專利名稱：在粘膜表面轉運免疫原的聚合粘膜粘合劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是1993年9月13日提交的(代理案號為05060-0003-01000)序號為08/119578的申請的部分繼續(xù)申請，后者又是1993年3月11日提交的(代理號為05060-0003-00000)的序號為08/029668的申請的部分繼續(xù)申請。所有這些申請的全部內容在這里提出作為參考文獻。
口服免疫原成本低，安全并可促進順應性。現(xiàn)已部分證明，刺激小腸的免疫活性組織和細胞會通過普遍的粘膜免疫系統(tǒng)刺激其它的粘膜表面的保護性免疫應答。在某些場合下，這種刺激也會導致血清反應。然而，現(xiàn)今在醫(yī)療中口服疫苗的應用只局限于少數(shù)疫苗。
有代表性的是，口服免疫需要相當高劑量的免疫原引起保護性免疫反應，并且有些疫苗在口服時不能引起反應。此外，嘗試經(jīng)減毒作用增加疫苗的安全性以及應用合成的和亞單位制劑，通常生成的抗原制劑比整個的全抗原功效差。
已將包括有胞壁酰二肽和氟化物的各種佐劑與實驗性口服疫苗合用，以便嘗試經(jīng)刺激免疫細胞的反應能力而提高免疫反應。另一種佐劑途徑是把抗原包到顆粒內，從而使抗原成為容易被免疫系統(tǒng)細胞吸收的形式。例如將抗原摻入到或結合于聚合微粒、毫微?；蛑|體中，常常比可溶性抗原更具免疫原性，這些顆粒狀抗原由于落入到粘膜中，或選擇性地被腸粘膜的M細胞捕獲而更加有效。
口服 免疫原后的免疫反應也可由于使用的免疫原選擇性地結合于上皮細胞(例如流感血凝素、霍亂弧菌)或將免疫原偶聯(lián)到選擇性地與這些細胞結合的化合物(例如腸內細菌的粘附蛋白，如志賀菌病或假單胞菌?。活惗舅厝缁魜y或百日咳類毒素，或花粉粒)上而提高。
但仍然需要一些方法和組合物以在服用免疫原后增強在粘膜表面的免疫反應。
本發(fā)明的目的是在服用免疫原后增強在粘膜表面的免疫反應。本發(fā)明的一個實施方案是將免疫原與聚合粘膜粘合劑締合，而誘導或增加了經(jīng)口服或其它的粘膜途徑免疫后的免疫反應。藥物轉運(特別是用透皮和口含方法)的粘膜粘合劑和其它生物粘合劑的理論和實用價值是本領域中皆知的，但免疫原與粘膜粘合劑一起使用以增強免疫反應迄今是未知的。
本發(fā)明的另一實施方案是用佐劑與免疫原和聚合粘膜粘合劑誘導或增加經(jīng)口服或經(jīng)其它粘膜途徑免疫后的免疫反應。免疫原與粘膜粘合劑合用口服時佐劑的有效性以前也是未知的。
在制藥領域內皆知給宿主皮下注射免疫原可產(chǎn)生可接受的免疫反應。此外，粘膜給藥，尤其是口服免疫原雖然常常不太理想，但仍能在某些場合下產(chǎn)生免疫反應。本發(fā)明的免疫組合物和免疫方法是當給縮主的粘膜表面施用免疫原時，可以增強宿主的免疫反應，應用這種給藥方式，本發(fā)明可以在一些情況下，獲得全身性免疫反應，其強度和持續(xù)時間很接近于用同樣抗原給宿主皮下注射時所達到的效果，而獲得的粘膜免疫反應比單獨皮下注射抗原或粘膜施用抗原時的反應更強。
實施本發(fā)明是用含有已知人用或獸用的各種常規(guī)免疫原的免疫組合物，以刺激宿主的免疫反應。這里所用的術語“免疫原”是指給到機體內可刺激體液的、粘膜的或細胞介導的免疫性的物質。術語“免疫原”和“抗原”在此是通用的。
