專利名稱：：包含抗原和Toll樣受體激動劑的口服疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了適合用于口服遞送的免疫原性組合物。
背景技術(shù)：
：通常需要增加患者對接種疫苗的依從性以及改善疫苗的制備和運輸?shù)囊子眯浴？诜庖呖梢越鉀Q一些這些需要，可用于施用與佐劑組合的抗原以誘導抗原特異性免疫應答，見例如W099/21579。發(fā)明概述本發(fā)明提供了免疫原性組合物及其在醫(yī)藥中的用途，該組合物包括在口服施用的組合物中的一種或多種抗原和Toll樣受體(TLR)激動劑。附圖簡要說明圖I:在S.I.施用有或沒有作為佐劑的TLR2和/或TLR4激動劑的去垢劑分裂的A/SI/3/2006后，在血清中誘導的A/所羅門群島病毒特異性的Ab應答。在第O和14天麻醉小鼠，用失活的A/SI/3/2006(7或14yg)土作為佐劑的SFOMP(5μg),Pam3CysLip(10yg)或CT(5yg)s.I.接種疫苗。第二次免疫后兩周，收集血清并通過ELISA評價A/SI/3/2006病毒特異性Ab水平，通過HI測定評價血清IgG的功能性。特異性IgG濃度表示為ng/mL，每組具有保護性HI滴度(彡40)的小鼠的數(shù)量在柱狀圖中注明。NS=在肌肉內(nèi)免疫的小鼠中特異性IgG水平比IgG水平中沒有顯著性差異。每組有10只小鼠。圖2:在s.I.施用有或沒有作為佐劑的TLR4土TLR2激動劑的去垢劑分裂的A/SI/3/2006后，在血清中誘導的A/所羅門群島病毒特異性的Ab應答。在第O和14天麻醉小鼠，用以CRX527(Iμg)土Pam3CysLip(5μg)或CT(Iμg)佐劑化的失活的A/SI/3/2006(7或14yg)s.I.接種疫苗。第二次免疫后兩周，收集血清并通過ELISA評價病毒特異性Ab水平。通過HI測定評價血清IgG的功能性。特異性IgG水平被表示為ng/ml表示的幾何平均濃度，表明95%置信區(qū)間。每組具有保護性HI滴度(彡40)的小鼠的數(shù)量在柱狀圖中注明。NS=在肌肉內(nèi)免疫的小鼠中特異性IgG水平比IgG水平中沒有顯著性差異。每組有5-10只小鼠。圖3:在s.I.施用以TLR激動劑佐劑化的去垢劑分裂的A/SI/3/2006后，在血清中誘導的A/所羅門群島病毒特異性的Ab應答。在第O和14天麻醉小鼠，以SFOMP(Iμg),Pam3CysLip(Iμg)，CRX527(Iμg)，CRX642(Iμg)，MPL(Iμg)，鞭毛蛋白(Iyg),CpG(lyg)或CT(Iμg)佐劑化的失活的A/SI/3/2006(7.5yg)s.I.接種疫苗。第二次免疫后兩周，收集血清并通過ELISA評價病毒特異性Ab水平。通過HI測定評價血清IgG的功能性。特異性IgG水平被表示為ng/ml表示的幾何平均濃度，表明95%置信區(qū)間。每組具有保護性HI滴度(340)的小鼠的數(shù)量在柱狀圖中注明。NS=在肌肉內(nèi)免疫的小鼠中特異性IgG水平比IgG水平中沒有顯著性差異(UM)。每組有總共20只小鼠，這些小鼠以4只小鼠/組進行5次實驗。由于技術(shù)困難，從以CRX527免疫的組的分析中各自排除4只小鼠的2個合并組。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了免疫原性組合物，該組合物包含在口服施用的組合物中的一種或多種抗原和Toll樣受體(TLR)激動劑。本發(fā)明提供了免疫原性組合物，該組合物包含在設計為在口腔內(nèi)迅速崩解的口服施用的固體分散體形式中的一種或多種抗原和Toll樣受體(TLR)激動劑。在本發(fā)明的進一步實施方案中，提供了如本文所定義的免疫原性組合物，該免疫原性組合物用于免疫的方法中，該方法包括口服，尤其舌下施用所述組合物的步驟。在本發(fā)明的進一步實施方案中，提供了如本文所定義的免疫原性組合物，該組合物包含一種或多種抗原和Toll樣受體(TLR)激動劑，其適合用于口服(尤其是舌下)施用。在本發(fā)明的又一個實施方案中，提供了如本文所定義的口服(尤其是舌下)施用的免疫原性組合物，該組合物包含一種或多種抗原和Toll樣受體(TLR)激動劑。在本發(fā)明的進一步方面，提供了如本文所定義的用于醫(yī)藥中的免疫原性組合物?！ぴ诒景l(fā)明的進一步方面，提供了如本文所定義的用于治療和/或預防疾病的免疫原性組合物。如本文所用的術(shù)語“口服施用”、“口服地施用”、“口服接種疫苗”、“口服免疫”、“口服遞送”意在是指將抗原應用于口腔中，其中在頰咽區(qū)域的粘膜組織處以促進免疫應答的方式吸收所述包含抗原的免疫原性組合物。為了避免疑問，這些術(shù)語沒有涵蓋通過咽下而施用抗原，即其中抗原被吞下或以任何其他方式進入胃。在一個特定實施方案中，舌下，也就是在舌下，施用本發(fā)明的藥物組合物。如本文所用的術(shù)語“口服(例如舌下)施用的組合物”意在是指施用于口腔中的組合物，其中在頰咽區(qū)域的粘膜組織處以促進免疫應答的方式吸收所述免疫原性組合物或所述包含抗原的組合物的至少免疫原性組分。為了避免疑問，這些術(shù)語沒有涵蓋通過咽下而施用的組合物，即其中抗原被吞下或以任何其他方式進入胃或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的施用免疫原性組合物的任何其他方式(例如肌肉內(nèi)，真皮內(nèi)，鼻內(nèi)或經(jīng)皮施用)。在一個特定實施方案中，舌下，也就是在舌下，施用本發(fā)明的免疫原性組合物?？诜┯玫拿庖咴越M合物可以是液體或固體劑型。