專利名稱：重組胃泌酸調(diào)節(jié)素融合蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)建一種長(zhǎng)效穩(wěn)定的胃泌酸調(diào)節(jié)素，及其用于治療代謝疾病如糖尿 病和肥胖癥的用途。
背景技術(shù)：
人體食欲和能量代謝調(diào)控主要由下丘腦、腦干孤束核、胰島素、脂聯(lián)素、瘦素 等胰島、脂肪代謝信號(hào)分子、胃促生長(zhǎng)激素、高血糖素樣肽、胃泌素調(diào)節(jié)激素等胃腸激 素和迷走神經(jīng)等來共同調(diào)節(jié)。下丘腦、延腦孤束核分泌的激素和神經(jīng)遞質(zhì)及脂肪代謝信 號(hào)分子都需要通過神經(jīng)系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)來發(fā)揮作用，針對(duì)這些調(diào)節(jié)通路的減肥藥物 需要通過中樞神經(jīng)來起作用，影響面大，副作用嚴(yán)重。只有胃腸激素多直接作用于胃腸 道，調(diào)節(jié)食欲和能量代謝。因此，針對(duì)胃腸激素的減肥藥物靶點(diǎn)局限，副作用小。胃泌酸調(diào)節(jié)素(Oxyntomodulin，OXM)是腸上皮L-細(xì)胞分泌的一種短肽激素。 在人腸道末端有大量的OXM分布，在嚙齒類動(dòng)物胃腸道中，從十二指腸到回腸，OXM 的濃度逐漸增高，盲腸之后逐漸減少。腸上皮分泌胃泌酸調(diào)節(jié)素受營(yíng)養(yǎng)和能量代謝調(diào) 節(jié)，進(jìn)食后5-10分鐘后OXM水平開始升高，30分鐘后達(dá)到高峰。在體內(nèi)有一定的晝夜 規(guī)律，清晨分泌水平低，晚上分泌水平高。OXM由37個(gè)氨基酸組成。對(duì)于OXM的認(rèn)識(shí)來源于一些胃腸及腹部疾病患者血清中OXM的變化。人們發(fā) 現(xiàn)在一些胃腸道疾病如熱帶吸收不良，空腸回腸改道術(shù)等病態(tài)情況下，OXM水平顯著變 化，其減輕體重的作用引起人們的注意。前期研究結(jié)果也顯示，OXM是有效的減肥藥 物，長(zhǎng)期中樞性和周圍性地給與OXM可減少大鼠的體重增加。靜脈給與高于生理水平 的OXM可減少受試者食物攝取。Dhilfows等在為期四周的研究中發(fā)現(xiàn)，自行給與OXM 的超重或肥胖受試者，其攝入量顯著少于生理鹽水對(duì)照組，并且體重減輕也顯著快于對(duì) 照組，這種效應(yīng)在四周的研究過程中持續(xù)維持。OXM可減緩胃內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的排空。具 有減少食物吸收，抑制食欲及動(dòng)員脂肪、減少能量攝入，增加能量消耗，使能量代謝處 于負(fù)平衡狀態(tài)，從而減輕體重的功能。嚙齒動(dòng)物腦室注射或皮下注射胃泌酸調(diào)節(jié)素可降低食物吸收和體重，減少脂 肪。英國(guó)研究人員在《糖尿病》雜志上報(bào)告，皮下注射OXM可有效地減輕體重和減少 脂肪組織。研究人員對(duì)26名過重或肥胖的志愿者進(jìn)行了一項(xiàng)雙盲研究。受試者被隨機(jī) 指定在每餐前30分鐘皮下注射OXM或鹽水，同時(shí)要求他們?cè)谘芯科陂g保持正常飲食和 常規(guī)水平的體育鍛煉。治療組體重減輕了 2.3kg，對(duì)照組0.5kg。治療組顯示瘦素水平降 低，脂聯(lián)素增加，與脂肪組織減少一致。受試者的熱量攝取也顯著減少。開始研究進(jìn) 餐時(shí)減少了 170kcal，最后進(jìn)餐時(shí)250kcal。在嗜食性的感知上沒有變化。OXM主要通 過三條途徑調(diào)節(jié)食欲和能量攝取。一是直接作用于胃腸道胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)受 體，作用于迷走神經(jīng)，調(diào)節(jié)食欲，抑制糖和脂肪的吸收。二是下調(diào)胃生長(zhǎng)素的分泌，抑 制食欲。研究顯示，皮下注射OXM可使嚙齒動(dòng)物血液中的胃生長(zhǎng)素下降20%，而人類 可下降到44%。三是通過甲狀腺途徑刺激甲狀腺素的合成分泌，增加能量消耗，動(dòng)員脂肪分解?，F(xiàn)在多認(rèn)為OXM通過GLP-I受體起作用。在GLP-I受體敲除的小鼠實(shí)驗(yàn)中 發(fā)現(xiàn)，OXM的厭食效應(yīng)消失。OXM具有很短的半衰期，可被細(xì)胞表面的二肽基肽酶IV (DP-IV)迅速失活， 然而，DP-IV抑制劑在臨床中的體重效果居中，表明可能需要超生理水平的OXM來實(shí)現(xiàn) 人體的減肥。因此，胃泌酸調(diào)節(jié)素顯示了作為代謝疾病如糖尿病和肥胖癥的治療手段的 潛力，但是，因?yàn)镺XM的體內(nèi)穩(wěn)定性差，所以需要開發(fā)可被安全有效的給藥用于治療代 謝疾病如糖尿病和肥胖癥的長(zhǎng)效OXM。抗體的Fc結(jié)構(gòu)域通常包含每個(gè)鏈的至少兩個(gè)重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，其二聚化形成 Fc結(jié)構(gòu)域。