這里所用的術語“免疫反應”是指接觸到免疫原后，所產(chǎn)生的對外來抗原反應性的特異性改變，如通過在粘膜或血清中抵抗免疫原的抗體增加，或者通過度量細胞介導的免疫性例如細胞素活性或增生所表明的。
本發(fā)明產(chǎn)生的免疫反應常規(guī)上是測定粘膜的免疫性的改變，例如用ELISA測定唾液IgA的變化或測定全身免疫性的變化，例如用ELISA測定抗體水平的變化，或測定細胞免疫性的變化，例如測定T細胞的增生反應。在對流感病毒進行免疫的情況下，也可以用測定血清血凝素抑制滴度(HI)的方法。在流感的情況下，當使用這些分析方法時本發(fā)明可使小鼠獲得的免疫反應與皮下注射等量的同樣物質后在大致相同的時間內獲得的免疫反應在強度上大約是相同的。
經(jīng)口服或其它粘膜途徑進行本發(fā)明的免疫之后，可用于刺激普遍的粘膜免疫系統(tǒng)的免疫原種類包括(非限制性)1)能夠經(jīng)粘膜表面而產(chǎn)生免疫反應的各種傳染性疾病的抗原，尤其是包括天然的粘膜免疫原(例如流感病毒、腸內細菌如大腸桿菌、霍亂弧菌扣螺旋桿菌的抗原)，這些粘膜免疫原可通過與粘膜上的配體和受體特異的相互作用而結合到粘膜上皮細胞上；2)減毒的活腸內病原體(例如脊髓病毒或輪狀病毒)；3)合成的顆粒狀抗原(例如含抗原的微球和毫微球)；4)與粘膜結合的過敏原(例如豚草花粉)；和5)自身抗原和組織抗原(例如髓鞘質堿性蛋白、CD4、黑色素瘤特異性蛋白)。
免疫原制劑，可以是完全免疫原，改性免疫原，合成免疫原或上述免疫原的亞單位，可來自病毒(例如流感、HIV、輪狀病毒或肝炎病毒)、細菌(例如志賀菌病、百日咳桿菌或衣原體)、原核寄生生物(例如引起瘧疾的瘧原蟲)，毒素(例如霍亂毒素或內毒素)、過敏原(例如豚草花粉)或組織標志物(例如黑色素瘤CD4，或髓鞘質堿性蛋白)。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中所用的免疫原來自病毒。本發(fā)明適用于可望用疫菌抵抗的多種病毒。本發(fā)明尤其適用于抵抗普通呼吸或腸道病毒。為說明起見，這里用流感病毒加以說明。然而本發(fā)明無意只限于流感病毒，也不局限于在所述的實施方案中所用的流感病毒株。可用本發(fā)明抵抗的其它病毒例如包括副流感病毒，呼吸合胞體病毒、鼻病毒，冠狀病毒和腺病毒。
對于流感病毒，選擇產(chǎn)生疫苗的病毒部分地取決于希望能獲得預防的流感病毒株式亞型。為了能獲得對特定流感病毒株有用的疫苗，最好用具有至少一個抗原決定簇的流感病毒株作為疫苗的原料，這種病毒株同可用疫苗抵抗的病毒株相同。
應當認識到，本發(fā)明可以使用各種動物的流感病毒型和亞型，以及某種亞型的不同株系。該流感病毒有代表性的是可感染動物，例如雞、鴨和豬的病毒。本發(fā)明尤其適用于包括人的靈長類動物，例如可用人流感亞型HON1、H3N8、H2N2(大流行性亞洲病毒)、H3N2(大流行性香港病毒)H1N1(大流行性俄羅斯病毒)，或由抗原性的不連續(xù)變異引起的其它病毒亞型，以及由抗原性的連續(xù)變異造成的亞型。一種用于本發(fā)明的某亞型毒株的實例是流感病毒A/Udorn/307/72(H3N2)，為B.R.Murphy博士(美國國立衛(wèi)生研究所，Bethesda，Md)所贈。該亞型是人流感病毒株，也可感染鼠猴和小鼠。該A/Udorn/307/72亞型非常適用于動物實驗，例如小鼠感染模型。