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，免疫原性組合物是在口腔內(nèi)迅速崩解的固體劑型。免疫原性組合物是在口腔內(nèi)迅速崩解的固體分散形式。崩解后，劑型的組分迅速覆蓋并與頰咽區(qū)域的粘膜組織(包括淋巴組織相關(guān)的粘膜)保持接觸。這使得抗原組分與能夠吸收抗原的組織接觸。在本發(fā)明的特定實施方案中，提供了免疫原性組合物，該免疫原性組合物在被放置在口腔中的約I-約60秒，尤其約I-約30秒，約I-約10秒或約2-8秒內(nèi)崩解的固體劑型。通常，崩解時間將小于60秒，這可以在37°C在水中按照美國藥典No.23，1995指定的崩解方法進行測試。在一個特定實施方案中，口服施用的免疫原性組合物包括粘膜粘附性物質(zhì)。W01999/021579(EP1024824B1)中描述了合適的固體劑型。在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，提供了包含粘膜粘附性物質(zhì)的制劑，其中所述粘膜粘附性物質(zhì)選自聚丙烯酸聚合物，纖維素及其衍生物或天然的聚合物(#/身，明膠，藻酸鈉和果膠)。在一個特定的實施方案中，粘膜粘附性物質(zhì)選自殼聚糖或其衍生物，淀粉及其衍生物，透明質(zhì)酸及其衍生物，藻酸鈉，明膠，聚半乳糖醛酸鈉，葡聚糖，甘露聚糖，纖維素膜，合成的非降解性聚合物，基于聚丙烯酸的聚合物，羧乙烯聚合物或其組合。在本發(fā)明的進一步實施方案中，除了一種或多種抗原和佐劑，免疫原性組合物包括基質(zhì)形成劑和第二種組分。適合用于本發(fā)明的基質(zhì)形成劑包括源自動物或植物蛋白的材料，如明膠，糊精和大豆，小麥和歐車前種子蛋白；樹膠，如阿拉伯膠，瓜爾膠，瓊脂和黃原膠；多糖；藻酸鹽；羧甲基纖維素；角叉菜膠；葡聚糖；果膠；合成的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；和多肽/蛋白或多糖復合物如明膠-阿拉伯膠復合物。適合用于本發(fā)明的其它基質(zhì)形成劑包括糖，如甘露醇，葡萄糖，乳糖，半乳糖和海藻糖；環(huán)糖如環(huán)糊精；無機鹽如磷酸鈉，氯化鈉和硅酸鋁；和具有2-12個碳原子的氨基酸如甘氨酸，L-丙氨酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，L-羥脯氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸和L-苯丙氨酸。在凝固之前可以將一種或多種基質(zhì)形成劑并入溶液或懸浮液中。除了表面活性劑或排除表面活性劑以外，可以存在基質(zhì)形成劑。除了形成基質(zhì)，基質(zhì)形成劑可能有助于保持任何有效成分在溶液或懸浮液內(nèi)的分散。在抗原不能充分溶解于水中并且因此必須懸浮而不是溶解的情況下，這尤其有幫助。在進一步的實施方案中，免疫原性組合物進一步包括第二種組分如防腐劑，抗氧化劑，表面活性劑，粘度增強劑，著色劑，調(diào)味劑，pH調(diào)節(jié)劑，甜味劑或味道掩蔽劑，也可以加入組合物中。合適的著色劑包括紅色，黑色和黃色氧化鐵和FD&C染料如從Ellis&Everard獲得的FD&CblueNo.2和FD&CredNo.40。合適的調(diào)味劑包括薄荷，覆盆子，甘草，橙，檸檬，葡萄柚，焦糖，香草，櫻桃和葡萄風味以及這些的組合。合適的pH調(diào)·節(jié)劑包括檸檬酸，酒石酸，磷酸，鹽酸和馬來酸。合適的甜味劑包括阿司帕坦，安賽蜜K和thaumatic。合適的味道掩蔽劑包括碳酸氫鈉,離子交換樹脂，環(huán)糊精包合化合物，吸附物或微囊化的活性物質(zhì)。本發(fā)明的免疫原性組合物將包括在人或動物中能夠引發(fā)針對引起疾病發(fā)生的人或動物病原體或物質(zhì)的免疫應答的抗原。術(shù)語“抗原”是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？乖梢允悄軌蛱岣呷嘶騽游镏忻庖邞鸬牡鞍祝嗵?，肽，核酸，蛋白-多糖偶聯(lián)物，分子或半抗原?？乖梢允茄苌摹⑼吹幕蚝铣傻囊阅M來自病毒，細菌，寄生蟲，原生生物或真菌的分子。免疫原性組合物可以包括一種或多種抗原，在該實施方案中，抗原可以取自相同的生物體或不同的生物體。在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，抗原源自流感。本發(fā)明的免疫原性組合物包含Toll樣受體激動劑?！癟LR激動劑”是指能夠通過TLR信號通路，或作為直接的配體或間接地通過產(chǎn)生內(nèi)源性或外源性的配體，引起信號應答的組分(Sabroe攀，JI2003pl630_5)。Toll樣受體(TLRs)是I型跨膜受體，在昆蟲和人類之間在進化上是保守的。迄今已經(jīng)鑒定了10種Toll樣受體(TLRs1-10)(Sabroe等，JI2003pl630_5)。TLR家族的成員具有相似的細胞外和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；已經(jīng)顯示它們的細胞外結(jié)構(gòu)域具有亮氨酸-豐富的重復序列，它們的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與白介素-I受體(IL-IR)的細胞內(nèi)區(qū)域相似。TLR細胞在免疫細胞和其它細胞(包括血管上皮細胞，脂肪細胞，心肌細胞和腸上皮細胞)間差異表達。