Fc結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)提供抗體效應(yīng)功能，包括決定抗體半衰期和在體內(nèi)的分布固定 補(bǔ)體和結(jié)合細(xì)胞表面Fc受體的能力。Fc結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)使其稱為有用的治療劑。許多研 究已將Fc結(jié)構(gòu)域融合于其他非抗體蛋白質(zhì)，例如受體蛋白，例如伊納西普，也可將Fc結(jié) 構(gòu)域融合體用做研究試劑，F(xiàn)c標(biāo)簽其有利于蛋白的檢測(cè)與純化。人IgG免疫球蛋白是體 內(nèi)的主要抗體，它在人體內(nèi)的半衰期約為20天，其穩(wěn)定性是由于IgG的Fc片段可與新生 Fc受體(FcRn)結(jié)合，避免IgG進(jìn)入溶酶體中被降解。因此，IgG的Fc片段被用來與活 性蛋白連接構(gòu)成融合蛋白，以提高活性蛋白的體內(nèi)半衰期，達(dá)到長(zhǎng)效的目的。IgG可通過 Fc片段上的補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)激活補(bǔ)體，起到細(xì)胞殺傷作用。根據(jù)鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)短及Fc片段氨 基酸序列的不同，人IgG分為4個(gè)亞型，其中IgG Fc Y 2具有較低的誘導(dǎo)細(xì)胞毒性作用,而 IgG Fc Y 1最強(qiáng)。IgG融合蛋白的構(gòu)建方式大多是將IgG的Fc (Hinge_CH2- CH3)片段或 CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端與活性蛋白的C端相連，以避免構(gòu)建融合蛋白可 能對(duì)活性蛋白生物活性造成的影響。另外，如果活性蛋白以同源二聚體的形式發(fā)揮其生 物活性，F(xiàn)c γ片段及鉸鏈區(qū)的半光氨酸構(gòu)成的分子間二硫鍵可增強(qiáng)和穩(wěn)定融合蛋白二聚體 的形成。例如人白細(xì)胞功能抗原3 (LFA-3),腫瘤壞死因子受體II(TNFRII),白細(xì)胞介素 12(IL-12)等，這些融合蛋白在保留細(xì)胞因子生物功能的同時(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中明顯延長(zhǎng)細(xì)胞 因子的半衰期。此外，IgG的融合蛋白可以通過Protein A親和層析得到高效便捷的純化。 因此盡管很多細(xì)胞因子與IgG的融合蛋白還處于研究的前期階段，但是由于其高效性、半 衰期長(zhǎng)及純化方便的特點(diǎn)已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明通過構(gòu)建OXM與人IgG Fc融合蛋白，增強(qiáng)了 OXM多肽的體內(nèi)穩(wěn)定性和延長(zhǎng)了半衰期，并提供了該融合蛋白用于治療代謝疾病如糖尿 病和肥胖癥的方法。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種重組胃泌酸調(diào)節(jié)素融合蛋白OXM-Fc，它由人免 疫球蛋白G的Fc片段和人胃泌酸調(diào)節(jié)素通過一個(gè)連接肽構(gòu)成的融合蛋白。其中，OXM與Fc之間的鏈接肽選擇至關(guān)重要，OXM通過連接肽來連接Fc與 OXM以形成融合蛋白，OXM連接肽-Fc或Fc-連接肽-OXM。連接肽可以是(G4S) 3_1(1， 連接肽長(zhǎng)度優(yōu)選是2-100個(gè)氨基酸，更優(yōu)選是5-50個(gè)氨基酸，最優(yōu)選為14-30個(gè)氨基 酸。連接肽長(zhǎng)度可短至Fc對(duì)OXM形成的位阻保持最小，例如(G4S) i_2。連接肽有利 于OXM與其受體結(jié)合。所說的融合蛋白OXM-FC可以是包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽，或其片段同源物、類似物或衍生物。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，OXM-Fc由SEQ ID NO:5所
示氨基酸序列組成。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種編碼重組OXM-Fc融合蛋白的多核苷酸分子， 它是選自下列核苷酸序列的一種
1)SEQ ID NO:6的核苷酸序列；
2)與SEQID NO:6所示核苷酸序列至少70%相同的核苷酸序列；
3)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能與SEQID NO:6或其互補(bǔ)的多核苷酸分子雜交的核苷酸序
列；
4)編碼與SEQID NO:5相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而在序 列上有所不同的核苷酸序列。本發(fā)明所說的融合蛋白OXM-Fc可通過以下方法制備