在本發(fā)明中粘膜粘合劑與免疫原一起使用以增加該免疫原向粘膜免疫系統(tǒng)的轉運功效。在制藥工業(yè)上現(xiàn)有各種粘膜粘合劑用于藥物轉運，如成膜劑和粘度增加劑，在食品工業(yè)中也有應用，并被食品與藥品管理局認定一般是安全的。實例包括羧甲基纖維素鈉，Carbopol，聚親碳劑，藻酸鈉和羥丙基甲基纖維素。
本發(fā)明者確信對于口服免疫粘膜粘合劑與粘蛋白層的相互作用，可以使粘膜粘合劑和任何相連的免疫原結合于與所有腸粘膜相連的粘蛋白上。這種締合可增加所連化合物與粘膜相互作用的功效，是通過(1)將化合物從腸的中心腔移到粘膜上皮相連的相對不動的粘液層上，從而增加了化合物具有與小腸粘膜的免疫細胞及其免疫活性細胞相互作用潛力的時間；(2)化合物從腔中體積的流體和物質上分布到與粘膜鄰近的粘蛋白比較薄的膜層上，從而提高了化合物的有效濃度；(3)由于聚集于該粘蛋白層上，該聚合粘蛋白阻礙了擴散作用而使免疫原免受腸內PH變化和分解代謝酶的影響，使免疫原不致于失活，該免疫原與粘膜粘合劑聚合物的相互作用可使免疫原免受相變化和膽汁鹽的清潔作用的影響。最后，粘膜粘合物的親水性質致使該脫水粘膜粘合劑將水從其直接環(huán)境中除去。粘膜上皮層的這種脫水作用會增加免疫原的生物利用度。此外，免疫原與聚合物的締合也可使免疫原穩(wěn)定化。雖然這些因素可以解釋粘膜粘合劑的有效性，但本發(fā)明者無意只限制于這些解釋上。
該已知的粘膜粘合劑是聚合物，它通過一種或多種機制結合于聚合的帶負電荷的粘蛋白上，這些機制包括疏水性相互作用，范德華力，帶電荷基團的相互作用，聚合物摻合作用和直鏈締合使用，特異性殘基的結合和受體與配體的相互作用。所有已知的粘膜粘合劑都是聚合物，這當然在文獻中是已知的，但單體型粘膜粘合劑也是可能的。
粘膜粘合劑本身一般沒有免疫原作用，許多種對人是安全的。現(xiàn)今它們用作擬粘液劑，如外科粘膠，愈傷助劑，止瀉劑和抗便秘劑，以及用于藥物轉運。粘膜粘合劑已成功地用于藥物的透皮轉運系統(tǒng)，包括肽類藥物以及藥物的鼻腔給藥(例如利尿劑和胰島毒)，以及在口腔中藥物(如甾類)的控釋和定位轉運。粘膜粘合劑雖然在胃腸道免疫中用作儲存佐劑，并經(jīng)研究證明是肽類藥物的潛在控釋轉運系統(tǒng)，但是在以前未被用于疫苗的粘膜轉運。
作為粘膜粘合劑的化合物的實例可考慮包括有羧甲基纖維素鈉、聚(丙烯酸)，西黃蓍膠，聚(甲基乙烯醚共聚馬來酸酐)，聚(環(huán)氧已烷)，甲基纖維素，藻酸鈉，羥丙基甲基纖維素，刺梧桐樹膠，甲基乙基纖維素，可溶性淀粉，明膠，果膠，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(羥乙基丙烯酸甲酯)，羥丙基纖維素，Carbopl，聚親碳劑。這些粘膜粘合劑可用于本發(fā)明的組合物和方法中。優(yōu)選的粘膜粘合劑是羧甲基纖維素鈉和其它纖維素類，聚親碳劑和Carbopol。羧甲基纖維素鈉是尤其優(yōu)選的粘膜粘合劑。也要認識到這些粘膜粘合劑的混合物也是可以用的。
