹽水。9天活殺各組小鼠制備BMC懸液，按前述方法輸注給受體鼠。9天活殺取脾固定觀察結(jié)果，結(jié)果顯示SAM P8小鼠CFU-S數(shù)223±107明顯低于同月齡的SAMR1小鼠CFU-S 550±189(n＝12，P＜0.01)。而給予綠原酸后SAM P8小鼠CFU-S數(shù)明顯增多，其CFU-S數(shù)分別為483±125和527±183結(jié)果提示綠原酸對(duì)SAMP8小鼠骨髓造血干細(xì)胞的增殖分化有一定刺激作用。
綠原酸對(duì)小鼠骨髓造血祖細(xì)胞增殖的影響動(dòng)物分組，給藥與前相同，于給藥第9天斷脊處死小鼠無(wú)菌制備BMC懸液按前述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明SAM P8小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的增殖能力明顯低于SAMR1小鼠，二者之間有明顯差異。而綠原酸則可使SAM P8小鼠的粒單系造血祖細(xì)胞，早期及晚期紅系祖細(xì)胞的增殖能力均明顯增。
綠原酸對(duì)小鼠外周血象的影響結(jié)果表明SAM P8小鼠外周血象中，其WBC數(shù)明顯低于同月齡SAMR1小鼠。綠原酸10，20mg/kg則可明顯使其WBC數(shù)增加。
綠原酸對(duì)小鼠血清CSA的影響將各組小鼠分別心臟采血，靜止離心制備血清，以血清取代肺條件刺激液(CSF-GM)，觀察其對(duì)CFU-GM增殖的影響，以CFU-GM的產(chǎn)率代表CSA。結(jié)果證明SAMR1小鼠血清的CFU-GM的產(chǎn)率79.6±7.9明顯高于SAM P8小鼠CFU-GM 57.3±7.4(n＝12，P＜0.01)。而給予綠原酸后10，20mg/kg SAM P8小鼠的CFU-GM明顯增加(CFU-GM分別為74.2±7.2和81.5±8.2)與SAM P8組相比有顯著差異，提示綠原酸可明顯增強(qiáng)SAM P8小鼠體內(nèi)的CSA，促進(jìn)SAM P8小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的增殖分化。
綠原酸對(duì)小鼠骨髓組織學(xué)的影響組織學(xué)研究結(jié)果顯示SAM R1小鼠骨髓腔內(nèi)造血祖細(xì)胞豐富，各系細(xì)胞均可見到，并且形態(tài)良好，增殖旺盛，血竇較多。而同月齡SAMP8小鼠骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞明顯減少，增生不活躍，以中晚幼粒細(xì)胞為主，甚至局部缺少造血細(xì)胞，纖維結(jié)締組織增生，血竇較少。給予綠原酸后的SAM P8小鼠與未用藥SAM P8小鼠相比其骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞明顯增多，增生活躍，血竇較多，但較SAM R1小鼠骨髓造血細(xì)胞及血竇為少。這一結(jié)果提示綠原酸可明顯改善SAM P8小鼠骨髓造血功能。
權(quán)利要求
1.綠原酸單用或與其他藥物一起在制備具有增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物具有增加骨髓干細(xì)胞功效。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物可治療各種原因引起的骨髓纖維化和骨髓感染。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物可治療各種原因引起的血小板減少癥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的藥物對(duì)脾臟造血干細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、5所述的用途，其中所述的藥物能夠增強(qiáng)造血功能。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、5所述的用途，其中所述的藥物可治療各種原因引起的貧血和脾功能亢進(jìn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、5所述的用途，其中所述的藥物可治療失血性貧血、溶血性貧血、巨細(xì)胞性貧血和再生障礙性貧血。
9.綠原酸單用或與其他藥物一起在制備升高白細(xì)胞功效藥物的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中的該藥物可治療各種原因引起的白細(xì)胞減少，粒細(xì)胞減少癥、粒細(xì)胞缺乏癥。
全文摘要
本發(fā)明公開了綠原酸單用或與其他藥物一起在制備增加骨髓細(xì)胞功效藥物的用途。本發(fā)明還公開了綠原酸單用或與其他藥物一起在制備升高白細(xì)胞功效藥物的用途。
文檔編號(hào)A61P7/06GK1899280SQ20051008802
公開日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者張潔, 張舒, 張亮, 李鑫泉, 徐小平, 雍智全, 包旭 申請(qǐng)人:四川九章生物化工科技發(fā)展有限公司