專利名稱：鴨黃病毒病滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物疫苗領(lǐng)域，涉及一種鴨黃病毒病滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
“鴨黃病毒病”(暫名)又名“鴨出血性卵巢炎”、“蛋鴨黃病毒病”、“鴨高熱減蛋綜合征”和“新型黃病毒BYD引起的產(chǎn)蛋下降綜合征”是2010年在中國(guó)浙江、福建、山東、廣東等地首次發(fā)現(xiàn)的一種新鴨病，主要發(fā)生于蛋鴨、也發(fā)生于種鵝、肉鴨。蛋鴨發(fā)生此病時(shí)， 臨床表現(xiàn)為肢體站立不穩(wěn)，行走困難，采食量下降，產(chǎn)蛋量驟然減少，減蛋幅度很大，5天內(nèi)減蛋超過(guò)90%或者絕產(chǎn)，部分病鴨在數(shù)日內(nèi)死亡，死亡率為5% 10%。剖檢病變?yōu)槁殉舶l(fā)生出血、萎縮、卵泡破裂或萎縮等。此前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)類似疫病。2010年藤澤泱、曹貞貞、萬(wàn)春和等、2011年蘇敬良等證明該病病原屬于黃病毒科黃病毒屬鴨黃病毒(Flaviviridae， Flavivirus, Duck flavivirus)。2011年胡奇林等從廣東省發(fā)生“鴨黃病毒病”的蛋鴨中分離到1株鴨黃病毒JM株， 對(duì)JM進(jìn)行了鑒定，測(cè)定了 JM株部分理化和生物學(xué)特性，并進(jìn)行了動(dòng)物回歸試驗(yàn)等。迄今為止，未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外有關(guān)“鴨黃病毒病”疫苗特別是滅活疫苗研究的報(bào)道。因此， 研制一種安全有效的“鴨黃病毒病”疫苗對(duì)我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鴨黃病毒病滅活疫苗，該滅活疫苗安全性好，免疫效果可靠。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述疫苗的制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
一種鴨黃病毒病滅活疫苗，含有經(jīng)滅活的鴨黃病毒(/ viviridae, Flavivirus, Duck fla vi virus )毒株及佐劑。優(yōu)選的，所述佐劑為法國(guó)SEPPIC公司Montanide ISA 71 VG佐劑。優(yōu)選的，所述鴨黃病毒毒株為鴨黃病毒JM株，已于2011年10月14日送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC V201131。上述的“鴨黃病毒病”滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟
1)將鴨黃病毒毒株的生產(chǎn)用種毒進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，收獲病毒液；
2)將收獲的病毒液滅活；
3)將滅活后的病毒液加入佐劑中，乳化后即得。優(yōu)選的，步驟1)的具體操作為將鴨黃病毒毒株的生產(chǎn)用種毒經(jīng)尿囊腔接種 10 12日齡麻鴨胚或8 11日齡雞胚或10 13日齡番鴨胚，37°C培養(yǎng)，收集接種后48 120 小時(shí)死亡胚，置于4、°C冷卻414小時(shí)，無(wú)菌收獲含毒尿囊液。優(yōu)選的，步驟2)的具體操作為將收獲的含毒尿囊液加入甲醛至總量的 0. 2% 0· 3%,于37°C滅活20 28小時(shí)。
優(yōu)選的，步驟3)的具體操作為將20^40體積份滅活后的病毒液加入6(Γ80體積份的佐劑中，在高速勻漿機(jī)中乳化。鴨黃病毒JM株，已于2011年10月14日送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為 CCTCC V201131。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明的滅活疫苗安全性好，分別以1. 5ml/只和2. 5ml/只接種產(chǎn)蛋鴨后未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)；免疫效果好，對(duì)產(chǎn)蛋鴨以該疫苗1. 5ml/只免疫后14天/12天用強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊，結(jié)果，攻毒對(duì)照組從攻毒后第2天開(kāi)始產(chǎn)蛋明顯下降，第8天開(kāi)始停止產(chǎn)蛋或者降低至20%，攻毒后17天內(nèi)平均產(chǎn)蛋率為17. 8%/20. 3%，而本發(fā)明的疫苗免疫組攻毒后17天內(nèi)平均產(chǎn)蛋率為67. 03%/67. 2% 71. 7%，保護(hù)率為60%/59% 65%，白油佐劑疫苗對(duì)照組攻毒后17天內(nèi)平均產(chǎn)蛋率為29. 3%/33. 1%，保護(hù)率為14%/16. 4%，表明本發(fā)明的疫苗免疫鴨產(chǎn)蛋量比未免疫攻毒對(duì)照組及白油佐劑疫苗對(duì)照組鴨有顯著提高，證明該疫苗能保護(hù)蛋鴨抵抗強(qiáng)毒的攻擊，可以用于臨床上預(yù)防“鴨黃病毒病”，具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。


