專(zhuān)利名稱(chēng)：利用rna干擾文庫(kù)篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種利用RNA干擾文庫(kù)和免疫缺陷小鼠細(xì)胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型篩選 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。
背景技術(shù)：
腫瘤轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位擴(kuò)散到機(jī)體其它部位的現(xiàn)象。統(tǒng)計(jì)表明，超過(guò)90%的 腫瘤患者死亡源于腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移包括1、腫瘤細(xì)胞遷移通過(guò)腫瘤組織基底膜；2、進(jìn) 入循環(huán)系統(tǒng)，在其中存活并轉(zhuǎn)運(yùn)；3、在腫瘤繼發(fā)部位滯留；4、從循環(huán)系統(tǒng)滲出；5、浸入 腫瘤繼發(fā)部位并增殖形成新的腫瘤等過(guò)程。由于其復(fù)雜性，盡管己對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究， 腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是迄今了解得最少的腫瘤生物學(xué)過(guò)程。腫瘤轉(zhuǎn)移這一復(fù)雜過(guò)程是由多種基因調(diào) 節(jié)的。其中有些基因促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，叫做腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因。多年來(lái)，利用各種基因 過(guò)表達(dá)手段，人們找到了一些腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因，例如，Amf, Hgf/sf, TGF-p, MMP, UPA, p-catenin等。
另一類(lèi)基因抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生，叫做腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。通常，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因能 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移而對(duì)原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)無(wú)影響，在轉(zhuǎn)移病灶中常通過(guò)甲基化或轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾等一 系列機(jī)制表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)。為了更好地了解腫瘤轉(zhuǎn)移，人們?cè)噲D進(jìn)一步揭示腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基 因在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)射過(guò)程中的作用。顯而易見(jiàn)，尋找腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因需要通過(guò)降低腫瘤轉(zhuǎn)移 抑制基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。但是，由于沒(méi)有可靠的降低表達(dá)手段，長(zhǎng)期以來(lái)只確定了非常有限的 腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，目前只有NM23、 KNIl、 KISS1、 MKK4、 BrMSl、 Gasl等有限的基因 符合腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的定義標(biāo)準(zhǔn)，其中最為明確的是NM23和KNI。從而使得對(duì)腫瘤轉(zhuǎn) 移抑制基因的研究、開(kāi)發(fā)、利用無(wú)法進(jìn)行，極大地限制了對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的了解、診斷和治療。
美國(guó)科學(xué)家安德魯 法爾和克雷格 梅洛1998年發(fā)現(xiàn)了 RNA干擾機(jī)制，2006年他們兩 分享了諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 一項(xiàng)全新的技術(shù)在提出后短短幾年就得到諾貝爾獎(jiǎng)的肯定， 足見(jiàn)RNA干擾在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的開(kāi)創(chuàng)性意義和極大的應(yīng)用前景。這一可以使得基因在體降低表達(dá)
的機(jī)制，也為尋找腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因提供了條件。