(1)分別制得人胃泌酸調(diào)節(jié)素及免疫球蛋白G的Fc片段基因，
(2)連接人胃泌酸調(diào)節(jié)素和Fc基因；
(3)構(gòu)建含上述(2)連接片段的重組表達(dá)載體；
(4)用上述(3)中得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，
(5)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，然后從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化得到重組融合蛋白。上述方法中提供了含有編碼本發(fā)明的多核苷酸的重組表達(dá)載體，由該重組表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及由該宿主細(xì)胞所衍生的新的細(xì)胞系。在一優(yōu)選實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明多核苷酸分子的重組真核表達(dá)載體pOXM-Fc，以及含有該重 組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞pOXM-Fc/CHO。上述步驟(5)具體是在適于該融合蛋白的條件下培養(yǎng)用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞，以及從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化該重組融合蛋白的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方 案中，宿主細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，離心后，上清液分別用親和層析和分子篩層析純化。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親和層析是ProteinA sepharose FF親和層析柱，分子篩是Superdex 200 PREP grad 柱。本發(fā)明進(jìn)一步提供含有本發(fā)明OXM-Fc融合蛋白作為活性成分和藥學(xué)上可接受 載體的藥物組合物，以及該藥物組合物在治療內(nèi)分泌相關(guān)疾病的藥物中的用途，包括糖 尿病和肥胖癥等。本文中提到的OXM-Fc融合蛋白為同源性多肽，本文中的同源性多肽是指，多 肽本來具有OXM-Fc融合蛋白的氨基酸序列，但其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已被不同的 氨基酸殘基保守的取代，并且所得到的多肽可用于實(shí)施本發(fā)明。保守氨基酸取代時(shí)本領(lǐng) 域已知的。造成這樣的取代原則包含由Dayholf，MD等所述的取代規(guī)則。更具體的說， 保守氨基酸取代發(fā)生在與其酸性、極性或側(cè)鏈大小相關(guān)聯(lián)的氨基酸家族內(nèi)。生產(chǎn)和操作本文公開的多核苷酸分子的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可 按照描述的重組技術(shù)完成?？捎糜诒磉_(dá)本發(fā)明的OXM-Fc融合蛋白序列的表達(dá)載體 是本領(lǐng)域已知的，其中包括含有特定編碼序列的重組噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA和粘 粒DNA表達(dá)載體，可經(jīng)加工而含有本發(fā)明的多核苷酸分子的典型原核表達(dá)質(zhì)粒包括 PUC8,PUC9,PBR322和PBR329,pET系列載體，PQE50等等，可經(jīng)加工而含有本發(fā)明的多 核苷酸分子的典型真核表達(dá)載體包括蛻皮激素誘導(dǎo)型哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，基于鞠細(xì)胞病毒啟動(dòng)子-增強(qiáng)子的表達(dá)系統(tǒng)，和基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞。這樣的宿主細(xì)胞包括單 不限于微生物，例如用重組噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA或粘粒DNA載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，或 者用重組載體轉(zhuǎn)化的酵母，或者是動(dòng)物細(xì)胞，如用重組病毒載體如桿狀病毒感染的昆蟲 細(xì)胞，或用重組病毒載體如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。例如，可使用大 腸桿菌菌株，如BL21菌株。真核細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，但也可有效地利用小鼠、倉(cāng)鼠、 牛、猴或人細(xì)胞系等哺乳動(dòng)物細(xì)胞。