圖1為黃病毒科黃病毒屬鴨黃病毒廣東株(JM)的電鏡照片(100，000X)；
圖2為JM株的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖(泳道1-6均為疑似ARV臨床病料、泳道7 為 ddH20，泳道 8、9、14、15 禾Π 17 分別為JMDE3、JMDE4、JMDEl、JMDE2 和 JMDE5 ；泳道 10-13 分別為NDV、ARV、IBDV和MDRV ；泳道16為DNA分子量Marker)
圖3為鴨黃病毒JM株基因組ORF 7個(gè)片段基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果； 圖4為麻鴨感染JM株第5天后剖檢照片(a為正常對(duì)照組，b為感染組。)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。實(shí)施例1
一、疫苗生產(chǎn)用毒株 1、病毒來(lái)源、保藏情況
本疫苗生產(chǎn)用種毒株是黃病毒科黃病毒屬鴨黃病毒廣東株(JM)，是本發(fā)明人于2011 年從廣東省江門市發(fā)生產(chǎn)蛋下降的蛋鴨卵巢等組織中用麻鴨胚經(jīng)尿囊腔接種分離而得，已于2011年10月14日送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC V201131。經(jīng) PCR、病毒回歸試驗(yàn)、病毒形態(tài)電鏡觀察等方法鑒定。、病毒株特性
(1)鴨黃病毒JM株的形態(tài)
取含毒尿囊液JMDE4于4 °C，3000r/min離心20min后，取上清；再于4 °C，5000r/ min離心40min，取上清；上清液于4°C, 40,000r/min離心120min，取沉淀，用少量0. 01M, pH7. OPBS重懸，此重懸液即為初步純化病毒。初步純化病毒用2. 5%磷鎢酸負(fù)染，在 JE-1200EX透射電鏡下觀察，結(jié)果能看到直徑50nm左右，圓形的病毒粒子(如圖1所示)。(2)鴨黃病毒JM株的分子生物學(xué)鑒定O) PCR鑒定
牛艮據(jù)蘇敬良等 艮道(Jingliang Su, Shuang Li, Xudong Hu, et al. Duck Egg — Drop Syndrome Caused BYDVirus, aNew Tembusu-RelatedFlavivirus. PLoS ONE 6(3): el8106.)，合成了一對(duì)鴨黃病毒特異引物TV-3(f)、TV-3 (r)，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為401bp。病毒 RNA抽提，取含毒尿囊液JMDE3、JMDE4、JMDEl、JMDE2和JMDE5，同時(shí)用新城疫病毒等作為陰性對(duì)照，用 Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 4. O抽提試劑盒按使用說(shuō)明書進(jìn)行抽提。反轉(zhuǎn)錄(cDNA合成)取21ul病毒RNA抽提產(chǎn)物、加入Random 6mers 2ul,加 dNTPs如1，混勻，65°C，IOmin,冰浴2 3min，再在上述反轉(zhuǎn)錄管中加入DTT 4ul, 5XM-MLV buffer 8ul，力口入 M-MLV (Invitrogen 公司產(chǎn)品)，混勻，30°C，lOmin，再 37°C，60min。PCR擴(kuò)增引物TV-3 (f)、TV_3 (r)的PCR擴(kuò)增按以下進(jìn)行反應(yīng)體積25 μ 1，DEPC 水 26ul，ExTaq buffer 5ul, dNTPs 3ul，引物 TV_3 (f) 3ul，TV_3(r) 3ul, ExTaq 0.25ul，混勻后分成2份，每份20 ul，在反應(yīng)體系中再加入5ulcDNA模板。PCR反應(yīng)條件為94°C5min ； 940C 30sec，52°C 30sec，72°C 30sec，;35 個(gè)循環(huán)；最后，72°C延伸 lOmin。用含 Goldenview (天澤基因公司產(chǎn)品)的1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。結(jié)果陰性對(duì)照和水均未見(jiàn)任何條帶，只有JM株出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA片段(如圖2所示)。②JM株全基因組序列分析
