專利名稱：：利用大孔樹脂制備細梗香草總皂苷提取物的方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物提取物的制備方法，尤其涉及一種利用大孔樹脂制備細梗香草總皂苷提取物的方法及用途。
背景技術(shù)：
：細梗香草，又名排草、香排草、香草、毛柄珍珠菜，系報春花科(Primulaceae)珍珠菜屬植物，主要分布在我國西南華南地區(qū)。民間用于治療感冒咳喘、風(fēng)濕痛、抗腫瘤、月經(jīng)不調(diào)、神經(jīng)衰弱、補虛、驅(qū)蛔。關(guān)于細梗香草的活性成分研究，多為田景奎教授研究，國內(nèi)外少見報道，通過對細梗香草全草化學(xué)成分進行了研究，從中共分離得到了16個化合物，包括13個皂苷和3個黃酮，13個皂苷均為新化合物。包括三種類型皂苷元，其中兩種皂苷元3卩,16a,22a-三羥基-28—13-內(nèi)酯-齊墩果烷和3卩,22a-二羥基-15a，16a-環(huán)氧-齊墩果-12-烯為首次報道，糖有三糖、四糖、五糖。對細梗香草總皂苷進行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)細梗香草總皂苷有非常強的抑制卵巢癌細胞A2780細胞的作用(IC500.1//g/mL)，有很好的開發(fā)前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用大孔樹脂制備細梗香草總皂苷提取物的方法及用途。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種利用大孔樹脂制備細梗香草總皂苷提取物的方法，該方法為取細梗香草藥材粉碎或用細梗香草飲片，加入質(zhì)量體積比為615倍量的水或含水乙醇，含水乙醇中乙醇的體積比為10%-95%，加熱回流提取24次，每次l3h，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度Ll1.3;過濾或離心后通過填充有大孔樹脂的層析柱，提取液中的細梗香草總皂苷與大孔樹脂的重量比為1:510，上柱流速14BV/h，樹脂徑高比為1:31:9;用水洗滌大孔樹脂38BV，洗脫流速為234BV/h，水洗脫液棄去；用體積比為2095%含水乙醇洗脫大孔樹脂，流速為24BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.11.25，減壓或噴霧干燥，得細梗香草總皂苷提取物。進一步地，所述的大孔樹脂為聚苯乙烯型大孔樹脂。一種上述方法制備的細梗香草總皂苷提取物在用于制備治療腫瘤的藥物方面的用途。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用的大孔樹脂對細梗香草總皂苷的吸附量大，被解吸完全，所得總皂苷的含量高，因此，可以顯著提高細梗香草總皂苷的提取率，降低生產(chǎn)成本。細梗香草總皂苷提取物具有顯著的抗腫瘤作用，可以用于制備治療腫瘤的藥物。具體實施例方式大孔吸附樹脂是指由苯乙烯、a-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等為原料加入一定量致孔劑二乙烯苯聚合而成的球狀顆粒，直徑一般在0.3-1.25mm之間。本發(fā)明細梗香草總皂苷提取物的制備方法為取細梗香草藥材粉碎或用細梗香草飲片，加入質(zhì)量體積比為615倍量的水或含水乙醇，含水乙醇中乙醇的體積比為10%-95%，加熱回流提取24次，每次l3h,過濾，合并提取液，濃縮至相對密度Ll1.3;過濾或離心后通過填充有大孔樹脂的層析柱，提取液中的細梗香草總皂苷與大孔樹脂的重量比為1:510，上柱流速l4BV/h，樹脂徑高比為1:31:9;用水洗滌大孔樹脂38BV，洗脫流速為24BV/h，水洗脫液棄去；用體積比為2095%含水乙醇洗脫大孔樹脂，流速為24BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.11.25，減壓或噴霧干燥，得細梗香草總皂苷提取物。其中，離心的轉(zhuǎn)速為400016000轉(zhuǎn)/分鐘；大孔樹脂為聚苯乙烯型大孔樹脂。上述方法得到的提取物中細梗香草總皂苷重量含量為20%70%、細梗香草苷B重量含量不低于10%。細梗香草總皂苷的抗腫瘤實驗體外抗腫瘤細胞篩選實驗.實驗方法a細胞培養(yǎng)運用組織細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)各類腫瘤細胞，細胞接種于含10%新生牛血清RPMI-1600培養(yǎng)液中。培養(yǎng)環(huán)境為5%(:02，37'C及飽和濕度。細胞傳代為23d。貼壁細胞以0.25%胰蛋白酶消化適當后l:3傳代。懸浮細胞離心收集后傳代。b.體外細胞生長抑制實驗(MTT法)取對數(shù)生長期的人癌細胞(0.5-1.0)xl()S/mL，分裝于96孔培養(yǎng)板中，0.2mL/孔。實驗設(shè)陰性對照組、溶劑對照組、陽性藥(Taxol)組和5-6個不同濃度細梗香草藥物組。