可用于表達(dá)本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的真核宿主細(xì)胞包 CHO,和 HEK293，NIH-3T3 細(xì)胞等。含有本發(fā)明的重組融合蛋白質(zhì)的藥物組合物可用于內(nèi)分泌相關(guān)疾病的治療，尤 其是在減肥和糖尿病領(lǐng)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的藥物組合物適用于各種給藥方式，例如口 服給藥，經(jīng)皮給藥，靜脈給藥，肌肉內(nèi)給藥，局部給藥，經(jīng)鼻給藥等。根據(jù)所采用的給 藥方式，可將本發(fā)明的重組蛋白藥物組合物制成各種合適的劑型，其中包含至少一種有 效劑量的本發(fā)明的多肽和至少一種藥學(xué)上可接受的藥用載體。適當(dāng)劑型的實(shí)例為片劑，膠囊，糖衣片劑，粒劑，口服溶液和糖漿，用于皮膚 表面的油膏和藥貼，氣霧劑，鼻噴劑，以及可用于注射的無菌溶液。含有本發(fā)明重組蛋白的藥物組合物可以制成溶液或者凍干粉末以用于胃腸外給 藥，在使用前科加入適當(dāng)溶劑或其他可藥用的載體將粉末重新配置，液體配方一般是緩 沖液，等滲溶液和水溶液。劑型中還包含由其他常規(guī)組分，如防腐劑，穩(wěn)定劑，表面活性劑，緩沖液，調(diào) 節(jié)滲透壓的鹽，乳化劑，增甜劑，著色劑，調(diào)味劑等。本發(fā)明藥物組合物種使用的穩(wěn)定 劑優(yōu)選檸檬酸鈉，甘氨酸，甘露醇，神經(jīng)節(jié)糖苷等。含有本發(fā)明藥物組合物的注射水針 或凍干粉針更優(yōu)選的配方包括，Roxm-Fc，NaCl 4mg，硫酸鹽3.02mg，甘氨酸IOmg或 甘露醇15mg，注射用水0.5ml。本發(fā)明藥物組物種多肽的用量可以再一個(gè)較大范圍內(nèi)變動(dòng)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以根據(jù)一些一直的因素如根據(jù)疾病的種類，病情嚴(yán)重程度，病人體重，劑型，給藥途徑 等因素很容易的加以確定。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1)在分子數(shù)相同時(shí)與天然OXM相比，具有類似的生物學(xué)活性；
2)在藥物的藥代實(shí)驗(yàn)中顯示出顯著延長(zhǎng)的半衰期和穩(wěn)定性；
3)選擇IgG的Fc片段作為融合片段，避免副作用的產(chǎn)生；
4)表達(dá)量高，穩(wěn)定性好，易于放大生產(chǎn)，成本低。本發(fā)明的工程細(xì)胞株連續(xù)傳代100代后，仍能穩(wěn)定分泌表達(dá)OXM-Fc融合蛋 白，通過懸浮培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，用ELISA方法檢測(cè)上清中的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)50余次的數(shù) 據(jù)，表達(dá)量均在400-1000mg/L。在純化方面，由于融合蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)上清中含量高， 而純化工藝中的親和層析步驟具有很高的純化效率，每毫升凝膠可以結(jié)合50mg的蛋白， 易于放大生產(chǎn)。


圖1 顯示重組質(zhì)粒pOXM-Fc的構(gòu)建過程。圖2:顯示重組質(zhì)粒pOXM-Fc的酶切鑒定結(jié)果(l%agrose電泳)，其中泳道M 為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1,分別代表號(hào)克隆。圖3:顯示純化后蛋白的電泳圖譜(12%SDS-PAGE)，其中泳道M為蛋白質(zhì)分 子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道S為純化后的樣品。圖4 OXM-Fc蛋白以腹腔一次給藥方式注射雄性C57小鼠后的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)^ ο圖5 OXM-Fc蛋白對(duì)肥胖小鼠體重的影響，* = ρ < 0.001,和對(duì)照組比較。圖6 OXM-Fc蛋白對(duì)肥胖小鼠食物攝入量(FI)的影響，’=ρ < 0.05，和對(duì)照
組比較。圖7 OXM-Fc蛋白對(duì)肥胖小鼠糖耐量的影響
圖8: OXM-Fc蛋白對(duì)肥胖小鼠口服葡萄糖后胰島素釋放的影響，’ = ρ<0.05，和 對(duì)照組比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 OXM目的基因及人IgGl Fc片段基因的獲得
