專利名稱：一種提高原核表達(dá)豬干擾素抗病毒活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高原核表達(dá)豬干擾素抗病毒活性的方法，具體涉及提高原核表達(dá)豬IFN-α及IFN-γ抗病毒活性的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國是一個(gè)養(yǎng)豬大國，豬的各類疾病，尤其是病毒性疾病嚴(yán)重危害了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。為此，研制出高效低成本的抗病毒和免疫增強(qiáng)藥物是非常重要的應(yīng)對措施。干擾素是動(dòng)物機(jī)體在誘導(dǎo)因子的作用下分泌的具有免疫調(diào)節(jié)功能、廣譜抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性的分泌性蛋白質(zhì)，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分，其抗病毒、抗腫瘤和抗寄生蟲的效果已被廣泛研究并得到肯定。豬干擾素(Interferon，IFN)具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用，成為抗病毒制劑研究的重點(diǎn)。已知豬干擾素有α、β和Y三種，干擾素α屬于I型，具有廣譜的抗病毒作用，干擾素Y屬于II型，除具有抗病毒作用外，還具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能。近年來，豬的干擾素受到廣泛重視，出現(xiàn)了許多具有抗病毒活性的基因工程重組豬IFN-α和IFN-Y。但在實(shí)際應(yīng)用中，往往只是單個(gè)應(yīng)用某一型干擾素。而在機(jī)體內(nèi)，I 型的α-干擾素主要表現(xiàn)為抑制病毒復(fù)制作用，而II型的Y-干擾素主要的免疫調(diào)節(jié)活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于α和β干擾素，I型和II型協(xié)同作用，具有較大的免疫預(yù)防和治療功能。因此， 在實(shí)際應(yīng)用中，如果模擬天然狀態(tài)，將兩種類型的干擾素進(jìn)行聯(lián)合抗病毒應(yīng)用，將為臨床應(yīng)用提供更加有效抗病毒干擾素應(yīng)用方法，更好地發(fā)揮其抗病毒作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用ΡΕΤ-30原核表達(dá)載體，構(gòu)建了豬 IFN-α及IFN-γ基因的原核重組表達(dá)質(zhì)粒；將具有免疫原性的兩種重組蛋白豬IFN-α及豬IFN-Y按一定比例作為抗病毒制劑，對豬干擾素在Η(15細(xì)胞上抑制星狀病毒復(fù)制的活性進(jìn)行檢測，并確定了最佳抗病毒比例。為實(shí)現(xiàn)上述目地，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明涉及一種提高原核表達(dá)豬干擾素抗病毒活性的方法，包括提取豬白細(xì)胞 DNA和豬脾臟RNA，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)豬IFN- α和IFN- γ。具體包括如下步驟1.構(gòu)建豬IFN-α及IFN-γ基因的原核重組表達(dá)質(zhì)粒提取豬白細(xì)胞DNA、豬脾臟RNA，特異性引物擴(kuò)增豬IFN-α、IFN-Y基因，將 IFN-α和IFN-γ基因分別插入原核表達(dá)載體ρΕΤ_30構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30_IFN-α和 pET-30-IFN- γ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)豬IFN- α及IFN- γ，SDS-PAGE分析重組表達(dá)蛋白。2.重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將酶切鑒定正確及測序結(jié)果正確的重組表達(dá)質(zhì)粒菌液取100 μ 1加入到5ml卡那霉素抗性LB培養(yǎng)液中搖菌過夜，之后按1 100的比例接入200ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中37°C、250r/min擴(kuò)大培養(yǎng)2.證，加入IPTG (終濃度為lmmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)，分別在誘導(dǎo)后0、2、4、5、6、8、10小時(shí)取Iml菌液12000rpm離心2min，棄上清，干燥后懸于100 μ 1 2X 上樣緩沖液中，100°C煮沸5分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE。3.包涵體的提取和重組蛋白的純化將IL菌液加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h后，于4°C以5000g離心15min，吸棄上清，按 1 20 (w/v)用菌體裂解液重懸菌體沉淀，超聲破碎后，4°C、12000g離心20min，收集沉淀。 按1 20(W/V)依次用包涵體洗滌液洗滌包涵體；8000g離心20min，沉淀為包涵體。按 1 20 (W/V)的比例用7M鹽酸胍變性液溶解包涵體，16000g離心15min，收集上清。采用含低濃度鹽酸胍的谷胱甘肽復(fù)性液對變性蛋白進(jìn)行稀釋復(fù)性，即在磁力攪拌下，將變性蛋白以20μ l/20sec的速度稀釋于14倍體積的復(fù)性液中，置于4°C 12h ；4°C、12000g離心15min， 收集上清；將Ni2+親和樹脂層析柱先用0.02mol/L PBS (pH 7. 8)緩沖液平衡，再用變性緩沖液平衡；將制備好的復(fù)性蛋白過M2+親和樹脂層析柱，然后用平衡液和洗滌液依次清洗柱，最后依次用10mmOl/L、50mmOl/L、100mmOl/L、150mmOl/L的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白。 