最近，有人利用細(xì)胞離體培養(yǎng)模型和RNA干擾文庫(kù)進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的篩選，一 些腫瘤細(xì)胞株在凝膠基質(zhì)上進(jìn)行離體三維細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，迅速形成與原始細(xì)胞團(tuán)分開(kāi)的衛(wèi)星細(xì)胞集落。這一過(guò)程可以離體模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的幾個(gè)關(guān)鍵步驟1、從腫瘤組織遷移出去；2、在 腫瘤繼發(fā)部位滯留；3、浸入腫瘤繼發(fā)部位并增殖形成新的腫瘤等。RNA干擾文庫(kù)使得人類(lèi) 基因組的各種基因分別在腫瘤細(xì)胞株任意地降低表達(dá)。這樣，在腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達(dá) 的細(xì)胞，進(jìn)行凝膠基質(zhì)離體三維細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，形成衛(wèi)星細(xì)胞集落的能力大大增強(qiáng)，通過(guò)克隆 形成衛(wèi)星細(xì)胞集落的基因可以確定新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。這一篩選的優(yōu)點(diǎn)是1、部分地 模擬了腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程、操作相對(duì)簡(jiǎn)單；2、由于RNA干擾文庫(kù)可以有效地降低腫瘤轉(zhuǎn)移抑 制基因，有利于腫瘤轉(zhuǎn)移的形成，從而有利于篩選到腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。缺點(diǎn)是由于離體模 型不能完全模擬在體腫瘤轉(zhuǎn)移的各個(gè)環(huán)節(jié)和環(huán)境的影響，因而1、篩選到的候選基因只是 影響腫瘤轉(zhuǎn)移的部分過(guò)程，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因；2、不能篩選到一些影響模 型未能模擬的腫瘤轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。
也有人利用免疫缺陷小鼠細(xì)胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型和基因過(guò)表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移促 進(jìn)基因的篩選。由于腫瘤轉(zhuǎn)移是多種步驟的的在體過(guò)程，其復(fù)雜性是任何細(xì)胞模型所不能模 擬的。因而人們建立了在體研究腫瘤轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型--免疫缺陷小鼠細(xì)胞異體移植模型。就 是將腫瘤細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注入免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)體內(nèi)，由于毛細(xì)血管豐富，腫瘤 細(xì)胞在肺部滯留并增殖形成新的腫瘤。這一過(guò)程可以在體模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的幾個(gè)關(guān)鍵步驟 1、進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在其中存活并轉(zhuǎn)運(yùn)；2、在腫瘤繼發(fā)部位滯留；3、從循環(huán)系統(tǒng)滲出；4、 浸入腫瘤繼發(fā)部位并增殖形成新的腫瘤等。過(guò)表達(dá)文庫(kù)使得人類(lèi)基因組的各種基因分別在腫 瘤細(xì)胞株任意地過(guò)表達(dá)，腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移的能力大大增強(qiáng)。這樣，在 對(duì)照細(xì)胞不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，過(guò)表達(dá)文庫(kù)處理的腫瘤細(xì)胞也形成了肺腫瘤。通過(guò)分 離肺腫瘤，并克隆肺腫瘤的過(guò)表達(dá)基因可以確定新的腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因。這一篩選的優(yōu)點(diǎn) 是1、模擬了體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生過(guò)程和環(huán)境；2、由于過(guò)表達(dá)升高腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因，有 利于腫瘤轉(zhuǎn)移的形成，從而有利于篩選到腫瘤轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因。缺點(diǎn)是過(guò)表達(dá)升高腫瘤轉(zhuǎn)移抑 制基因后，不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因失活引起的腫瘤轉(zhuǎn)移，因而不利于篩選到腫瘤轉(zhuǎn)移抑 制基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種利用免疫缺陷小鼠細(xì)胞在體移 植腫瘤轉(zhuǎn)移模型比細(xì)胞模型更好地模擬腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的優(yōu)勢(shì)，和RNA干擾文庫(kù)使得人類(lèi)基因 組的各種基因分別在腫瘤細(xì)胞株任意地降低表達(dá)的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法。