TLR的細胞內(nèi)區(qū)域與接頭蛋白MyD88(在其胞質(zhì)區(qū)也具有IL-IR結(jié)構(gòu)域)可以相互作用，導致細胞因子的NF-KB活化；這種MyD88通路是TLR活化影響細胞因子釋放的一種方式。TLR的主要表達是在細胞類型如抗原呈遞細胞(#/身樹突狀細胞，巨噬細胞等)中。通過TLR的樹突狀細胞的活化導致樹突狀細胞的成熟和炎癥細胞因子如IL-12的產(chǎn)生。迄今進行的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，TLR識別不同類型的激動劑，盡管一些激動劑對于數(shù)種TLR是共有的。TLR激動劑主要源自細菌或病毒，包括分子如鞭毛蛋白或細菌脂多糖(LPS)。在一個實施方案中，Toll樣受體激動劑是Toll樣受體(TLR)4激動劑，優(yōu)選激動劑如脂質(zhì)A衍生物，尤其是單磷?；|(zhì)A或更尤其是脫?；膯瘟柞；|(zhì)A(3D-MPL)。3D-MPL從GlaxoSmithKlineBiologicalsNorthAmerica根據(jù)商標MPL而獲得，主要促進具有IFN-g(Thl)表型的⑶4+T細胞應答。它可以根據(jù)GB2220211A中公開的方法產(chǎn)生。化學上，它是具有3，4，5或6條?；湹?-脫?；膯瘟柞Ｖ珹的混合物。優(yōu)選地，在本發(fā)明的組合物中，使用小顆粒3D-MPL0小顆粒3D-MPL具有的粒徑使得它可以無菌過濾通過0.22μm過濾器。國際專利申請?zhí)朩O94/21292中描述了這種制劑。脂質(zhì)A的合成的衍生物是已知的，被認為是TLR4激動劑，包括但不限于OMl74(2-脫氧-6-0-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二酰氧基四-癸酰氨基]_4_ο-膦?；?β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羥基十四酰氨基]-a-D-吡喃葡萄糖基磷酸二氫鹽)，(W095/14026)。OM294DP(3S,9R)_3—[(R)-十二酰氧基十四酰氨基]_4_氧代_5_氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四酰氨基]癸-1，10-二醇，I,10-雙(磷酸二氫鹽(或酯))(W099/64301和WO00/0462)。OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二酰氧基十四酰氨基]_4_氧代_5_氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰氨基]癸-1，10-二醇，I-磷酸二氫鹽(或酯)10-(6-氨基己酸鹽)(W001/46127)?？梢允褂玫钠渌鸗LR4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGPs)如在W09850399或US6303347(還公開了制備AGPs的方法)中公開的那些，或US6764840中公開的AGPs的藥學上可接受的鹽。一些AGPs是TLR4激動劑，一些是TLR4拮抗劑。兩者都被認為作為佐劑是有用的。在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，佐劑是TLR-4激動劑，它是AGP。在一個特定的實施方案中，TLR4激動劑是CRX524或CRX527。以前已經(jīng)描述了CRX527和CRX524(見美國專利號6，113，918;實施例15和16，以及WO2006/012425WO2006/016997)。能夠通過TLR-4引起信號應答的其它合適的TLR-4配體(Sabroe等，JI2003P1630-5)是，例如，來自革蘭陰性菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，尤其是LPS的無毒衍生物(如3D-MPL)。其他合適的TLR激動劑是熱休克蛋白(HSP)10，60，65，70，75或90;表面活性蛋白A，透明質(zhì)酸寡糖，硫酸肝素片段，纖連蛋白片段，纖維蛋白原肽和b-防御素-2，胞壁酰二肽(MDP)，或呼吸道合胞病毒的F蛋白。在一個實施方案中，TLR激動劑是HSP60，70或90。在本發(fā)明的進一步實施方案中，TLR激動劑是TLR2激動劑(Sabroe等，JI2003P1630-5)。合適地，能夠通過TLR-2引起信號應答的TLR激動劑是來自結(jié)核分枝桿菌，B.burgdorferiTpallidum的脂蛋白,肽聚糖,細菌脂肽；來自物種包括金黃色葡萄球菌的肽聚糖；脂磷壁酸，甘露糖醛酸，奈瑟菌孔蛋白，細菌菌毛，Yersina毒力因子，CMV病毒顆粒，麻疹血凝素和來自酵母的酵母聚糖的一種或多種。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，TLR2激動劑，在本發(fā)明的一個特定實施方案中，TLR2激動劑是合成的脂肽Pam3Cys-Lip(見例如Fisette等，JournalofBiologicalChemistry278(47)46252)。在本發(fā)明的進一步實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含TLR4和TLR2激動齊U。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含弗氏志賀氏菌外膜蛋白制齊[J(SFOMP)。