緩沖液按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南中的方法進(jìn)行配制。純化產(chǎn)物進(jìn)行12% SDS-PAGE，測定純化效率。4.重組蛋白含量和病毒毒價(jià)(TCID50)測定用紫外分光光度計(jì)分別測定純化后的豬IFN- α和IFN- γ在波長260和280處的 OD值，按照公式計(jì)算純化后的樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度；計(jì)算公式為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/ mL) = 1. 45X0D280-0. 74X0D260 ；在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H(15細(xì)胞長成單層，吸棄培養(yǎng)液，分別接種用PBS(0. OlM pH 7. 4) 10倍遞次稀釋的星狀病毒，每個(gè)稀釋度重復(fù)8孔，同時(shí)以PBS(0.01M pH 7.4)做陰性對照，37°C，5%的C02培養(yǎng)Ih后，分別加入 0. Iml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)，連續(xù)3d，然后按Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。5.單一重組蛋白抗病毒活性檢測將純化并已測定濃度的豬IFN- α和IFN- γ分別10倍稀釋，再分別進(jìn)行2倍遞次稀釋，按0. Iml/孔的量加入兩塊Η(15細(xì)胞長成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，37°C，5%的C02 誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，分別用100 TCID50的星狀病毒攻毒，同時(shí)設(shè)干擾素不加病毒的對照和病毒不加干擾素的對照，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察CPE，連續(xù)3d，參照病毒毒價(jià)測定法，按 Reed-Muench法分別計(jì)算豬IFN- α和IFN- γ在Η(15細(xì)胞上抑制星狀病毒復(fù)制的活性。6.重組蛋白的聯(lián)合抗病毒活性檢測將純化的豬IFN-α和IFN-γ蛋白分別稀釋為已確定的該重組蛋白抑制星狀病毒復(fù)制的最佳濃度；將稀釋好的豬IFN-α和IFN-γ蛋白按照不同比例1 1，5 1,52 1， 53 1,54 1,55 1,56 1配比混勻，接種Η(15細(xì)胞長成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上， 每個(gè)配比度重復(fù)12孔，37°C，5%的C02誘導(dǎo)培養(yǎng)Mh ；吸棄培養(yǎng)液，分別用100 TCID50的星狀病毒攻毒，同時(shí)設(shè)干擾素不加病毒的對照和病毒不加干擾素的對照，37°C，5%的C02繼續(xù)培養(yǎng)。逐日觀察CPE，連續(xù)3d，參照病毒毒價(jià)測定法，按Reed-Muench法計(jì)算豬IFN- α和IFN-Y在不同比例時(shí)抑制生長在H(15細(xì)胞上的星狀病毒復(fù)制的活性；重組豬IFN-α蛋白和IFN-γ蛋白在53 1的比例時(shí)，抑制星狀病毒復(fù)制的活性最好。本發(fā)明還涉及一種根據(jù)上述方法制備得到的豬IFN-α和IFN-γ，當(dāng)IFN-α和 IFN-Y的質(zhì)量比為53 1時(shí)抗星狀病毒的活性最佳。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于1、成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30-IFN- α和pET-30-IFN- γ2、確定了豬IFN- α和IFN- γ在Η(15細(xì)胞上抑制星狀病毒復(fù)制的活性。3、計(jì)算豬IFN- α和IFN- γ在不同比例時(shí)抑制生長在Η(15細(xì)胞上的星狀病毒復(fù)制的活性，并確定了達(dá)到最佳抑制病毒效果時(shí)兩種干擾素的比例。


圖 1 為 IFN- α 和 IFN- γ 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果；M 為 DL2000Marker ；1 為 IFN- α 擴(kuò)增結(jié)果；2為IFN-γ擴(kuò)增結(jié)果。圖2為重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果；Ml為DL2000Marker ； 1為pET-30-IFN- α雙酶切結(jié)果；2、3為pET-30-IFN- Y雙酶切結(jié)果；4為ρΕΤ_30空質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；Μ2為 DL15000Markero圖3為重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)；M為蛋白Marker ； 1-7為pET-30-IFN-y/BL21的 SDS-PAGE 結(jié)果；a-g 為 pET-30-IFN- α /BL21 的 SDS-PAGE 結(jié)果；8、h 為 pET30a/BL21 用 IPTG 誘導(dǎo)IOh的表達(dá)結(jié)果。圖 4 為重組目的蛋白 pET-30-IFN- α /BL21 和 pET_30_IFN_ y /BL21 純化后的 SDS-PAGE ；M為預(yù)染蛋白Marker ； 1-4為pET-30-IFN- y /BL21純化過程中連續(xù)的收集目的蛋白；6-9為pET-30-IFN- α /BL21純化過程中連續(xù)的收集目的蛋白。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 1.