幾年來(lái)，通過(guò)利用人類(lèi)基因組的RNA干擾文庫(kù)，結(jié)合免疫缺陷小鼠細(xì)胞異體移植模型發(fā) 明了一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因篩選的新技術(shù)，并率先進(jìn)行了尤文氏肉瘤(Ewing' s sarcoma) 細(xì)胞的腫瘤肺轉(zhuǎn)移抑制基因篩選，確定了一批真正的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)完成的，本發(fā)明利用免疫缺陷小鼠細(xì)胞在體移植腫 瘤轉(zhuǎn)移模型比細(xì)胞模型更好地模擬腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生，利用RNA干擾文庫(kù)使得人類(lèi)基因組的各種 基因分別在腫瘤細(xì)胞株任意地降低表達(dá)，使得其中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達(dá)的細(xì)胞形成腫 瘤轉(zhuǎn)移的潛能大大增強(qiáng)，這樣，將RNA干擾文庫(kù)處理的細(xì)胞注入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，在對(duì) 照細(xì)胞不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達(dá)的細(xì)胞可以形成肺腫瘤，通 過(guò)分離肺腫瘤，并克隆肺腫瘤內(nèi)的降低表達(dá)基因可以確定并篩選新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。 本發(fā)明對(duì)所述腫瘤細(xì)胞進(jìn)行如下表型篩選
a. 注入小量腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對(duì)照和RNA文庫(kù)處理細(xì)胞都不形成肺腫 瘤；
b. 注入適量腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對(duì)照細(xì)胞不形成肺腫瘤，而RNA文庫(kù)處理 細(xì)胞形成肺腫瘤；
c. 注入大量腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對(duì)照和RNA文庫(kù)處理細(xì)胞都形成肺腫瘤， 兩者相比較，RNA文庫(kù)處理細(xì)胞形成更多肺腫瘤；
本發(fā)明對(duì)表型篩選后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行如下候選基因的鑒定
a. 從存活下來(lái)的腫瘤內(nèi)提取基因組DNA;
b. PCR擴(kuò)增從RNA干擾文庫(kù)中插入的DNA片段；
c. TA克隆法克隆PCR擴(kuò)增的DNA片段；
d. 挑選克隆，純化DNA;
e. 基因測(cè)序確定篩選基因。 本發(fā)明對(duì)篩選基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移的影響作如下分析
a. 利用RNA干擾降低基因表達(dá)作Loss-of-function分析；
b. 利用過(guò)表達(dá)作Gain-of-function分析；
c. 利用生化實(shí)驗(yàn)分析篩選基因影響腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。 本發(fā)明對(duì)篩選基因在轉(zhuǎn)移腫瘤內(nèi)的狀態(tài)作如下分析
a.檢測(cè)篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和樣品中突變；b. 檢測(cè)篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和樣品中低表達(dá)；
c. 檢測(cè)篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和樣品中被修飾，如甲基化等。 本發(fā)明的有益效果是從整個(gè)基因組水平篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，并用于
(1) 進(jìn)一步研究腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展及其作用機(jī)制；
(2) 發(fā)用此類(lèi)基因作為腫瘤的生物標(biāo)志，在診斷時(shí)，用于指導(dǎo)腫瘤治療方案的制定；在診 斷之后，用于評(píng)估治療效果和檢測(cè)復(fù)發(fā)；
(3) 用做腫瘤靶向治療的靶標(biāo)，通過(guò)增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移基因的功能達(dá)到防止、治療腫瘤轉(zhuǎn)移的 目的。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的主要技術(shù)內(nèi)容是由于免疫缺陷小鼠細(xì)胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型比細(xì)胞模型更
好地模擬腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生，而RNA干擾文庫(kù)使得人類(lèi)基因組的各種基因分別在腫瘤細(xì)胞株任意
地降低表達(dá)，使得其中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達(dá)的細(xì)胞形成腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能大大增強(qiáng)，這