本發(fā)明的免疫組合物也可包括足以增強宿主免疫反應的強度和持續(xù)時間用量的，或增強宿主的定量反應(例如通過刺激不同的免疫球蛋白的抗體而不是被免疫原刺激的那些抗體)的佐劑。佐劑應有效地引發(fā)細胞介導的和體液的對抗原的免疫反應，而對宿主系統(tǒng)無全身性或局部刺激。佐劑最好有低熱原性。可以使用已知的人用或獸用佐劑組合物。這些佐劑可以基于乳劑，有或沒有分枝桿菌，或者佐劑基于抗原吸附于鋁鹽，尤其是氫氧化鋁或磷酸鋁上。這些佐劑中的油佐劑，可以基于礦物油、動物油或植物油。油佐劑用于增加家畜對抗原疫苗的體液反應，某些油佐劑已試驗用于人。有代表性的佐劑是Freund完全佐劑和Freund不完全佐劑。
最近開發(fā)的適宜的佐劑，包括脂質體，免疫刺激復合物(IS-COMs)和角鯊烯或角鯊烯乳劑。也可以用有佐劑活性的表面活性劑。在ISCOMs和Pluronic嵌段共聚物中這些佐劑包括皂草苷樣QuilA分子，用來制備穩(wěn)定的角鯊烯乳劑。皂草苷是廣泛分布于植物中的表面活性劑。
胞壁酰二肽(MDP)或胞壁酰三肽(MTP)的類似物，例如具有佐劑活性和減低的副作用的MDP蘇氨酸類似物和脂多聚糖(LPS)也適用作為佐劑。LPS證明對小鼠可產(chǎn)生良好的效果。MDP的合成類似物和脂質A的一磷酰衍生物也已知有佐劑活性和減低的熱原性。另一個適宜的肽是合成的胞壁酰肽MTP-PE(N-乙?；?胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-[1，2-二棕櫚酰-Sn-甘油基-3-(羥磷酰氧基)]乙酰胺。尤其適宜的制劑是Syntex佐劑制劑-1或SAF-1，它是將在由Pluronic L-121三嵌段聚合物構成的載體中的MDP的蘇氨酰類似物與角鯊烯和少量的吐溫80相結合，吐溫80是乳化清潔劑。用于人的優(yōu)選佐劑是MDP及其類似物，有或沒有角鯊烯，皂草苷和脂質A的一磷酰衍生物。
其它化合物證明在與抗原共同口服時有佐劑活性。這些佐劑包括牛膽汁、聚陽離子，如DEAE-4，葡聚糖和聚鳥氨酸，十二烷基苯硫酸鈉，脂質結合物質，鏈霉素、維生素A以及其它可影響粘膜表面的結構或功能完整性的試劑。
本發(fā)明組合物和方法中佐劑與免疫原和粘膜粘合劑組合時，可觀察到免疫反應的進一步增強。再者，雖然沒有任何現(xiàn)成的理論說明，但該粘膜粘合劑可以使免疫原和佐劑容易呈遞給反應細胞，從而以協(xié)同方式增強這些物質的效應。
可用于服用抗原的粘膜粘合劑，所接觸的粘膜表面包括有胃腸道粘膜(包括胃、小腸、大腸、結腸和直腸)；口腔粘膜(包括口腔和食道粘膜和扁桃體表面)；呼吸道粘膜(包括鼻、喉頭、氣管和支氣管粘膜)；生殖器粘膜(包括陰道、子宮頸和尿道粘膜)以及眼粘膜。給宿主服用本發(fā)明組合物的優(yōu)選途徑是口服、鼻腔、直腸和扁桃體拭子。尤其優(yōu)選的用藥途徑是口服，因為用法簡單，相對無損傷性。要認識到各種用法可聯(lián)合使用。例如開始是口服，輔助以鼻腔給藥，反之也行。
要認識到本發(fā)明的免疫組合物也可用于疫苗中。該疫苗可以是含有作為免疫原的抗原的治療物質，所述的抗原來自一種或多種病原微生物，給予人或動物后可刺激自動免疫，并使機體免受被這些或有關微生物的感染或減低感染程度。該疫苗可為活疫苗，滅活疫苗，減毒疫苗、亞單位或混合疫苗。
本發(fā)明組合物可摻加到各種適宜的轉運系統(tǒng)中。例如，抗原，粘膜粘合劑和佐劑可與藥用液體載體，例如水、緩沖食鹽水溶液，或可食性動物或植物油合用。組合物可與一種或多種適宜的藥用賦形劑或芯材，例如纖維素，纖維素衍生物，蔗糖、明膠、淀粉1500，NuTab，乳糖、麥芽糊精，滑石粉，卡波夕耳、硬脂酸鎂、藻酸鹽，Actisol，PEG400，Myvacet，三醋精、糖漿、油、山梨糖醇、甘露糖醇和Plasdone合用，并不只限于所舉出的這些物質；也可用其它的或另外的賦形劑或芯材。