構(gòu)建豬IFN-α及IFN-γ基因的原核重組表達(dá)質(zhì)粒提取豬白細(xì)胞DNA、豬脾臟RNA，特異性引物擴(kuò)增豬IFN-α、IFN-γ基因，結(jié)果如圖1所示。將IFN-α和IFN-Y基因分別插入原核表達(dá)載體ρΕΤ_30，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-30-IFN- α和pET-30_IFN-γ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)豬IFN-α及 IFN- γ，SDS-PAGE分析重組表達(dá)蛋白。結(jié)果如圖2所示。2.重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將測序結(jié)果正確的重組表達(dá)質(zhì)粒菌液取100 μ 1加入到5ml卡那霉素抗性LB培養(yǎng)液中搖菌過夜，之后按1 100的比例接入200ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中37°C、250r/min 擴(kuò)大培養(yǎng)2. 5h，加入IPTG (終濃度為lmmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)，分別在誘導(dǎo)后0、2、4、5、6、8、10小時(shí)取11111菌液12000印111離心&1^1，棄上清，干燥后懸于10(^1 2X上樣緩沖液中，100°C煮沸5分鐘后進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果如圖3所示。在各時(shí)間的表達(dá)重組質(zhì)粒pET-30-IFN- α經(jīng)誘導(dǎo)后在21. 3kD處出現(xiàn)明顯條帶，重組質(zhì)粒pET-30-IFN- γ經(jīng)誘導(dǎo)后在19. 4kD處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)測的結(jié)果一致。3.包涵體的提取和重組蛋白的純化將IL菌液加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5h后，于4°C以5000g離心15min，吸棄上清，按1 20(w/v用菌體裂解液重懸菌體沉淀，超聲破碎后，4°C、12000g離心20min，收集沉淀。 按1 20 (W/V)依次用包涵體洗滌液洗滌包涵體。8000g離心20min，沉淀為包涵體。按 1 20 (W/V的比例用7M鹽酸胍變性液溶解包涵體，16000g離心15min，收集上清。采用含低濃度鹽酸胍的谷胱甘肽復(fù)性液對變性蛋白進(jìn)行稀釋復(fù)性，即在磁力攪拌下，將變性蛋白以 20μ l/20sec的速度稀釋于14倍體積的復(fù)性液中，置于4°C 12h。4°C、12000g離心15min， 收集上清。將Ni2+親和樹脂層析柱先用0. 02mol/L PBS (pH 7. 8)緩沖液平衡，再用變性緩沖液平衡。將制備好的復(fù)性蛋白過M2+親和樹脂層析柱，然后用平衡液和洗滌液依次清洗柱，最后依次用10mmOl/L、50mmOl/L、100mmOl/L、150mmOl/L的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白。 緩沖液按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南中的方法進(jìn)行配制。純化產(chǎn)物進(jìn)行12% SDS-PAGE，電泳結(jié)果見圖4。4.重組蛋白含量和病毒毒價(jià)(TCID50)測定用紫外分光光度計(jì)分別測定純化后的豬IFN- α和IFN- γ在波長260和280處的 OD值，按照公式計(jì)算純化后的樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。計(jì)算公式為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/ mL) = 1. 45X0D280-0. 74 XO擬60。計(jì)算結(jié)果如表1所示。表1 重組蛋白的含量計(jì)算結(jié)果Table 1 Content of the Purified protein pET-30-IFN-α /BL21and pET-30 -IFN-y/BL2權(quán)利要求
1.一種提高原核表達(dá)豬干擾素抗病毒活性的方法，其特征在于包括提取豬白細(xì)胞DNA 和豬脾臟RNA，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)豬IFN- α和IFN- γ。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備得到的豬IFN-α和IFN-Y，其特征在于所述豬IFN-α和IFN-γ的質(zhì)量比為53 1時(shí)抗星狀病毒的活性最佳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高原核表達(dá)豬干擾素抗病毒活性的方法，包括提取豬白細(xì)胞DNA和豬脾臟RNA，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)豬IFN-α和IFN-γ；重組豬IFN-α和IFN-γ在質(zhì)量比為53∶1時(shí)，抑制星狀病毒復(fù)制的活性最好；本發(fā)明方案提供了一種表達(dá)量高、純度的好豬干擾素生產(chǎn)制備方法及提高干擾素抗病毒活性使用方法，為新型基因工程抗病毒制劑的開發(fā)以及用于豬的傳染性疾病的預(yù)防和治療奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A61P31/14GK102329813SQ20111023788
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者俞向前, 葉承榮, 朱建國, 林 源, 趙偉鴿 申請人:上海交通大學(xué), 上海市浦東新區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心