樣，將RNA干擾文庫(kù)處理的細(xì)胞注入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，在對(duì)照細(xì)胞不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移的 條件下，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達(dá)的細(xì)胞可以形成肺腫瘤，通過(guò)分離肺腫瘤，并克隆肺腫 瘤內(nèi)的降低表達(dá)基因可以確定新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。
本發(fā)明所具有的特征是
A、 與過(guò)去從離體細(xì)胞模型著手不同，從在體動(dòng)物模型著手，更好地模擬了腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)
生的過(guò)程；
B、 利用降低基因表達(dá)的RNA干擾文庫(kù)，可以在哺乳細(xì)胞穩(wěn)定地低表達(dá)各種基因。
本發(fā)明采用如下技術(shù)路線(xiàn)
A、 表型篩選
a. 注入小量腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對(duì)照和RNA文庫(kù)處理細(xì)胞都不形成肺腫 瘤；
b. 注入適量腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對(duì)照細(xì)胞不形成肺腫瘤，而RNA文庫(kù)處 理細(xì)胞形成肺腫瘤；
c. 注入大量腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，對(duì)照和RNA文庫(kù)處理細(xì)胞都形成肺腫 瘤，兩者相比較，RNA文庫(kù)處理細(xì)胞形成更多肺腫瘤；
B、 候選基因鑒定a. 從存活下來(lái)的腫瘤內(nèi)提取基因組DNA;
b. PCR擴(kuò)增從RNA干擾文庫(kù)中插入的DNA片段；
c. TA克隆法克隆PCR擴(kuò)增的DNA片段；
d. 挑選克隆，純化DNA;
e. 基因測(cè)序確定篩選基因。
C、 分析篩選基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移的影響
a. 利用RNA干擾降低基因表達(dá)作Loss-of-function分析；
b. 利用過(guò)表達(dá)作Gain-of-function分析；
c. 利用生化實(shí)驗(yàn)分析篩選基因影響腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
D、 分析篩選基因在轉(zhuǎn)移腫瘤內(nèi)的狀態(tài)
a. 檢測(cè)篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和樣品中突變；
b. 檢測(cè)篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和樣品中低表達(dá)；
c. 檢測(cè)篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和樣品中被修飾，如甲基化等。 實(shí)施例1
免疫缺陷小鼠尾靜脈注射尤文氏肉瘤細(xì)胞TC71形成腫瘤肺轉(zhuǎn)移是一種穩(wěn)定、容易操 作、并被廣泛應(yīng)用的腫瘤轉(zhuǎn)移研究模型。結(jié)合利用本發(fā)明技術(shù)，我們己經(jīng)進(jìn)行了尤文氏肉瘤 細(xì)胞的腫瘤肺轉(zhuǎn)移抑制基因篩選，分別篩選到了一批尤文氏肉瘤細(xì)胞的腫瘤肺轉(zhuǎn)移抑制基因
(另外申請(qǐng)產(chǎn)品專(zhuān)利)。以此為例介紹
具體實(shí)施例方式
一、利用RNA干擾文庫(kù)DNA轉(zhuǎn)染菲尼克思(Phoenix)反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞 第一天準(zhǔn)備菲尼克思反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞
1、 轉(zhuǎn)染之前18-24小時(shí)，按3xl07l0厘米平板接種菲尼克思細(xì)胞到平板上；
2、 讓細(xì)胞貼壁10-24小時(shí)；
3、 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2/3時(shí)， 一個(gè)10厘米平板大約有5xl(T細(xì)胞。這時(shí)的包裝細(xì)胞最容 易轉(zhuǎn)染并產(chǎn)生最高滴度的病毒37°C。
*培養(yǎng)基DMEM， 10%胎牛血清，1%青_鏈霉素，1%谷氨酰胺。 第二天轉(zhuǎn)染
1、準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)染用的DNA并溶解在HEPES溶液中；2、 轉(zhuǎn)染之前大約5分鐘，在平板中加入25微摩氯喹(氯喹的儲(chǔ)藏濃度為50毫摩)； *氯喹通過(guò)中和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)微泡內(nèi)的pH而抑制溶酶體內(nèi)的DNA酶；
3、 在一個(gè)15毫升的試管內(nèi)，加入(以10厘米平板為例、室溫條件) 20微克文庫(kù)DNA和20微克輔助質(zhì)粒DNA; 62.5微升2摩爾的氯化鈣(手指輕彈混勻)；
加無(wú)菌雙蒸水至500微升總體積。
4、 快速加入500微升2倍的HEPES緩沖液，然后利用全自動(dòng)移液槍激烈吹氣泡5-15
秒；
5、 轉(zhuǎn)染之前大約5分鐘，給包裝細(xì)胞換已預(yù)熱至、含終濃度25微摩氯喹的培養(yǎng)液9毫
升；
6、 20分鐘之后，將HEPES/DNA混合液逐滴、快速加入平板。 注意
*在顯微鏡下觀(guān)察，應(yīng)該看到一些大小均一、分布均勻的細(xì)小黑色顆粒； *將平板放入37。C孵箱，前后左右輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板使DNA/CaP04顆粒均勻分布； * HEPES購(gòu)于Sigma (商品目錄號(hào):H-7006) *氯化鈣購(gòu)于Mallinkrodt (商品目錄號(hào)H-4160)