在一個特定的實施方案中，免疫原性組合物包含TLR4激動劑，如AGP(例如)CRX-527和TLR2激動劑Pam3CysLip。本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5,TLR6,TLR7,TLR8或TLR9激動劑或其組合。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用能夠通過TLR-I引起信號應答的TLR激動劑(Sabroe等，JI2003P1630-5)。合適地，能夠通過TLR-I引起的信號應答的TLR激動劑選自三?；闹?LPs);酚可溶性調(diào)控蛋白；結(jié)核分枝桿菌LP;S-(2，3-雙(棕櫚酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕櫚酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-0H,三鹽酸(Pam3Cys)LP,其模擬來自Horreliaburgdorfei的細菌脂蛋白和OspALP的乙?；陌被┒?。在一個另外的實施方案中，使用能夠通過TLR-3引起信號應答的TLR激動劑(Sabroe等，JI2003P1630-5)。合適地，能夠通過TLR-3引起信號應答的TLR激動劑是雙鏈RNA(dsRNA)，或聚肌胞-聚胞苷酸(Poly1C)，這是與病毒感染相關(guān)的分子的核酸模式。在一個另外的實施方案中，使用能夠通過TLR-5引起信號應答的TLR激動劑(Sabroe等，JI2003P1630-5)。合適地，能夠通過TLR-5引起信號應答的TLR激動劑是細菌鞭毛蛋白或其變體。所述TLR-5激動劑可以是鞭毛蛋白，或者可以是保留TLR-5激動劑活性的鞭毛蛋白的片段。鞭毛蛋白可以包括選自如下的多肽幽門螺旋桿菌，鼠傷寒沙門菌，霍亂弧菌，S.福氏志賀菌,梅毒螺旋體,肺炎軍團菌，漢burgdorferei\C.difficile,R.meliloti,A.tumefaciens'R.lupine-,B.clarridgeiae,P.mirabilis,B.subtilus,L.moneytogenes,綠膿桿菌和大腸桿菌。在一個特定的實施方案中，鞭毛蛋白選自鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白B(Genbank登錄號AF045151)，鼠傷寒沙門氏菌鞭毛B的片段，大腸桿菌FliCXGenbank登錄號AB028476);大腸桿菌FliC的片段；鼠傷寒沙門氏菌鞭毛FliC(ATCC14028)和鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FliC的片段。在一個特定的實施方案中，所述TLR-5激動劑是W02009/156405中所述的截短的鞭毛蛋白，即已經(jīng)缺失了高可變結(jié)構(gòu)域的鞭毛蛋白。在本實施方案的一個方面，所述TLR-5激動劑選自FliCM74_4QQ；FliCM61_405和FliCM38_4(l5。在進一步的實施方案中，所述TLR-5激動劑是如W02009/128950中所述的鞭毛蛋白。如果TLR-5激動劑是鞭毛蛋白的片段，可以理解的是，所述片段將保留TLR5激動劑活性，因此必須保留其負責TLR-5活化的序列的部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，鞭毛蛋白的NH2和COOH末端結(jié)構(gòu)域?qū)τ赥LR-5相互作用和活化是重要的，尤其例如沙門氏菌的氨基酸86-92。在一個另外的實施方案中，使用能夠通過TLR-6引起信號應答的TLR激動劑(Sabroe等，JI2003P1630-5)。合適地，能夠通過TLR-6引起信號應答的TLR激動劑是分枝桿菌的脂蛋白，二-?；腖P和酚可溶性調(diào)控蛋白。W02003043572中描述了進一步的TLR6激動劑。在一個另外的實施方案中，使用能夠通過TLR-7引起信號應答的TLR激動劑(Sabroe等，JI2003P1630-5)。合適地，能夠通過TLR-7引起信號應答的TLR激動劑是雙鏈RNA(dsRNA)，洛索立賓，在N7和C8的鳥苷類似物，或咪唑喹啉化合物，或其衍生物。在一個實施方案中，TLR激動劑是咪喹莫特。W002085905中描述了進一步的TLR7激動劑。在一個另外的實施方案中，使用能夠通過TLR-8引起信號應答的TLR激動劑(Sabroe等，JI2003P1630-5)。合適地，能夠通過TLR-8引起信號應答的TLR激動劑是單鏈RNA(單鏈RNA)，具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如雷西莫特(R848);雷西莫特也能夠被TLR-7識別。可以使用的其他TLR-8激動劑包括W02004071459中描述的那些。在一個實施方案中，提供了本發(fā)明的免疫原性組合物，其中所述TLR7/8激動劑是咪唑喹啉分子，尤其是共價連接磷-或膦?；鶊F的咪唑喹啉。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含CRX642(見W02010/048520)。也可以使用免疫刺激性寡核苷酸或者任何其他的Toll樣受體(TLR)9激動劑。用于本發(fā)明的佐劑或疫苗或免疫原性組合物中的優(yōu)選的寡核苷酸是包含CpG的寡核苷酸，優(yōu)選包含被至少三個，更優(yōu)選至少6個或更多個核苷酸分隔的兩個或更多個二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸和隨后的鳥嘌呤核苷酸。