也要認識到，本發(fā)明組合物制成的劑型中也可含有能中和胃酸的化學試劑。適宜的中和劑包括H2拮抗劑、碳酸氫鈉，碳酸鈣和氫氧化鋁。
本發(fā)明組合物可以酏劑、溶液、懸浮液、糖漿劑、氣霧劑等劑型使用。組合物也可制成適于口服的劑型單位，如小顆粒劑、顆粒劑、藥珠、片劑、硬明膠膠囊和軟明膠膠囊。
免疫組合物可加以處理，以保護抗原、粘膜粘合劑和佐劑使其在到達靶部位之前免受降解作用。一種實施方案是將劑型單位如片劑或膠囊劑用常規(guī)方法，包括(但不限于)衣鍋包衣；流化床包衣(例如Wurster法)或頂噴霧法包衣；噴霧干燥和乳化或微囊方法包上腸溶衣。還可任選地使用亞包衣劑，例如羥丙基甲基纖維素，Opadry或Dryclean。腸衣適用于各種劑型單位。腸溶衣劑可以是各種用于保護抗原和使抗原在腸內釋放的藥用材料。亞包衣劑或腸溶衣劑的選擇和用量是本領域的常規(guī)技術，部分取決于劑型，例如片劑或膠囊劑。適宜的腸溶衣劑有HPMCP5s(羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸脂，CAP(乙酸鄰苯二甲酸纖維素)，Eudragit Aguateric，Coa-teric，Surlease Shellac和蠟。
免疫原、粘膜粘合劑和佐劑合用的用量應能使宿主對傳染物產(chǎn)生免疫反應。這可由血清陽轉，即在免疫前后的抗體水平的估測加以確定。如果宿主對抗原預先有抗體滴度，則免疫的成功取決于該特異性抗體水平的增加程度，如果在血清陽轉和保護作用之間沒有相關性，則可監(jiān)測細胞介導的免疫反應。
每個劑量單位中抗原、粘膜粘合，劑和佐劑的含量取決于所需的劑量和給藥頻度。若組合物中抗原為流感病毒、粘膜粘合劑為羧甲基纖維素，佐劑為胞壁酰二肽，則單個劑量單位可含有抗原量為大約10μg到150μg血凝素(HA)，優(yōu)選為大約5μg到45μgHA；粘膜粘合劑量大約為10μg到1g，優(yōu)選為1μg到50μg；佐劑量大約為1μg到2μg，優(yōu)選為大約10μg到200μg，抗原∶粘膜粘合劑∶佐劑的相對重量比此時大約為5-45∶1000-50000∶0-200。精確的組合物必然根據(jù)選用的抗原、粘膜粘合劑和佐劑、被免疫的動物種類和其它因素而變化，本領域的技術人員能夠找到最佳配方。加強劑量所包含的抗原量要足夠增強起始的免疫反應。采用的每個方案都得根據(jù)抗原和宿主的情況。對于兒童和以前未接觸過疫苗的人更適宜用多劑量。一個實施方案是每個劑量單位含有的流感抗原量要能有效保護動物使其在接觸到該病毒后不會感染疾病。
劑量的定義是提高個體免疫反應所必需的免疫原量。例如，血清中同源中和抗體水平是個體對同源流感病毒株感染的易感性的表征，血清血凝抑制滴度大約為1∶32或1∶4或更高時，被認為可抵抗同源病毒的自然感染。因此，流感抗原的優(yōu)選劑量是按標準方法測定可以使血清血凝滴度大約是1∶32或1∶40或更高的劑量。
免疫原的保護作用也可用血清血凝素抑制作用水平的提高或者在免疫后發(fā)現(xiàn)的粘膜抗體滴度的增高來表示，在流感的治療時，免疫后7-21天內血清中HI滴度增加4倍被認為是有保護性的。7-21天內粘膜抗體滴度(例如唾液中IgA或洗鼻水中IgA)增高4倍量，也被某些認為對流感有保護作用。因此，本發(fā)明免疫組合物的優(yōu)選劑量可使人體的特異性抗體水平提高到這樣的程度?？烧{整免疫劑量直到獲得可檢測出的抗體滴度，優(yōu)選獲得中和抗體滴度。