*由于pH非常重要，可分別配制pH 6.95、 pH 7.00、 pH 7. 05的緩沖液進(jìn)行測(cè)試； *使用之前將所有的試劑復(fù)蘇到室溫。
第三天轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，換液、準(zhǔn)備好感染細(xì)胞TC71
1、 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，給包裝細(xì)胞換預(yù)熱至37°C的培養(yǎng)液10毫升(不要讓氯喹在培養(yǎng)液 中影響細(xì)胞超過(guò)24小時(shí))；
2、 將感染靶細(xì)胞分盤(pán)，細(xì)胞密度為2xl06/10厘米平板，培養(yǎng)液DMEM， 10%胎牛血 清，1%青-鏈霉素，1%谷氨酰胺。
第四天轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清感染耙細(xì)胞TC71
1、 用移液槍從轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞中吸取上清并置于15毫升的試管內(nèi)，1500轉(zhuǎn)/分鐘離 心5分鐘以除去細(xì)胞碎片；
2、 用0.45微米濾膜過(guò)濾；3、 從靶細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)吸除2毫升培養(yǎng)液；
4、 在靶細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入5微升polybrene (polybrene的1000倍儲(chǔ)藏濃度為5毫克/ 毫升)，混勻；
5、 在靶細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入2毫升含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清，置于32-37°C，輕輕混勻；
6、 每隔4-6小時(shí)進(jìn)行重復(fù)感染。
第五天吸除含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清感染后24小時(shí)吸除含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清，加入新 鮮的培養(yǎng)基DMEM， 10%胎牛血清，1%青-鏈霉素，1%谷氨酰胺。并加入5微升puromycin (puromycin的1000倍儲(chǔ)藏濃度為5毫克/毫升)篩選24小時(shí)。
二、 處理(表型篩選)
第六天感染后48小時(shí)(puromycin作用24小時(shí))，靶細(xì)胞TC71可用于各種處理，進(jìn) 行表型篩選。
1、 用胰酶消化收集感染靶細(xì)胞，并作成濃度不同的PBS懸液；
2、 選擇6周齡大小SCID小鼠30只，分成三組，按0. 25、 0. 5、 lxl07200nl/只濃度分 別進(jìn)行尾靜脈注射RNA干擾文庫(kù)處理細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞。
三、 挑肺腫瘤
6周后，利用C02殺死實(shí)驗(yàn)用鼠，打開(kāi)胸腔取出肺臟，拍照后挑取腫瘤塊。
四、 基因鑒定
1、 剪碎腫瘤塊，利用Roche生產(chǎn)的High Pure PCR Template Preparation試劑盒(商 品目錄號(hào)11796828001)從收集的腫瘤樣品中提取基因組DNA;
2、 以基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增插入細(xì)胞基因組DNA的RNA干擾文庫(kù)特異片段
(1) 擴(kuò)增引物
RNAi clone 1: 5， -gag ggc eta ttt ccc atg at-3， (20bp)
RNAi clone 2: 5， -gta ata cga etc act ata ggg cct ctt egg aga tea get tc-3， (41bp)
(2) PCR反應(yīng)體系
H20 13. 0 pi
10xPCR Buffer 2. 5 pi25mM MgCl2 2. 0
2. 5mM dNTP 2. 0 pi
lOpM primer F2. 0 pi
10|aM Primer R 2. 0 |al
Taq 0. 5 pi
Template 1. 0 jul
Total 25. 0 pi
(3) PCR反應(yīng)條件
1. 94。C 3:00
2. 94°C 0:15
3. 60°C 0:45
4. 72。C 2:00
5. Go to 2 35X
6. 72°C 4:00
7. 40C forever
(4) PCR反應(yīng)結(jié)果在0.8%瓊脂糖凝膠水平電泳，觀(guān)察一0.6kb條帶。
3、 利用Irwitrogen Life Technologies生產(chǎn)的T0P0 TA克隆試劑盒(商品目錄號(hào)-K4600-01)將PCR擴(kuò)增的插入細(xì)胞基因組DNA的RNA千擾文庫(kù)特異片段克?。?br> 4、 挑選得到的克隆，置于含2毫升青霉素抗性的LB內(nèi)，37T振蕩培養(yǎng)16小時(shí)；
用Sigma-Aldrich生產(chǎn)的G匿Elute Plasmid Minipr印試劑盒(商品目錄號(hào):PLN350)提 取質(zhì)粒；
5、 將質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序引物為反向M13;
6、 利用公用的NCBI Blast程序(http:〃blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)確定 基因；
對(duì)候選基因作生物信息學(xué)分析，了解基因的基本情況及其已知的功能。