本發(fā)明的CpG寡核苷酸典型地是脫氧核苷酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸中的核苷間連接是二硫代磷酸酯，或更優(yōu)選硫代磷酸酯鍵，盡管磷酸二酯和其他核苷間連接在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具有混合的核苷間連接的寡核苷酸也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。US5，666，153，US5，278，302和W095/26204中描述了產(chǎn)生硫代磷酸酯寡核苷酸或硫代磷酸酯的方法。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法合成在本發(fā)明中利用的CpG寡核苷酸(例如見EP468520)。方便地,可以利用自動合成儀合成這種寡核苷酸。因此，在另一個實施方案中，佐劑組合物進一步包含額外的免疫刺激劑，該免疫刺激劑選自=TLR-I激動劑，TLR-2激動劑，TLR-3激動劑，TLR-4激動劑，TLR-5激動劑，TLR-6激動劑，TLR-7激動劑，TLR-8激動劑，TLR-9激動劑，或其組合。在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，提供了本發(fā)明的免疫原性組合物，其中所述TLR激動劑或TLR激動劑的組合中的至少一種TLR激動劑是合成的?！昂铣傻摹笔侵阜翘烊淮嬖诘腡LR激動劑。本發(fā)明的免疫原性組合物可以包含進一步的免疫刺激劑，例如皂甙如QuilA及其衍生物。QuilA是從南美洲樹以分離的阜式制劑,Dalsgaard攀·在1974年(“Saponinadjuvants，，，Archiv.fiirdiegesamteVirusforschung,Vol.44，SpringerVerlag,Berlin,p243_254)首次描述其具有佐劑活性。通過HPLC分離了QuilA的純化的片段，其保留了佐劑活性并且沒有與QuilA相關(guān)的毒性(EPO362278)，例如QS7和QS21(也被稱為QA7和QA21)。QS-21是源自QuillajasaponariaMolina的樹皮的天然的皂苷，其誘導⑶8+細胞毒性T細胞(CTL)，Thl細胞和主要的IgG2a抗體應答，在本發(fā)明的上下文中是優(yōu)選的皂苷。本發(fā)明的免疫原性組合物適合用于醫(yī)藥中，因此，提供了如本文所述的用于醫(yī)藥的免疫原性組合物。在本發(fā)明的進一步實施方案中，提供了如本文所述的免疫原性組合物，該免疫原性組合物用于免疫的方法中，該方法包括口服(尤其舌下)施用所述組合物(尤其施用于人)的步驟。在進一步的實施方案中，提供了如本文所述的免疫原性組合物，其用于(尤其在人中)預防和/或治療疾病。在進一步的實施方案中，提供了如本文所述的免疫原性組合物在制備用于(尤其在人中)預防和/或治療疾病的藥物中的用途。本文與本發(fā)明的“疫苗組合物”相關(guān)的實施方案也適用于本發(fā)明的“免疫原性組合物”相關(guān)的實施方案，反之亦然。發(fā)明人的意圖為，在每個例子中，本文的術(shù)語“包括/包含(comprising)”，“包括/包含(comprise)”和“包括/包含(comprises)”與“由…組成(consistingof)”,“由…組成(consistof)”和“由…組成(consistsof)”是任選地可替換的。實施例材料和方法動物模型和疫苗施用從CharlesRiversCanada獲得6_8周大的雌性BALB/c小鼠。對于舌下免疫,通過i.P.注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠。通過微量移液器施用疫苗。Ag和佐劑的總體積保持在8μI以避免吞咽效應。以50μI的體積在大腿肌肉上進行i.m.注射。在第O和14天免疫小鼠，在第28天處死。血清IgGELISA在最后免疫后2周(第28天)進行最后采血。收集血清用于特異性IgG測定和功能性血清抗體的存在。使用作為包被抗原的去垢劑分裂的A/SI/3/2006通過ELISA進行小鼠中抗-A/所羅門/群島/3/2006(A/SI/3/2006)IgG抗體的測定。分裂的流感抗原在包被緩沖液(0.05M碳酸鹽/碳酸氫鹽，pH9.6)中稀釋至0.5μg/ml(25ng/50μI)的終濃度，F(xiàn)e-Y片段特異性的AffiniPure山羊抗-小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)在包被緩沖液中為l.OPg/mL(50ng/50μI)的終濃度。在20°C將包被抗原和捕獲抗體在在4小時期間吸附至平底的96孔聚苯乙烯板(Maxisorp,Nunc)上。孵育之后,用DPBS(無Ca2+或Mg2+的Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水；Gibco)/0.05%Tween20(Sigma)將板洗漆4次。然后用包含I%牛血清白蛋白(BSA，Sigma)的DPBS將板在20V孵育I小時。將血清稀釋在包含PBS,0.05%Tween20和1%BSA的緩沖液(樣品稀釋緩沖液)中，然后以系列稀釋加入分裂的流感-包被的板并在4°C孵育16h-18h。孵育之后，用PBS/0.05%Tween20將板洗滌四次。