要認識到本發(fā)明所用的免疫原可對抗各種寄生蟲、細菌或病毒的各種型與亞型，以及某種亞型的不同株系。寄生蟲、細菌或病毒有代表性的是可感染動物，例如狗、貓、家禽、豬、馬和牛，尤其是哺乳類，例如包括人類的靈長類、免疫原可在給粘膜粘合劑或佐劑之前或之后給藥，但一般是免疫原粘膜粘合劑和佐劑。
本發(fā)明免疫原給合物的制備可簡單地將免疫原、粘膜粘合劑和佐劑加以混合而無共價鍵結合，或者是將諸成分偶聯(lián)在一起。因此本組合物還有容易制備的優(yōu)點。
下面的實施例將更詳細地說明本發(fā)明。
實施例1疫苗抗原流感病毒A/Udorn/307/72(H3N2)，BK6，Egg3，克隆3A(7-25-89)為B.R.Murphy博士(NIH，Bethesda，MD)所贈。該病毒在雞胚中傳代一次，尿囊液作為儲備病毒存放于-130℃(感染滴度為每0.2ml有2.53×107蝕斑形成單位(P.F.U)。10天的雞胚(400-500)用0.1ml的儲備病毒感染，該病毒以1∶1000稀釋于補充有SPG的L-15介質(2.18M蔗糖，0.038M KH2PO4，0.072MK2HPO4和0.049M谷氨酸單鈉中。于35-36℃溫育48小時后，收集尿囊液，于3700gav離心20分鐘使澄清化。再于1000000gav離心45分鐘自上清液中收集病毒。將小丸于0℃于0.5ml磷酸鹽緩沖食鹽水溶液(PBS)中放置過夜，再用PBS稀釋至6ml劇烈混合，于1300gav離心15分鐘以除去聚集物。該操作重復三次。第三次離心后，將小丸超聲化，再離心。將收集的含有病毒懸浮液的上清液加到10-60％于PBS連續(xù)蔗糖梯度頂部，于無搖擺旋轉器上離心2小時(1000000gav)。收集病毒帶，用PBS1∶1稀釋，病毒與福爾馬林(1∶4000V/V)于37℃溫育72小時被滅活。于4℃下對PBS過夜透析，如上述離心得小丸，再懸浮于PBS或水中使每ml含量蛋白質5mg，存放于-80℃。用考馬斯藍結合試驗(Pierce，Rockford，IL，USA)測定蛋白質中經(jīng)氫氧化鈉破壞了的病毒。
制備具有粘膜粘合劑的疫苗按制造廠提供的簡便方法制備各種粘膜粘合劑的凝膠，用于本實驗的羧甲基纖維素鈉(CMC)購自Agualon(Wilmington，DE)。將CMC凝膠制成2％水溶液。Carbopol和聚親碳劑(Polycarbophil)丙烯酸聚合物購自B.F.Goodrich(克利弗蘭，俄亥俄)。由這些聚合物制備凝膠是將Carbopol制成0.25％水懸浮液，聚親碳劑制成0.5％水懸浮液。這些溶液在加入數(shù)滴IN NaOH后pH大約從3升至4。當pH達到4時，該丙烯酸聚合物懸浮液變成凝膠。藻酸鈉購自Kelco(為Merck&Co.，Inc(圣迭哥，(A)的分支)，將凝膠制成2％水溶液。Zilactin購自Zila藥廠(鳳凰城，AZ)。在免疫之前立即制備1∶10的Zilactin水溶液。
流感病毒溶液(每10μl磷酸鹽緩沖食鹽水溶液中含50μg病毒蛋白)與粘膜粘合劑凝膠以1∶50(疫苗∶凝膠)的比例混合(每個劑量含10μl疫苗溶液和490ul粘膜粘合劑)。在所有情況下，混合只需簡單攪拌大約1～2分鐘，直到肉眼觀察成均相溶液即可，并且在免疫前立即混合。