根據(jù)OXM基因序列，其氨基酸序列為SEQ ID NO 1，基因序列為SEQ ID NO 2，送交基因合成公司合成。根據(jù)人IgGl Fc基因序列，以正常人淋巴細(xì)胞總RNA為模 板，RT-PCR擴(kuò)增IgGl Fc片段，反應(yīng)條件如下RT-PCR反應(yīng)混合物在50°C變性30分 鐘后，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)94°C變性30秒；55°C退火30秒；68°C延伸 1分鐘，反應(yīng)10個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)94°C變性30秒；60°C退火30秒；68°C延伸1分 鐘，反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。然后68°C再延伸12分鐘。反應(yīng)完成后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RT-PCR產(chǎn)物。如圖1所示，我們得到了預(yù)計(jì)大小的DNA片段(約600bp)。經(jīng)測(cè)序， 其氨基酸序列為SEQIDNO 3，基因序列為SEQIDNO 4。實(shí)施例2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
載體的構(gòu)建如圖1所示，通過over-lap PCR技術(shù)將OXM和Fc的基因序列拼合；利 用引物延伸PCR技術(shù)，通過三次PCR將鼠IgK信號(hào)肽連接在OXM-Fc序列的氨基端； 再將目的基因與pcDNA3.0質(zhì)粒分別用Hind III和EcoR V內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；將酶切產(chǎn)物 用T4連接酶連接，將構(gòu)建好的質(zhì)粒命名為pcDNA3.0/OXM-Fc。具體是 1.1根據(jù)OXM和人IgGl Fc (hinge+ CH2+ CH3) cDNA序列設(shè)計(jì)如下引物 POXMlCATGGCGAGGGCACCTTCACCTC 3' POXM2: 5，CAGGTGTGGGTCTTGTCAGAGGAClTGGGCi ‘ PFcl: 5' GTCCTCTGACAAGACCCACACCTG 3， PFc2: 5' CGCGGATCCTCACTTGCCGGGGCTCAGGGACAG3， 其中POXM2和PFcl斜體部分為互補(bǔ)區(qū)域，PFc2含由EcoRV酶切位點(diǎn)。利用重疊 延伸拼接技術(shù)合成OXM-Fc。1.2根據(jù)鼠IgG κ鏈和OXM-Fc序列設(shè)計(jì)如下引物
Pl CCCAAGCTTGCCACCATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGP2 ATCATCCTGTTTCTGGTGGCTACCGCCACCGGAGT
P3 CTACCGCCACCGGAGTGCATTCTGACAAGACCCACACCTGTC
利用引物延伸技術(shù)合成信號(hào)肽之后，通過重疊拼接技術(shù)將信號(hào)肽OXM-Fc結(jié)合并將 得到的序列酶切后轉(zhuǎn)入PCDNA3.0真核表達(dá)載體，酶切鑒定結(jié)果為圖2，表達(dá)質(zhì)粒命名為 pcDNA3.0/OXM-Fco實(shí)施例3: CHO穩(wěn)定表達(dá)株(CHO-OXM細(xì)胞)篩選及鑒定
1) 取IOug大量制備的實(shí)施例2中的pOXM-Fc質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體Lipofectin2000 轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。兩天后按1 5的比例傳代，加入0.4 mg/ml的G418篩選，10天可見 克隆形成。隨機(jī)消化50個(gè)邊緣明顯分開、細(xì)胞狀態(tài)良好的單克隆接種于24孔板培養(yǎng)(第 一輪篩選)。2) 取三天后的培養(yǎng)上請(qǐng)用ELISA檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，從中選出表達(dá) 陽性的15個(gè)克隆分別接種于24孔板(第二輪篩選)及6孔板(用于保種)，培養(yǎng)4天 后，取上清用ELISA檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，從中選取表達(dá)較高的4個(gè)克隆A5-3、 B2-3、B2-5、C1-4 一步用有限稀釋法進(jìn)行篩選。3) 分別接種96孔板(5細(xì)胞/孔/200ul)(第三輪篩選)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后 (大約13天后)，去培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，B2-3、B2_5、Cl_4