然后將在樣品稀釋緩沖液中1/10000稀釋的二級抗體，過氧化物酶偶聯(lián)的AffiniPure山羊抗-小鼠IgG(Fc-y片段特異性的)加入每個孔中，并在37°C孵育30分鐘。洗滌步驟(PBS/0.05%Tween20)之后，用TMB過氧化物酶底物(BDBiosciences)在20°C將板孵育30分鐘。用IMH2SO4終止反應，并在450nm讀數(shù)。使用四參數(shù)方程通過SoftMaxPro從標準計算特異性的血清IgG濃度,并表示為ng/ml。粘膜樣品制備第二次免疫后兩周，收集支氣管肺泡灌洗液(BAL)，鼻洗液，唾液，陰道洗液和排泄物用于抗原特異性IgA抗體測定。直接檢測BAL和鼻洗液樣品用于IgA定量。通過力口入包含proteaseinhibitorcocktail(PIC)tabletscompletemini(Roche)的300μL樣品稀釋緩沖液而從棉簽提取唾液樣品，在檢測前渦旋樣品兩次，每次15秒。將陰道洗液樣品稀釋在包含PIC和菠蘿蛋白酶(25ug/mL)(Sigma)的200μL樣品稀釋緩沖液中，在37°C孵育lh，評價之前渦旋15秒。將糞便放在干冰上直到加入包含PIC的樣品稀釋緩沖液。糞便進行稱重并重懸在代表mg5倍于它們的重量的OL體積中。勻衆(zhòng)樣品(Kontes勻衆(zhòng)器),并在4°C7300rpm離心5分鐘。收集上清并通過ELISA評價。IgAELISA通過與血清IgG測定所述的相似的ELISA進行小鼠中抗-A/SI/3/2006IgG抗體的定量。更具體地，用在包被緩沖液(O.05M碳酸鹽/碳酸氫鹽，pH9.6)中以2118/1111(100ng/50μI)的終濃度稀釋的分裂的流感抗原和在包被緩沖液中I.OPg/mL(50ng/50μI)的終濃度的山羊抗-小鼠IgA(α-鏈特異性的)(Sigma)進行包被。過夜和封閉步驟后，將系列稀釋的粘膜樣品加入分裂的流感-包被的板，并在4°C孵育16h-18h。孵育之后，然后將在樣品稀釋緩沖液中1/6000稀釋的二級抗體，過氧化物酶偶聯(lián)的AffiniPure山羊抗-小鼠IgA(α-鏈特異性的)加入每個孔中，并在37°C孵育30分鐘。與TMB過氧化物酶底物(BDBiosciences)孵育之后，用IMH2SO4終止反應，并在450nm讀數(shù)。使用四參數(shù)方程通過SoftMaxPro從標準計算IgA濃度，并表示為ng/ml。血凝抑制(HI)試驗對第二次免疫后兩周采集的單個血清進行HI試驗。通過用受體破壞酶(Sigma)過夜處理從血清中去除非特異性抑制劑。然后加入鈣鹽水溶液以達到1:10稀釋，隨后在4°C與雞或公雞豬紅血細胞的50%(v/v)溶液孵育60分鐘以去除非特異性凝集素。處理過的血清在25μPBS中系列稀釋，然后在室溫與包含毒株特異性的流感抗原(全病毒，包含8個血凝素單位)的等體積的PBS孵育45分鐘。加入從成年雞或公雞獲得的紅血細胞的O.5%ν/V懸浮液，該混合物孵育另外45分鐘。反應隨后通過視覺檢查紅點形成表明陽性反應(抑制)，細胞的彌散碎片表明陰性反應(血凝)。作為陰性對照，為了確定測定的背景值，平行測試用緩沖液免疫的小鼠的血清樣品。所有血清一式兩份進行。將HAI滴度記錄為抑制血凝的最后稀釋的倒數(shù)。統(tǒng)計學分析如下進行所有統(tǒng)計學分析。將值對數(shù)轉(zhuǎn)化并用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗分析它們的高斯分布。當組的大多數(shù)具有正態(tài)分布或在可接受的限度內(nèi)的偏態(tài)(-1(D或峰態(tài)(-12)的值時,進行單向ANOVA和Dunnett的多重比較檢驗。否則,進行Kruskal-WallisANOVA和Dunn的多重比較檢驗。結(jié)果和討論為了確定舌下接種疫苗的有效性，測試使用TLR2和4激動劑佐劑化的作為模式抗原的流感抗原的新的疫苗制劑的引發(fā)全身和粘膜免疫應答的效力。首先評價弗氏志賀氏菌外膜蛋白制劑(SFOMP)，細菌衍生的TLR2/4激動劑和合成的脂肽Pam3CysLip，TLR2激動劑。用以SFOMP(5μg),Pam3CysLip(10μg)或以霍亂毒素(CT)佐劑化的去垢劑-分裂的A/SI/3/2006病毒通過舌下途徑以2周的間隔兩次免疫BALB/c小鼠。最后免疫后兩周,通過ELISA和HI檢測測定病毒特異性抗體的水平。在以SFOMP或Pam3CysLip佐劑化的分裂的抗原免疫的麻醉動物中檢測A/索羅門群島-特異性血清IgG抗體。所有用佐劑的制劑舌下免疫的小鼠統(tǒng)計學上顯示了與肌肉內(nèi)接種疫苗組的相似的IgG水平(圖I)。與未佐劑化的疫苗相比，以Pam3CysLip佐劑化的7μg抗原或以SFOMP佐劑化的14μg抗原顯著增加了IgG水平。通過HI測定證明了血清IgG的功能性，如圖I中所示，舌下疫苗的佐劑化導致了理論上與最低60%的保護相關(guān)的HI測定滴度。該數(shù)據(jù)提示TLR2/4激動劑在舌下免疫中的潛在用途。為了驗證確TLR2和/或TLR4激動劑在舌下接種疫苗中的潛能，單獨或與純TLR2激動劑(Pam3CysLip)組合地使用純合成的TLR4激動劑(CRX527)。Wlyg劑量在標準免疫方案中研究CRX527。血清IgGELISA分析表明，包含TLR4激動劑CRX-527(Iug)土TLR2激動劑Pam3CysLip(5ug)和分裂的流感抗原的疫苗制劑在舌下免疫后在引發(fā)抗原特異性的血清IgG應答中是有效的(圖2)。在該研究中，用每種佐劑觀察舌下疫苗的佐劑化效果。HI測定驗證了疫苗的舌下施用后功能性血清抗體的存在。