專利名稱：利用煙酸化合物提高瘦素水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙酸衍生物及煙酸在調(diào)控瘦素調(diào)控通路中的用途。具體地，下文將闡述煙酸和它的衍生物(如煙酸酯，尤其月桂基煙酸酯)刺激瘦素的產(chǎn)生的作用。
背景技術(shù)：
瘦素(leptin)是一種167個(gè)氨基酸的蛋白，由ob基因編碼。它是在鑒定有肥胖傾向的品種，即″ob/ob″小鼠的分子缺陷小鼠的研究過程中被鑒定出的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)瘦素是由黃色脂肪組織(white adipose tissue)產(chǎn)生，極少量由棕色脂肪組織產(chǎn)生。與此分子有關(guān)的專利文獻(xiàn)例如美國(guó)專利6,132,724；6,124,448；6,124,439；6,068,976；6,048,837和5,795,909，它們都引入本文作為參考。
最初的有關(guān)瘦素的報(bào)道提示它是一種由脂肪細(xì)胞衍生的信號(hào)傳導(dǎo)分子，即“adiposat”，該分子限制食物的攝入及增加能量的消耗。支持這一觀點(diǎn)的證據(jù)包括，當(dāng)給由于基因或飲食的原因而導(dǎo)致肥胖的嚙齒動(dòng)物注射瘦素后，可以觀察到體重下降并且對(duì)代謝的控制得到改善。在ob/ob小鼠中，由于其ob基因中具有突變而導(dǎo)致合成有缺陷的瘦素分子，這些分子在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生降解，因此在這樣的小鼠中瘦素的作用尤其重要。ob/ob小鼠都表現(xiàn)肥胖，有糖尿病，并且不育，它們的活力、代謝和體溫水平都下降。此外，瘦素缺陷型ob/ob小鼠的傷口愈合大大延遲。全身或局部給予瘦素已經(jīng)證實(shí)在該模型中增強(qiáng)傷口的再上皮化。見Frank，et al.，J.Clin.Invest.106501-509(2000)。因此，ob/ob小鼠已用作測(cè)試藥物使受損的傷口愈合能力逆轉(zhuǎn)的模型系統(tǒng)。
除了上述對(duì)瘦素缺陷型小鼠的作用外，瘦素還可以顯著促進(jìn)野生小鼠的再上皮化。另外，STAT 3和過氧化物酶體增殖體活化受體(PPAR)作為瘦素通路的下游調(diào)節(jié)劑，也參與了皮膚自穩(wěn)。見Komuvres，et al.，J Invest.Dermatol 115361-267(2000)。已證實(shí)STAT 3在皮膚的重建，包括毛囊再生(hair follicle cycling)及傷口愈合中起必不可少的作用。而且目前已知PPARα激活劑可以使細(xì)胞增殖(包括上皮分化)正常化，并加速表皮通透屏障的發(fā)育。見Hanley，et al.，J.Clin Inv.100705712(1997)。最近已證實(shí)，PPARα激活劑能抑制鼠的皮膚腫瘤進(jìn)展，這與PPARα在皮膚生理學(xué)中具有作用是一致的。見于Thuillier et al.，Mol.Carcinogenesis 29134-142(2000)。
其它對(duì)瘦素的研究發(fā)現(xiàn)，該分子改變與脂肪生成、脂肪分解及能量代謝有關(guān)的多種肥胖特異性基因的轉(zhuǎn)錄。它還顯示可以觸發(fā)黃脂肪組織的凋亡。該分子的大多數(shù)代謝效應(yīng)是其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍組織中的受體相互作用的結(jié)果。這種受體已經(jīng)被鑒定出來，它是I類細(xì)胞因子受體，與IL-2受體、干擾素受體和生長(zhǎng)激素受體屬于同一家族。簡(jiǎn)單的講，瘦素受體將瘦素信號(hào)傳遞給三種STAT分子STAT3，5，和6，它們統(tǒng)稱為″fat-STATS″。
對(duì)瘦素的已被接受的觀點(diǎn)是，它的主要作用是通過調(diào)節(jié)食物的攝入而防止肥胖、通過對(duì)低溫中樞的作用而產(chǎn)熱。但最近的證據(jù)提示，瘦素可能還有另一種作用即，它表現(xiàn)出抗脂肪活性，其中通過對(duì)β氧化作用進(jìn)行瘦素介導(dǎo)的調(diào)節(jié)，可防止脂肪酸在無脂肪組織中的過度積累。瘦素可以增加與脂肪酸氧化有關(guān)的酶，并且刺激此前未觀察到的脂肪分解形式，在該分解中，釋放甘油的同時(shí)并不成比例地釋放游離脂肪酸。