均為均一的克隆，分別挑取表達(dá)較高的6個(gè)克隆接種24孔板，各平行屆2孔。待細(xì)胞長(zhǎng) 滿后，其中一孔用于保種，另一孔接種6孔板。待6孔板內(nèi)的細(xì)胞長(zhǎng)滿后，抽取基因組 DNA和總RNA，用PCR鑒定整合入基因組的插入片段的存在情況，用RT-PCR鑒定插入 片段的轉(zhuǎn)錄(即表達(dá))情況。結(jié)果顯示B2-3、B2-5、C1-4均為正確的克隆。4) 分別取 B4-3 (C3)、A6-4 (B4)、Cl-5 (D8)接種 96 孔板(1 細(xì) 胞/孔/200ul)(第四輪篩選)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后(大約15天后)，取培養(yǎng)上請(qǐng)用ELISA 檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況，三個(gè)克隆均為均一的克隆，將其中表達(dá)最高的分別擴(kuò)增、保 種，進(jìn)行下一步表達(dá)和純化。pOXM-Fc轉(zhuǎn)化CHO細(xì)胞后，將穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞命名為 CHO-OXM 細(xì)胞。實(shí)施例4制備OXM-Fc融合蛋白
大規(guī)模培養(yǎng)CHO-OXM細(xì)胞，經(jīng)離心后上清液用IM的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3，用 以 IOmM PB(pH7.3)平衡的 rProteinA-Sepharose F.F. (Parmacia)親和層析柱進(jìn)行吸附，再 用同樣的緩沖液洗滌親和柱至280nm的OD值小于0.01。用0.05 0.1M的檸檬酸緩沖液 將融合蛋白洗下，收集洗脫峰并立即用200 InMNa2HPO4調(diào)節(jié)PH至7.0。樣品濃縮后， 上分子篩 Superdex 200 prep grade 柱預(yù)先用 20 mM PBS (含 150mM NaCL, pH7.2)緩沖液平 衡，將濃縮后的樣品上樣純化。純化后的蛋白電泳圖譜見圖3，純度可達(dá)到98%以上。實(shí)施例5 制備以O(shè)XM-Fc為活性組分的注射劑/凍干劑
配方 OXM-FcIOOmg
NaCL8g
Na2HP04 · 12H205.16g
NaH2P04 · 2H200.874g
甘氨酸15g
甘露醇30g注射用水IOOOml
pH 值7.2
無菌過濾后分裝成0.5ml/支的注射水針劑或凍干，制成凍干粉針。實(shí)施例6 OXM-Fc在雄性C57小鼠體內(nèi)腹腔注射(IP) —次給藥的藥代動(dòng)力
學(xué)
實(shí)驗(yàn)方法
1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)10周齡健康雄性C57小鼠66只，體重(21.69 士 1.39)，由上 海中科院SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水，進(jìn)食普通 飼料，無不良反應(yīng)、進(jìn)食、飲水和活動(dòng)正常者納入實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室符合國(guó)標(biāo)清潔 級(jí)，空間50M2，室內(nèi)照明控制在12h/12h光暗周期節(jié)律。室內(nèi)平均氣溫23°C，相對(duì)濕度 50%-60%。2)動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)前稱小鼠體重，按體重隨機(jī)分成2組，每組33 只，每個(gè)時(shí)點(diǎn)3只。各組小鼠處理如下OXM組0.16mg/kg; OXM-Fc組5mg/kg。 每只小鼠注射一個(gè)IP注射劑量的OXM或OXM-Fe。在給藥0.08，0.5，1，6，24，48， 72，96，168，240和336hr后眼眶靜脈取血。血樣4°C凝固，3500 χ g低溫離心IOmin分
離血清，各時(shí)點(diǎn)每只小鼠血樣于_20°C保持待測(cè)。3)藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定采用ELISA試劑盒測(cè)定各個(gè)給藥方法、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠血 清中OXM-Fc濃度，得到血藥濃度_時(shí)間曲線及主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。以O(shè)XM單克隆 抗體10 μ g/ml包被ELISA板。以Bradford法測(cè)定OAP標(biāo)準(zhǔn)蛋白液的濃度。將OAP標(biāo) 準(zhǔn)品以抗體稀釋液倍比稀釋至1000、500、250、125、62.5、30ng/ml, 100 μ /孔。用此 測(cè)得的值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，取一特定時(shí)間點(diǎn)采到的血清樣品以抗體稀釋液作1:10，1:100, 1:1000, 1:5000稀釋，加入100 μ 1/孔，37°C水浴箱孵育lh。 以洗液洗5遍，每遍3 min,每洗一遍之后以毛巾包裹拍干。之后加入1:5000抗體稀釋液稀釋的HRP標(biāo)記的抗 小鼠IgG (Cell Signaling)，37°C水浴箱孵育1 h。按前述方案洗板5遍。之后加入100 μ 1/孔底物液，37°C水浴箱孵育20 30 min，加入反應(yīng)終止液20 μ 1/孔。于多功能酶 標(biāo)儀測(cè)定OD492nm。