A 參照GenBank中已公布的鴨黃病毒BYD-I株(蘇敬良等，同前)的全基因組序列， 在進(jìn)行黃病毒屬多序列比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，利用黃病毒基因組中較保守區(qū)域，應(yīng)用I^rimer Premier 5. O軟件設(shè)計(jì)了 7對(duì)引物，分別用于擴(kuò)增約1200-1900 bp長(zhǎng)度的鴨黃病毒基因片段(引物序列見(jiàn)表1)，所有引物由^witrogen合成。
權(quán)利要求
1.一種鴨黃病毒病滅活疫苗，含有經(jīng)滅活的鴨黃病毒(Flaviviridae， Flavivirus, Duck flavivirus)毒株及佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨黃病毒病滅活疫苗，其特征在于，所述佐劑為法國(guó)SEPPIC 公司 Montanide ISA 71 VG 佐劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨黃病毒病滅活疫苗，其特征在于，所述鴨黃病毒毒株為鴨黃病毒JM株，已于2011年10月14日送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCC V201131。
4.權(quán)利要求廣3任一項(xiàng)所述的鴨黃病毒病滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟1)將鴨黃病毒毒株的生產(chǎn)用種毒進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，收獲病毒液；2)將收獲的病毒液滅活；3)將滅活后的病毒液加入佐劑中，乳化后即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鴨黃病毒病滅活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟1)的具體操作為將鴨黃病毒毒株的生產(chǎn)用種毒經(jīng)尿囊腔接種1(Γ12日齡麻鴨胚或8 11日齡雞胚或1(Γ13日齡番鴨胚，37°C培養(yǎng)，收集接種后48 120小時(shí)死亡胚，置于4、°C冷卻414小時(shí)，無(wú)菌收獲含毒尿囊液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鴨黃病毒病滅活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟2)的具體操作為將收獲的含毒尿囊液加入甲醛至總量的0. 29ΓΟ. 3%，于37°C滅活2018小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鴨黃病毒病滅活疫苗的制備方法，其特征在于，步驟3)的具體操作為將2(Γ40體積份滅活后的病毒液加入6(Γ80體積份的佐劑中，在高速勻漿機(jī)中乳化。
8.鴨黃病毒JM株，已于2011年10月14日送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為 CCTCC V201131。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鴨黃病毒病滅活疫苗及其制備方法。本發(fā)明的鴨黃病毒病滅活疫苗含有經(jīng)滅活的鴨黃病毒毒株及佐劑，其制備方法如下將鴨黃病毒毒株的生產(chǎn)用種毒進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，收獲病毒液；將收獲的病毒液滅活后加入佐劑中，乳化后即得鴨黃病毒病滅活疫苗。本發(fā)明還公開(kāi)了鴨黃病毒JM株，已于2011年10月14日送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)為CCTCCV201131。本發(fā)明的“鴨黃病毒病”滅活疫苗安全性好，不會(huì)對(duì)鴨只產(chǎn)生任何不良反應(yīng)；免疫效果好，能顯著提高蛋鴨對(duì)鴨黃病毒的抵抗力，可以用于臨床上預(yù)防“鴨黃病毒病”，具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102397539SQ20111038092
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者孫敏華, 李林林, 胡奇林, 董嘉文, 袁建豐 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所