瘦素的多種受體同工型在機(jī)體全身各處表達(dá)，這提示其還具有額外的對(duì)外-神經(jīng)組織的生理功能。已有許多研究通過測(cè)定瘦素對(duì)糖類代謝和脂肪代謝及酶表達(dá)的影響(如果有)而評(píng)價(jià)組織對(duì)瘦素的反應(yīng)。如果觀察到瘦素對(duì)給定的組織有直接作用，就提示傳自激素/受體結(jié)合的信號(hào)傳導(dǎo)通路被快速誘導(dǎo)。作用機(jī)制可以概述如下瘦素激活脂肪組織中的STAT 3，瘦素與其受體的結(jié)合導(dǎo)致受體寡聚化，JAK激活，再引起STAT磷酸化；磷酸化STATS形成二聚體，移位到細(xì)胞核內(nèi)激活靶基因。簡(jiǎn)言之(i)瘦素激活STAT 3，并增強(qiáng)PPARα活性；(ii)PPARα/PPRE導(dǎo)致apo A-I在肝細(xì)胞中的表達(dá)；(iii)STAT3/PPARα對(duì)皮膚自穩(wěn)而言必不可少；(iv)PPARα激活劑抑制小鼠皮膚腫瘤的進(jìn)展。參見，例如，Bendinelli，et al.，Mol.Cell Endocrin 16811-20(2000)；Unger，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 962327-2332(1992)；Peters，et al.，J.Biol.Chem.27227307-27312(1997)；Hanley，et al.，J.Clin.Invest.100705-712(1997)；Sano，et al.，EMBOJ 184657-4666(1999)；Thuillier，et al.，Mol.Carcin 29134-142(2000)。
除了在能量調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，瘦素還能調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及免疫功能。瘦素水平在炎癥和感染期間急劇升高，它可能是宿主對(duì)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的一種保護(hù)性成分。瘦素的缺陷增加對(duì)炎癥刺激和感染因素刺激的易感性，而且與細(xì)胞因子的產(chǎn)生失調(diào)有關(guān)。見Faggioni，et al.，F(xiàn)ASEB J.152565-2571(2001)。
另外，我們可設(shè)想如上所述的途徑也能導(dǎo)致皮膚的自穩(wěn)和重建，從而引起表皮屏障的發(fā)育，傷口愈合，和毛發(fā)生長(zhǎng)，而且因免疫功能的增強(qiáng)導(dǎo)致對(duì)皮膚腫瘤進(jìn)展的抑制。這些都概述在圖1中。
煙酸是輔酶煙酰胺二核苷酸(NAD)和NAD磷酸(NADP)的形成所必需的，在所述形成中，煙酰胺組分是多種生物學(xué)氧化還原反應(yīng)的電子受體或氫供體。具體的說，NAD的功能是作為細(xì)胞內(nèi)呼吸作用中的電子載體，和燃料分子氧化中的輔酶。NADP則作為氫供體參與還原型生物合成，包括脂肪酸和類固醇的合成。NAD也是如此，它同樣可以作為一種輔酶起作用。
NAD是三類將ADP-核糖單位轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)的酶的底物，所述的酶參與DNA修復(fù)，細(xì)胞分化和細(xì)胞的鈣代謝。煙酸按照1.5-4克/天給藥可改善血中膽固醇的水平，這與煙酰胺相反。
阿西莫司(Acipimox)是一種商品，它是煙酸類似物和降血脂劑。經(jīng)證實(shí)，它能提高轉(zhuǎn)基因小鼠的血漿瘦素水平。參見，例如Worm，et al.，Eur.J.Endocrin 143389-395(2000)。
有報(bào)道煙酸衍生物對(duì)于皮膚細(xì)胞的保護(hù)，DNA的修復(fù)等都有作用，參見如Jacobson等人1999年12月1日提交的美國(guó)專利6,337,065，其全文引入本文作為參考。該申請(qǐng)描述了各種煙酸衍生物，包括十二烷基或月桂基煙酸酯?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)這類煙酸酯(如月桂基煙酸酯)刺激瘦素生產(chǎn)的程度未見于煙酸的情況中。由于煙酸酯可配制成適于局部用藥的物質(zhì)，因此提供了一種刺激和生產(chǎn)瘦素的新途徑。


圖1是據(jù)信能在本發(fā)明中起作用的一種假定的機(jī)制和效應(yīng)途徑。平線意味著目標(biāo)狀況受到抑制。因此，瘦素對(duì)皮膚腫瘤進(jìn)展的效應(yīng)是抑制該腫瘤。