12種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因被鑒定出來(lái)。
五、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因影響腫瘤轉(zhuǎn)移的鑒定
1、分別構(gòu)建腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體的RNA干擾和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；2、 利用RNA文庫(kù)同樣的技術(shù)和步驟分別建立穩(wěn)定的RNA干擾和過(guò)表達(dá)腫瘤細(xì)胞；
3、 檢測(cè)各細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)移能力
(1) 免疫缺陷小鼠細(xì)胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型檢測(cè)
選擇6周齡大小SCID小鼠20只，分成兩組，按0. 5xl07200)al/只濃度分別進(jìn)行尾靜脈 注射穩(wěn)定的RNA干擾腫瘤細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，6周后，利用C02殺死實(shí)驗(yàn)用鼠，打開(kāi)胸腔取出 肺臟，拍照、記數(shù)腫瘤數(shù)量和腫瘤塊大小。實(shí)驗(yàn)組有更多的肺腫瘤形成，形成的腫瘤塊體積 更大；
選擇6周齡大小SCID小鼠20只，分成兩組，按1. Oxl07200nl/只濃度分別進(jìn)行尾靜脈 注射穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)腫瘤細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，6周后，利用C02殺死實(shí)驗(yàn)用鼠，打開(kāi)胸腔取出肺 臟，拍照、記數(shù)腫瘤數(shù)量和腫瘤塊大小。實(shí)驗(yàn)組有更少的肺腫瘤形成，形成的腫瘤塊體積更 小。
(2) 正常小鼠細(xì)胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型檢測(cè)
由于免疫缺陷小鼠細(xì)胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型不能模擬從腫瘤組織遷移出去這一起始步 驟，經(jīng)免疫缺陷小鼠細(xì)胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型證實(shí)后，我們繼續(xù)進(jìn)行更嚴(yán)格的檢測(cè)，即利 用正常健康小鼠，進(jìn)行足底注射，然后觀(guān)測(cè)自發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
選擇6周齡大小C57BL/6小鼠20只，分成兩組，按1. Oxl07200pl/只濃度分別進(jìn)行足 底皮下注射穩(wěn)定的RNA干擾腫瘤細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，當(dāng)腫瘤塊達(dá)到100 mm3時(shí)，割除腫瘤塊，4 周后利用C02殺死實(shí)驗(yàn)用鼠，打開(kāi)胸腔取出肺臟，拍照、記數(shù)腫瘤數(shù)量和腫瘤塊大小。實(shí)驗(yàn) 組有更多的肺腫瘤形成，形成的腫瘤塊體積更大；
選擇6周齡大小C57BL/6小鼠20只，分成兩組，按2. 0xl07200(al/只濃度分別進(jìn)行足 底皮下注射穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)腫瘤細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞，當(dāng)腫瘤塊達(dá)到100 mm3時(shí)，割除腫瘤塊，4 周后利用C02殺死實(shí)驗(yàn)用鼠，打開(kāi)胸腔取出肺臟，拍照、記數(shù)腫瘤數(shù)量和腫瘤塊大小。實(shí)驗(yàn) 組有更少的肺腫瘤形成，形成的腫瘤塊體積更小。
六、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
1、 各種實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器；
2、 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma Scientific, Inc.,美國(guó));
3、 超凈工作臺(tái)(Forma Scientific, Inc.,美國(guó))；
4、 分光光度計(jì)(BIO-TEK INSTRUMENTS, Inc.,美國(guó))；5、 Z1-顆粒計(jì)數(shù)器(BECKMAN COULTER,美國(guó))；
6、 倒置顯微鏡(尼康，日本)；
7、 解剖顯微鏡(尼康，日本)；
8、 PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))。
權(quán)利要求