盡管在相同組的小鼠內(nèi)的應答的變化很高，但是在血清IgG和HI滴度的水平之間有良好的關(guān)聯(lián)。為了評價在相關(guān)的部分(compartments)比檢測的模式抗原中粘膜抗體的應答，收集BAL，鼻洗液和唾液用于抗原特異性IgA抗體測定。此外，收集陰道洗液和排泄物以研究通過舌下途徑誘導的粘膜免疫應答的程度。IgAELISA分析表明，當舌下施用時，基于·TLR4激動劑土TLR2激動劑的A/SI/3/2006疫苗制劑在引發(fā)粘膜免疫應答中是有效的。如表I中所示，在所有粘膜部分(compartments)中檢測到抗原特異性IgA,在陰道洗液和糞便樣品中水平最高。任何舌下遞送的疫苗，包括未佐劑化的制劑，在糞便中誘導了抗原特異性應答。所羅門群島去垢劑-分裂的抗原的佐劑化提供了抗原特異性IgA的水平的至少2倍的增加。轱RffAVHsA濃ΛΛ#譬爾I相械5,____I!低85-10__RiHIBAL“I8晞液k1繼敎液B11*1s______[βΗ.ivam.I'..!Ih1.·.Λ·::I■!..；0CmM$ff_7.G…I7.53Κ;:1…I.·;.…Π,,qlt；i.q45Λ'72^79\2.-2D042^^4^22IO|Us.93-iMMlizD.Bi·—I7Γτν..................................................................................................................00-/bO......................LI^iL2Z—.:——-■—__■■■■■—j3bW40■.κν..^···.；；；,!.··.·Sο·Itry廣I\3.7vy…IIUOUv"1r^eI^I1聾..；拳事脊卜-■:.47u:·■■■■■■■■■■I■■■■■■■■■■5m........................"}^11Μ■■■■■■■■■■I■■■■■■■■■■■■■■■■.■；；.-；,■/；、f>…iWj8i^44j兕…■IΙ.;Si--\7；>,j..CT.■■；■■；NAP明…i詔3?！璉GW廣-I206i(Vw-f^；.^Π.·2Imy..1」.化瘦..與I^02.90-40^.40{,V；ν·ΜΚ:ι;Iλ.7.；οηI22^bT',..^'.67-1汾·!I；Λ::.'iIUWIIM·|1I4μ9O·丨!,Μj4JMI_iI.Β7~0ΜI2..004.00[2.0€-2.備2Μ0~2ΜI400400I表I:在s.I.施用有或沒有作為佐劑的TLR4土TLR2激動劑的去垢劑分裂的A/SI/3/2006后，A/所羅門群島病毒特異性的黏膜Ab應答。在第O和14天麻醉小鼠，用以CRX527(Iμg)±Pam3CysLip(5yg)或CT(Iμg)佐劑化的失活的A/SI/3/2006(7或14μg)s.I.接種疫苗。第二次免疫后兩周，收集粘膜樣品并通過ELISA評價A/SI/3/2006病毒特異性IgA水平。特異性IgG水平被表示為ng/ml表示的幾何平均濃度，表明95%置信區(qū)間。進行Dunnett多重比較檢驗。與肌肉內(nèi)免疫的小鼠的顯著性差異如下表示*=P彡O.05，*=P彡O.01和*=P彡O.001。每組有5-10只小鼠。NA=由于技術(shù)困難，樣品不可用。為了鑒定有效的抗原/佐劑疫苗制劑，用以7種候選的佐劑候選佐劑化的A/SI/3/2006去垢劑分裂的抗原(Iyg劑量)進行舌下免疫原性研究。進行肌肉內(nèi)(IM)免疫作為基準以確定舌下免疫的成功。由于商售的流感疫苗以一次使用的疫苗給出，或在首次免疫的當天，或在第二次免疫的當天，進行一次肌肉內(nèi)免疫。血清IgGELISA分析顯示，2次滴注舌下遞送的未佐劑化的流感疫苗可以引發(fā)特異性的血清IgG應答(GMC=5267ng/mL)(圖3)。在第O天或在第14天，以SFOMP(GMC=28771ng/mL),Pam3CysLip(GMC=4073lng/mL)或CT(GMC=42343ng/mL)的流感疫苗的佐劑化誘導了與一次給予肌肉內(nèi)免疫相似的特異性IgG水平。除了用SFOMP或Pam3CysLip的佐劑化(與未佐劑化的舌下流感疫苗相比，其5.5X和7.7X增加了血清中的IgG產(chǎn)生)，CRX642(GMC=23966ng/mL)也顯示了佐劑效果，并可以誘導顯著更高(4·6X)的IgG水平。在舌下免疫后，可以誘導功能性的血清抗體(HI滴度>40)。當用未佐劑化的疫苗兩次免疫動物時，1/40動物表現(xiàn)出HI滴度彡40。以SFOMP(4/20)，以Pam3CysLip(4/20)，以CRX642(4/20)或以CT(7/20)佐劑化的疫苗制劑中觀察到增加數(shù)量的具有功能性抗體的小鼠。這些HI滴度與用SFOMP土Pam3CysLip并用流感抗原的首次舌下研究中觀察到的滴度的差異可能是由于免疫途徑。正如前面提到的，在相同組的動物內(nèi)總是觀察到高的變異系數(shù)。為了克服這種限制，計劃配制具有粘膜粘附性化合物的抗原。在數(shù)份粘膜液中，通過IgAELISA研究舌下免疫后的黏膜免疫應答。與頂免疫相反，在BAL，鼻洗液，唾液，陰道洗液和排泄物中，用佐劑化的分裂的流感抗原的舌下免疫誘導了抗原特異性IgA。使用流感作為模式抗原，在相關(guān)部分比測試的模式抗原中粘膜抗體應答的舌下免疫的成功標準需要在肺液，鼻洗液和唾液中的IgA應答。BAL分析顯示，在舌下接種疫苗后在肺液中發(fā)現(xiàn)低水平的特異性IgA(表2)。