圖2概述了與體外脂肪細(xì)胞中瘦素生產(chǎn)有關(guān)的數(shù)據(jù)。
圖3是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較，所述實(shí)驗(yàn)是設(shè)計(jì)用于確定當(dāng)以月桂基煙酸酯的形式給予煙酸后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血漿瘦素水平。
圖4示實(shí)施例2所得數(shù)據(jù)，在該實(shí)施例中測(cè)定了血清瘦素水平?！錘IA114″是月桂酯，″NIA 112″是肉豆蔻酯。
圖5概述了給予煙酸酯后傷口大小變化的結(jié)果。
圖6是四項(xiàng)目平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，這些實(shí)驗(yàn)測(cè)定了鼠血清瘦素的水平。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述實(shí)施例1脂肪組織被認(rèn)為是動(dòng)物中瘦素生產(chǎn)的主要來源。因此，設(shè)計(jì)一些實(shí)驗(yàn)來確定煙酸對(duì)脂肪細(xì)胞中瘦素生產(chǎn)的影響。
人類的脂肪細(xì)胞用標(biāo)準(zhǔn)的方法獲得，簡(jiǎn)單的說，從皮下脂肪組織中收集前脂肪細(xì)胞，然后用膠原酶處理。將前脂肪細(xì)胞鋪板，使其進(jìn)行3周的分化，以形成脂肪細(xì)胞。
然后將脂肪細(xì)置于0.6ml加有2％小牛血清白蛋白的DMEM/F-10培養(yǎng)基保溫。另外，培養(yǎng)時(shí)分別加或不加0.1mM煙酸。
24小時(shí)后用購買的ELISA試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中的瘦素濃度。
結(jié)果如圖2所示，加了煙酸的培養(yǎng)基中瘦素的生產(chǎn)增加62％。
實(shí)施例2將購買的雌性apoB/CETP雙轉(zhuǎn)基因小鼠分成3組，按每籠6只圈養(yǎng)。一組作為對(duì)照，接受標(biāo)準(zhǔn)飲食，不加煙酸。背部剃毛，加載與應(yīng)用于下述第3組的洗液一樣的洗液，其中不含月桂基煙酸酯。第2組給予鈉鹽形式的煙酸，將其溶于飲用水中，濃度為0.75％(0.63％游離酸)。動(dòng)物的煙酸攝取基于水的消耗來評(píng)估，約為1400mg/kg體重，這是基于每100g體重估計(jì)消耗23ml水，而平均體重為25g。這相當(dāng)于70kg的人大約每天8.4g的量。參見Freireich，et al.，Cancer Chemother.Rep.50219-244(1966)，引入本文作參考。對(duì)于第3組，背部剃毛，并在剃毛區(qū)涂上了月桂基煙酸酯，用的是含10％(wt/wt)月桂基煙酸酯的200mg洗液。所用煙酸酯的量大約是80-800mg/kg，仍然假設(shè)平均體重為25g。按照Freireich(上文)所述，這相當(dāng)于約0.48-4.8g/天/70kg的人。該洗液每天應(yīng)用并持續(xù)13周。
血漿中瘦素水平使用鼠瘦素放射免疫分析商品來測(cè)定?？崭?6小時(shí)后取眶后血管束的血液樣本進(jìn)行RIA。這些血液樣本收集后，2000xg離心15分鐘，獲得血漿。結(jié)果如圖3所示口服煙酸確實(shí)提高了循環(huán)中瘦素的水平，而月桂基煙酸酯在這方面更勝于它。
實(shí)施例3本實(shí)施例是“實(shí)施例2”的延續(xù)。具體地，BALB/C小鼠自肩胛骨至尾部剃毛。然后給這些鼠局部應(yīng)用不同濃度的月桂基煙酸酯洗液，如上文中實(shí)施例2所述，或應(yīng)用不同濃度的肉豆蔻基煙酸酯洗液。對(duì)照組僅接受賦形劑。洗液的用量是4ml/kg/只小鼠。
如上所述測(cè)定血清瘦素水平。結(jié)果顯示，在接受10％月桂基煙酸酯洗液的動(dòng)物中，血清瘦素水平提升了45％，而接受了肉豆蔻基洗液的動(dòng)物中，提高了57％(用2％配制劑的情況)，和77％(用5％配制劑的情況)。圖4顯示了這些結(jié)果。
實(shí)施例4瘦素和傷口愈合的相關(guān)性如上文所述。這種相關(guān)性在這些實(shí)驗(yàn)中予以研究。
在苯巴比妥鈉的麻醉下，給小鼠造成直徑約6mm的達(dá)全層厚度的傷口。然后每天對(duì)它們局部應(yīng)用20％煙酸酯洗液，共14天。劑量是每次100μl，一天兩次。對(duì)照組使用不含所述酯的洗液。每天測(cè)量傷口的直徑。