小鼠的免疫BALB/C小鼠(8周齡，雌鼠)得自Charles River或Jackson實驗室，5只一組。用灌胃針頭給小鼠灌胃疫苗(于粘膜粘合劑中)500μl。一個對照組是流感疫苗(于0.1M NaHCO3溶液中)也灌胃給藥。
對照組的全身免疫是用游離抗原(50μg/小鼠)(于生理食鹽溶液中)經(jīng)皮下注射進行的。
樣品的收集免疫后在選定的時間和免疫之前自小鼠尾靜脈取血。離心分離出血漿，冷凍。腹腔注射氯化氨基甲酰膽堿(1μg/小鼠)，刺激分泌出唾液，用毛細管收集。加入大豆胰蛋白酶抑制劑，苯基甲基磺酰氟、疊氮化鈉和胎牛血清各2ug，澄清后貯存于-80℃。
ELISA為了測定抗原特異性抗體，于用濃度為4μg/ml的純化的A/U-dorn流感病毒覆蓋的96孔聚苯乙烯微量滴板(Dynatech，Alexandri-a，Va，USA)上進行ELISA。血清和唾液的終點滴度用辣根過氧化物酶標記的抗小鼠Ig或IgA的山羊IgG(Southern Biotechnolvgy As-sociates Birmingham，Al，USA)和底物2，2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(Sigma，St.Louis，MO，USA)進行測定。顯出的顏色用Vmax光度計(Molecular Devices，Polo Alto，CA，USA)于414nm進行測定。
HI測定血凝抑制(HI)反應是用小鼠血清以PBSA按1∶5的比例稀釋后進行的，并且經(jīng)處理除去非特異性抑制劑(于56℃加熱30分鐘；與15％酸處理過的高嶺土溫育30分種；與10％雞紅血球懸浮液溫育30分鐘)。在96孔微量滴板上對血清作兩倍稀釋。每孔中加入病毒懸浮液(8HA單位，用等體積加入)，室溫下溫育30分鐘。每井中加入0.5％雞紅血球懸浮液，室溫下溫育45-60分鐘。HI滴度被表示為完全抑制了紅血球的血凝作用的最高稀釋的倒數(shù)。
實施例2疫苗抗原流感病毒A/Udorn/307/72(H3N2)，BK6，F(xiàn)gg3，克隆3A(7-25-89)為B.R.Murphy博士(NIH，Bethesda，MD)所贈。該病毒在雞胚申請傳代一次，尿囊液作為儲備病毒于-130℃存放(感染滴度為每0.2ml有2.53×107蝕斑形成單位(p.f.u)。10天的雞胚(400-500)用0.1ml的儲備病毒感染，該病毒以1∶1000稀釋于補充有SPCT的L-15介質(2.18M蔗糖，0.038M KH2PO4，0.072MK2HPO4和0.049M谷氨酸單鈉)中。于35-36℃溫育48小時后，收集尿囊液于370gav離心20分鐘使澄清化。小丸于0.5ml磷酸鹽緩沖食鹽水溶液(PBS)于O℃放量過夜，用PBS稀釋至6ml，劇烈混合，于1300gav離心15分種以除去聚集物。該操作重復3次。第3次離心后，將小丸超聲，再離心。將收集的含有病毒的懸浮液的上清液加到10-60％于PBS的連續(xù)蔗糖梯度頂部，于無搖擺旋轉器上離心(1000000gav)2小時。收集病毒帶，用PBS1∶1稀釋，病毒與福爾馬林(1∶4000V/V)于37℃溫育72小時被滅活。于4℃下對PBS過夜透析，如上述離心得到小丸，再懸浮于PBS或水中使每ml中含蛋白質5mg，存放于-80℃。用考馬斯藍結合試驗(Pierce，Rock-ford，IL.USA)測定蛋白質中經(jīng)氫氧化鈉破壞了的病毒。