藥物與細胞培養(yǎng)72h，在實驗結(jié)束前4h每孔加入20ulMTF液(5ug/mL)。4h后吸棄培養(yǎng)液，待結(jié)晶溶解后置酶聯(lián)檢測儀，用570nm波長測各孔的吸光度值(A)，按下列公式求生長抑制率，并用POMS軟件程序求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，進行評價和比較。生長抑制輛T^^x腦試驗中釆用的人食道癌細胞Eca-109,人胃癌細胞BGC-823，腸癌C38，白血病細胞Molt-4，肺癌細胞株A549，結(jié)腸腺癌細胞HCT-8，宮頸癌細胞HeLa，肝癌H22，卵巢癌A2780,乳腺癌MCF7，S哪肉瘤，人口腔上皮癌細胞KB等十二種瘤株進行了ICso測定。對鼠源性瘤株體內(nèi)抑制作用選取腹腔傳代7d，腹部膨隆明顯的Swo肉瘤、肝癌H22和結(jié)腸癌細胞株colon26小鼠，在超凈工作臺中，腹部皮膚消毒，用一次性無菌采血器經(jīng)腹壁刺入腹腔，抽取腹水，放入無菌燒杯中，以生理鹽水稀釋成1:3的癌細胞混懸液，鏡下觀察計數(shù)，并調(diào)整瘤細胞濃度至lxl07/mL。接種于18-22gICR小鼠右側(cè)腋部皮下0.2mL/只。接瘤次日，將實驗小鼠隨機分為對照組(生理鹽水20mL/kg);CTX組(30mg/kg);細梗香草皂苷組5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg三個給藥劑量組，共5組，每組10只。每天灌胃給藥l次，隔日稱量體重l次,連續(xù)給藥10d，每天觀察ICR小鼠反應(yīng)情況，包括進食、大小便性狀、精神狀態(tài)等。停藥次日，將動物稱重后脫臼處死，剝離出皮下腫塊稱重，比較各組間腫瘤重量的差異性。并計算出腫瘤抑制百分率。統(tǒng)計學(xué)處理方法采用組間t-檢驗。腫瘤抑制率:對照組平^t^l平均瘤重y對照組平均瘤重結(jié)果5實驗表明除肺癌細胞株A549和乳腺癌MCF7外，細梗香草皂苷對其它IO種腫瘤細胞均有較好的抑制作用。見表l表1:細梗香草皂苷體外對12種瘤株的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>細梗香草皂苷對鼠源性瘤株抑制效果見表2、表3和表4。實驗表明細梗香草皂苷對三種移植性鼠源性瘤株均有較好的抑制作用，特別對結(jié)腸癌細胞株colon26移植瘤抑制率超過50%。表2:細梗香草皂苷對小鼠S180移植瘤的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>與模型對照組比較<0.05"PO.Ol表3:細梗香草皂苷對小鼠H^移植瘤的抑制作用組別例劑體重(g)瘤重抑瘤數(shù)里(g)率nmg/kg實驗前實驗后X土S%陰性對照組(生理鹽20.57±0.水)10等體積96細梗香草24.84土1.7皂苷10208細梗香草20.18±1.皂苷101013細梗香草皂苷105環(huán)磷酰胺組(CTX)103020.4±0.8823.97土1.1與模型對照組比較4<0.05，"PO.01表4:細梗香草皂苷對小鼠結(jié)腸癌細胞株cokm26移植瘤的抑制作用^組別例卞/,數(shù)劑量體重(g)瘤重(g)抑瘤率nmg/kg實驗前實驗后X土S%陰性對照組(生理鹽等體18.6±0.水)10積728.3±3.21.83±0.43細梗香草皂苷102018.7±0.425.9±1.80.80±0.3351.3**細梗香草皂苷101020.2±1.430.7±2.51.59±0.2629.5細梗香草皂苷10519.8±0.828.8±2.31.77±0.286.87環(huán)磷酰胺組20.5±1.30(CTX)10_J_27.2±3.20.89±0.2550.7**與模型對照組比較^P0.05"P<0.01實施例1取粉碎后的細梗香草藥材2kg，加6倍量水，加熱回流提取2次，每次lh，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度l.l;過濾后通過DHM型大孔樹脂，提取液按細梗香草總皂苷含量計與干樹脂的重量比為1:5,上柱流速lBV/h，樹脂徑高比為1:3;用水洗滌樹脂3BV，洗脫流速為2BV/h，水洗脫液棄去；用含20%含水乙醇洗脫8BV,流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.1，減壓干燥，得細梗香草總皂苷提取物。測得細梗香草總皂苷含量為20%,細梗香草皂苷B含量為10.2%。實施例2將細梗香草飲片lkg，加15倍量95%乙醇，加熱回流提取4次，每次3h，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度1.3;離心后通過AB-8型大孔樹脂的層析柱，提取液按細梗香草總皂苷含量計與干樹脂的重量比為1:10,上柱流速4BV/h，樹脂徑高比為1:9;用水洗滌樹脂8BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含95%含水乙醇洗脫，流速為4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.25，減壓或噴霧干燥，得細梗香草總皂苷提取物。