結(jié)果見圖5，其顯示接受了含煙酸酯的配制劑的小鼠與對(duì)照組相比，表現(xiàn)出傷口厚度減小。月桂基煙酸酯效果更好，其減小了43％。
接受了煙酸酯的小鼠與對(duì)照組相比，血清瘦素水平經(jīng)測(cè)定提高44％。這些結(jié)果在圖6中描述。
上述實(shí)施例顯示了本發(fā)明4個(gè)不同的特征，包括，一種在有相應(yīng)需要的受試者中刺激瘦素產(chǎn)生的方法，其通過給所述受試者施用瘦素刺激量的煙酸或煙酸衍生物，如煙酸酯。更優(yōu)選月桂基煙酸酯，如前文引用的專利文獻(xiàn)中所用的那些。尤其優(yōu)選煙酸本身，或煙酸烷基酯，其中的烷基部分包含1-30個(gè)碳原子，任選為取代的碳原子。更優(yōu)選，所述烷基部分包含1-22個(gè)碳原子，最優(yōu)選1-18個(gè)碳原子。受試者優(yōu)選患有能通過提高瘦素水平而緩解的疾病，包括圖1所示的那些，增強(qiáng)免疫功能，皮膚上皮化，毛囊再生，抑制腫瘤形成，如皮膚腫瘤形成，等等。
將煙酸或酯給藥受試者的模式有多種。除局部給藥以外，還可以考慮口服，緩釋(time release)，靜脈內(nèi)，皮內(nèi)或其他給藥形式。所述局部給藥可以經(jīng)由膏劑、洗劑、液體、氣霧劑、沐浴液、含嗽液、牙膏、管飼劑，或其他局部給藥形式。例如，在緩釋給藥的情況下，“敷劑”，如尼古丁緩釋給藥所用的類型，繃帶、包裹等等都可應(yīng)用。
煙酸酯的給藥量足以刺激瘦素的產(chǎn)生。其劑量可以而且將有變化；但配制劑應(yīng)保證，例如，約0.1-約10g/天/70kg體重的劑量，更優(yōu)選約0.1-約7g/天/70kg體重的劑量，最優(yōu)選約0.4-約5g/天/70kg體重的劑量。
如上所述，對(duì)瘦素生產(chǎn)的刺激，除了能導(dǎo)致先前所述的與瘦素有關(guān)的效應(yīng)外，還可以導(dǎo)致抑制皮膚腫瘤，皮膚自穩(wěn)和重建、表皮屏障的發(fā)育、傷口愈合，和毛發(fā)生長(zhǎng)。
其它應(yīng)用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見，無需在此贅述。
權(quán)利要求
1.提高瘦素水平的方法，包括給受試者施用一定量的煙酸或煙酸酯，所述受試者患有可通過提高瘦素水平而緩解的疾病，所述的量足以將所述受試者中的瘦素水平增加至足以緩解所述疾病的量。
2.權(quán)利要求1的方法，包括給所述受試者施用煙酸。
3.權(quán)利要求1的方法，包括給所述受試者施用煙酸酯。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述煙酸酯是煙酸烷基酯，它含有1-30個(gè)碳原子的取代或未取代的烷基鏈。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述烷基鏈包含1-22個(gè)碳原子。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述烷基鏈包含1-18個(gè)碳原子。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述煙酸酯包含12或14個(gè)碳原子。
8.權(quán)利要求1的方法，包括口服給藥所述煙酸或煙酸酯。
9.權(quán)利要求1的方法，包括局部給藥所述煙酸或煙酸酯。
10.權(quán)利要求1的方法，包括施用一種組合物，該組合物包含不止一種煙酸酯。
11.權(quán)利要求1的方法，包括施用煙酸和至少一種煙酸酯。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者有皮膚損傷。
全文摘要
本發(fā)明涉及煙酸和煙酸酯(如煙酸烷基酯)增加受試者中瘦素量的用途。結(jié)果是，可以通過施用足夠量的煙酸或煙酸酯，來提高瘦素的水平至緩解量，從而治療諸如以受傷為特征的疾病。本發(fā)明還公開了所治療的各種疾病和模式。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1496260SQ02806120
公開日2004年5月12日 申請(qǐng)日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月8日
發(fā)明者伊萊恩·雅各布森, 邁倫·K·雅各布森, 金輝泰, K 雅各布森, 伊萊恩 雅各布森 申請(qǐng)人:肯塔基大學(xué)研究基金會(huì), 亞利桑那大學(xué)董事會(huì)