1、一種利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，該方法是利用免疫缺陷小鼠細(xì)胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型比細(xì)胞模型更好地模擬腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生，利用RNA干擾文庫(kù)使得人類(lèi)基因組的各種基因分別在腫瘤細(xì)胞株任意地降低表達(dá)，使得其中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達(dá)的細(xì)胞形成腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能大大增強(qiáng)，這樣，將RNA干擾文庫(kù)處理的細(xì)胞注入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，在對(duì)照細(xì)胞不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達(dá)的細(xì)胞可以形成肺腫瘤，通過(guò)分離肺腫瘤，并克隆肺腫瘤內(nèi)的降低表達(dá)基因可以確定并篩選新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，其特征在 于所述的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行如下表型篩選-a. 注入小量腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后時(shí)，對(duì)照和RNA文庫(kù)處理細(xì)胞都不形成肺腫 瘤；b. 注入適量腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后時(shí)，對(duì)照細(xì)胞不形成肺腫瘤，而RNA文庫(kù)處 理細(xì)胞形成肺腫瘤；c. 注入大量腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后時(shí)，對(duì)照和RNA文庫(kù)處理細(xì)胞都形成肺腫 瘤，兩者相比較，RNA文庫(kù)處理細(xì)胞形成更多肺腫瘤；
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，其特征在 于所述的對(duì)表型篩選后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行如下候選基因的鑒定a. 從存活下來(lái)的腫瘤內(nèi)提取基因組DNA;b. PCR擴(kuò)增從RNA干擾文庫(kù)中插入的DNA片段；c. TA克隆法克隆PCR擴(kuò)增的DNA片段；d. 挑選克隆，純化DNA;e. 基因測(cè)序確定篩選基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，其特征在 于所述的對(duì)篩選基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移的影響作如下分析a. 利用RNA干擾降低基因表達(dá)作Loss-of-function分析；b. 利用過(guò)表達(dá)作Gain-of-function分析；c. 利用生化實(shí)驗(yàn)分析篩選基因影響腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，其特征在 于所述的對(duì)篩選基因在轉(zhuǎn)移腫瘤內(nèi)的狀態(tài)作如下分析a. 檢測(cè)篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和樣品中突變；b. 檢測(cè)篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和樣品中低表達(dá)；c. 檢測(cè)篩選基因是否在轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞和樣品中被修飾，如甲基化等。
全文摘要
一種利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的方法，它是利用免疫缺陷小鼠細(xì)胞在體移植腫瘤轉(zhuǎn)移模型比細(xì)胞模型更好地模擬腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生，利用RNA干擾文庫(kù)使得人類(lèi)基因組的各種基因分別在腫瘤細(xì)胞株任意地降低表達(dá)，使得其中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達(dá)的細(xì)胞形成腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能大大增強(qiáng)，這樣，將RNA干擾文庫(kù)處理的細(xì)胞注入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，在對(duì)照細(xì)胞不能形成腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因降低表達(dá)的細(xì)胞可以形成肺腫瘤，通過(guò)分離肺腫瘤，并克隆肺腫瘤內(nèi)的降低表達(dá)基因可以確定并篩選新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因；本發(fā)明從整個(gè)基因組水平篩選腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，并用于(1)進(jìn)一步研究腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展及其作用機(jī)制；(2)發(fā)用此類(lèi)基因作為腫瘤的生物標(biāo)志，在診斷時(shí)，用于指導(dǎo)腫瘤治療方案的制定；在診斷之后，用于評(píng)估治療效果和檢測(cè)復(fù)發(fā)；(3)用做腫瘤靶向治療的靶標(biāo)，通過(guò)增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移基因的功能達(dá)到防止、治療腫瘤的轉(zhuǎn)移的目的。
文檔編號(hào)A61K49/00GK101455848SQ20091009526
公開(kāi)日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月5日
發(fā)明者羅如意, 黃行許 申請(qǐng)人:黃行許;宋建華