4)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(χ 土 S)表示，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5 處理。根據(jù)所測(cè)OXM，OXM-Fc血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，取各時(shí)點(diǎn)3只小鼠血藥濃度的 均數(shù)，用DAS軟件進(jìn)行曲線擬合并計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。P<0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯 著，P<0.001為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著。圖4和表1是OXM-Fc蛋白以腹腔一次給藥方式注射雄性C57小鼠后的藥代動(dòng) 力學(xué)結(jié)果，
權(quán)利要求
1.一種重組人胃泌酸調(diào)節(jié)素融合蛋白，其特征在于，它由人免疫球蛋白G的Fc片段 和人胃泌酸調(diào)節(jié)素通過一個(gè)連接肽構(gòu)成的融合蛋白。
2.如權(quán)利1所述的重組人胃泌酸調(diào)節(jié)素融合蛋白，其特征在于所述人胃泌酸調(diào)節(jié)素通 過一個(gè)連接肽與Fc片段連接構(gòu)成融合蛋白，所述連接肽為(G4S) 3_1(1。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于是SEQID NO:5所示氨基酸序列的多 肽，或其片段、同源物、類似物或衍生物。
4.一種編碼權(quán)利要求1融合蛋白的多核苷酸分子，其特征在于它是選自下列核苷酸序 列的一種1)SEQ ID NO:6的核苷酸序列；2)與SEQID NO:6所示核苷酸序列至少70%相同的核苷酸序列；3)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能與SEQID NO:6或其互補(bǔ)的多核苷酸分子雜交的核苷酸序列；4)編碼與SEQID NO:5相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而在序 列上有所不同的核苷酸序列。
5.制備權(quán)利要求1所述融合蛋白的方法，包括以下步驟(1)分別制得人胃泌酸調(diào)節(jié)素及免疫球蛋白Fc片段基因，(2)連接人胃泌酸調(diào)節(jié)素和Fc基因；(3)構(gòu)建含上述(2)連接片段的重組表達(dá)載體；(4)用上述(3)中得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，(5)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，然后從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化得到重組融合蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于宿主細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，離心后，上清 液分別用親和層析和分子篩層析純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于親和層析中使用的是ProteinAsepharose FF親和層析柱；分子篩中使用的是superdex 200 Prep grade柱。
8.—種藥物組合物，其特征在于該藥物組合物由作為活性成分的權(quán)利要求1的融 合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體組成。
9.權(quán)利要求1所述的融合蛋白在制備治療肥胖癥、糖尿病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種長(zhǎng)效穩(wěn)定的胃泌酸調(diào)節(jié)素，它由人免疫球蛋白G的Fc片段和人胃泌酸調(diào)節(jié)素通過一個(gè)連接肽構(gòu)成的融合蛋白。該融合蛋白的制備方法如下分別制得人胃泌酸調(diào)節(jié)素及免疫球蛋白Fc片段基因，并將它們連接，然后構(gòu)建含連接片段的重組表達(dá)載體；用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，然后從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化得到重組融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白能用于制備治療代謝疾病如糖尿病和肥胖癥的藥物。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102010473SQ20101053822
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者盧悟廣, 夏志南, 曹鵬, 蔡雪婷, 高健 申請(qǐng)人:夏志南, 曹鵬