測得細梗香草總皂苷含量為70%,細梗香草皂苷B含量為55%。實施例3取粉碎后的細梗香草藥材5kg，加8倍量70%，加熱回流提取2次，每次1.5h，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度1.2;離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)后通過AB-8型大孔樹脂，藥液按細梗香草總皂苷含量計與干樹脂的重量比為1:5，上柱流速2BV/h，樹脂徑高比為1:5;用水洗滌樹脂3BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含70%水乙醇洗脫3BV，流速為2BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.1(50'C熱測)，減壓干燥，得細梗香草總皂苷提取物。測得細梗香草總皂苷含量為60%，細梗香草皂苷B含量為25%。實施例4細梗香草藥材飲片5kg，加10倍量10%乙醇，加熱回流提取3次，每次1.0h，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度1.15;過濾后通過D2。,型大孔樹脂，藥液按細梗香草總皂苷含量計與干樹脂的重量比為1:9,上柱流速3BV/h，樹脂徑高比為1:7;用水洗滌樹脂5BV，洗脫流速為4BV/h，水洗脫液棄去；用含50%水乙醇洗脫IOBV，流速為4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.25(50'C熱測)，噴霧干燥，得細梗香草總皂苷提取物。測得細梗香草總皂苷含量為55。％，細梗香草皂苷B含量為10.6%。實施例5細梗香草藥材飲片5kg，加15倍量水，加熱回流提取2次，每次lh,過濾，合并提取液，濃縮至相對密度1.25;離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘)后通過HPD450大孔樹脂，藥液按細梗香草總皂苷含量計與干樹脂的重量比為1:6，上柱流速4BV/h，樹脂徑高比為1:9;用水洗滌樹脂2BV，洗脫流速為3BV/h，水洗脫液棄去；用含50X水乙醇洗脫5BV，流速為3BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇液減壓濃縮至相對密度為1.2(5(TC熱測)，噴霧干燥，得細梗香草總皂苷提取物。測得細梗香草總皂苷含量為45%，細梗香草皂苷B含量為13.5%。權(quán)利要求1、一種利用大孔樹脂制備細梗香草總皂苷提取物的方法，其特征在于，該方法為取細梗香草藥材粉碎或用細梗香草飲片，加入質(zhì)量體積比為6～15倍量的水或含水乙醇，含水乙醇中乙醇的體積比為10％-95％，加熱回流提取2～4次，每次1～3h，過濾，合并提取液，濃縮至相對密度1.1～1.3。過濾或離心后通過填充有大孔樹脂的層析柱，提取液中的細梗香草總皂苷與大孔樹脂的重量比為1∶5～10，上柱流速1～4BV/h，樹脂徑高比為1∶3～1∶9。用水洗滌大孔樹脂3～8BV，洗脫流速為2～4BV/h，水洗脫液棄去。用體積比為20～95％含水乙醇洗脫大孔樹脂，流速為2～4BV/h，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.1～1.25，減壓或噴霧干燥，得細梗香草總皂苷提取物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述利用大孔樹脂制備細梗香草總皂苷提取物的方法，其特征在于，所述的大孔樹脂為聚苯乙烯型大孔樹脂。3、一種權(quán)利要求1所述方法制備的細梗香草總皂苷提取物用于制備治療腫瘤的藥物方面的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用大孔樹脂制備細梗香草總皂苷提取物的方法及用途，它是將細梗香草藥材粉碎或直接用細梗香草飲片，加質(zhì)量體積比為6～15倍量水或體積比為10％～95％乙醇，加熱回流提取，過濾，合并提取液，濃縮；過濾或離心后通過填充有大孔樹脂的層析柱，先用水洗滌樹脂，水洗脫液棄去；再用含水乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液；乙醇洗脫液減壓濃縮，減壓或噴霧干燥，得細梗香草總皂苷。本發(fā)明采用的大孔樹脂對細梗香草總皂苷的吸附量大，被解吸完全，所得總皂苷的含量高，因此，可以顯著提高細梗香草總皂苷的提取率，降低生產(chǎn)成本。細梗香草總皂苷提取物具有顯著的抗腫瘤作用，可以用于制備治療腫瘤的藥物。文檔編號A61P35/00GK101507740SQ20091009678公開日2009年8月19日申請日期2009年3月19日優(yōu)先權(quán)日2009年3月19日發(fā)明者付紅偉,應(yīng)弘梅,琳張,欣王,田富饒,田景奎,鄭筱祥申請人:浙江大學(xué)