在用CT佐劑化的流感疫苗(GMC=9.75ng/mL)免疫的動物中觀察到最高的IgA應答?；贙ruskalWallis和Dunn多重比較檢驗，除了CT,Pam3CysLip(GMC=3.95ng/mL),鞭毛蛋白(GMC=4.04ng/mL)和CpG(GMC=4.10ng/mL)佐劑化的疫苗誘導了比IM免疫顯著更高的IgABAL水平。鼻洗液分析顯示，在舌下接種疫苗后在肺液中發(fā)現(xiàn)低水平的特異性IgA。正如在BAL中，在用CT佐劑化的流感疫苗(GMC=12.91ng/mL)免疫的動物中觀察到最高的IgA應答。除了CT，RRCpG(GMC=4.33ng/mL)佐劑化的疫苗誘導了顯著更高的IgA。與頂免疫相比的鼻洗液水平基于KruskalWallis和Dunn,s的多重比較檢驗。與未佐劑化的舌下流感疫苗相比，CT是在鼻洗液中誘導顯著更高水平的IgA的唯一的測試的佐劑。唾液分析顯示，在舌下接種疫苗后在唾液中發(fā)現(xiàn)低水平的特異性IgA。正如在BAL和鼻洗液中，在用CT佐劑化的流感疫苗(GMC=6.00ng/mL)免疫的動物中觀察到最高的IgA應答?；趩蜗虻腁NOVA和Dunnett的多重比較檢驗，除了CT，Pam3CysLip(GMC=4.13/mL)佐劑化的疫苗誘導了比IM免疫明顯更高的IgA唾液水平?；谠谙嚓P(guān)的部分比測試的模式抗原中黏膜抗體應答的舌下免疫的成功標準，CpG,Pam3CysLip和鞭毛蛋白代表可能的候選。權(quán)利要求1.免疫原性組合物，包含在口服(例如舌下)施用的組合物中的一種或多種抗原和Toll樣受體(TLR)激動劑。2.權(quán)利要求I的免疫原性組合物，其中所述口服施用的組合物是被設計為在口腔內(nèi)迅速崩解的固體分散形式。3.權(quán)利要求I或2的免疫原性組合物，其中所述佐劑選自TLRl激動劑、TLR2激動劑、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR5激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑或其任何組合。4.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中所述TLR激動劑或TLR激動劑的組合中的至少一種TLR激動劑是合成的。5.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中所述佐劑是TLR4和TLR2激動劑，尤其是弗氏志賀氏菌外膜蛋白制劑的組合，或TLR4激動劑如AGP(例如)CRX-527和TLR2激動劑Pam3CysLip06.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中所述佐劑是TLR2激動劑，尤其是Pam3Cys-Lip。7.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中所述佐劑是TLR9激動劑，尤其是免疫刺激性寡核苷酸，尤其是包含一個或多個CpG基序的免疫刺激性寡核苷酸。8.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中所述佐劑是TLR5激動劑，尤其是鞭毛蛋白或其片段。9.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中所述佐劑是作為AGP的TLR4激動劑，尤其是CRX527。10.權(quán)利要求3的免疫原性組合物，其中所述佐劑是TLR7/8激動劑。11.權(quán)利要求10的免疫原性組合物，其中所述TLR7/8激動劑是咪唑喹啉分子，尤其是共價連接磷-或膦?；鶊F的咪唑喹啉。12.權(quán)利要求10或11的免疫原性組合物，其中所述TLR7/8激動劑是CRX642。13.前述權(quán)利要求中任一項的免疫原性組合物，包含進一步的免疫刺激劑，例如QS21。14.前述權(quán)利要求中任一項的免疫原性組合物，其中所述固體分散形式在被放置在口腔中的約I-約60秒，尤其約I-約30秒，約I-約10秒或約2-8秒內(nèi)崩解。15.前述權(quán)利要求中任一項的免疫原性組合物，進一步包含粘膜粘附性物質(zhì)。16.權(quán)利要求15的免疫原性組合物，其中所述粘膜粘附性物質(zhì)選自聚丙烯酸聚合物，纖維素衍生物或天然的聚合物(例如，明膠，藻酸鈉和果膠)。17.前述權(quán)利要求中任一項的免疫原性組合物，其中所述抗原源自流感。18.權(quán)利要求1-17中任一項的免疫原性組合物，其用于醫(yī)藥中。19.權(quán)利要求1-17中任一項的免疫原性組合物，其用于疾病的治療和/或預防中。20.權(quán)利要求1-17中任一項的免疫原性組合物，其用于免疫的方法中，所述方法包括口服施用所述組合物的步驟。21.權(quán)利要求1-17中任一項的免疫原性組合物，其用于免疫的方法中，所述方法包括舌下施用所述組合物的步驟。全文摘要本發(fā)明提供了免疫原性組合物，該組合物包含在口服(例如舌下)施用的組合物中的一種或多種抗原和Toll樣受體(TLR)激動劑。文檔編號A61K9/00GK102905726SQ201180027383公開日2013年1月30日申請日期2011年6月2日優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日發(fā)明者N.夸克德,M.普蘭特,D.拉羅奎,C.P.馬萊特申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司