制備具有粘膜粘合劑的疫苗按照制造廠提供的簡便方法制備各種粘膜粘合劑的凝膠。用于本實驗的羧甲基纖維素鈉(CMC)為7MF購自Agualon(Wilming-fon，DE)，將CMC凝膠制成2％水溶液。Carbopol和聚親碳劑(Poly-carbophil)丙烯酸聚合物購自B.F.Goodrich(克利弗蘭，俄亥俄)。由這些聚合物制備凝膠是將Carbopol制成0.25％水懸浮液，聚親碳劑制成0.5％水懸浮液。這些溶液在加入數(shù)滴氫氧化鈉(IN)溶液后pH大約從3升到4。當PH達到4時，該丙烯酸聚合物懸浮液變成凝膠。藻酸鈉購自Kelco(為Merck&Co.，Inc(圣迭哥，(A)的分支)，將凝膠制成2％水溶液。Zilactin購自Zila藥廠(鳳凰城，AZ)。在免疫之前立即制備1∶10的Zilactin水溶液。
流感病毒溶液(每10μl磷酸鹽緩沖食鹽水溶液中含50μg病毒蛋白)與粘膠粘合劑凝膠以1∶50(疫苗∶凝膠)的比例混合(每個劑量含40μl疫苗溶液和490μl粘膜粘合劑)。在所有情況下，混合只需簡單攪拌大約1～2分鐘，直到肉眼觀察成均相溶液即可，并且在免疫前立即混合。
小鼠的免疫BALB/C小鼠(8周齡，雌鼠)得自Charles River或Jackson實驗室，5只一組。用灌胃針頭給小鼠灌胃疫苗(于粘膜粘合劑中)500μl。一個對照組是流感疫苗(于0.1M NaHCO3溶液中)也灌胃給藥。
對照組的全身免疫是用游離抗原(50μg/小鼠)于生理食鹽溶液中)經(jīng)皮下注射進行的。
樣品的收集免疫后在選定的時間和免疫之前自小鼠尾靜脈取血。離心分離出血漿，冷凍。腹腔注射氯化氨基甲酰膽堿(1μg/小鼠)，刺激分泌出唾液，用毛細管收集。加入大豆胰蛋白酶抑制劑，苯基甲基磺酰氟、疊氮化鈉和胎牛血清各2μg，澄清后貯存于-80℃。
ELISA為了測定抗原特異性抗體，于用濃度為4μg/ml的純化的A/U-dorn流感病毒覆蓋的96孔聚苯乙烯微量滴板(Dynatech，Alexandri-a，Va，USA)上進行ELISA。血清和唾液的終點滴度用辣概括過氧化物酶標記的抗小鼠Lg或Ig的山羊IgG(Sorthern BiotechnolvgyAssociates Birmingham，Al，USA)和底物2，2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(Sigma，St.Louis，MO，USA)進行測定。顯出的顏色用Vmax光度廣場(Molecular Devices，Polo Alto，CA，USA)于414nm進行測定。
HI測定血凝抑制(HI)反應是用小鼠血清以PBSA按1∶5的比例稀釋后進行的，并且經(jīng)處理除去非特異性抑制劑(于56℃加熱30分鐘；與15％酸處理過的高嶺土溫育30分種；與10％雞紅血球懸浮液溫育30分鐘)。在96孔微量滴板上對血清作兩倍稀釋。每井中加入病毒懸浮液(8HA單位，用等體積加入)，室溫下溫育30分鐘。每孔中加入0.5％雞紅血球懸浮液，室溫下溫育45-60分鐘。HI滴度被表示為完全抑制了紅血球的血凝作用的最高稀釋的倒數(shù)。
結果如表1所示，所有組的小鼠在口服于粘膜粘合劑中的病毒制劑免疫后，血清免疫球蛋白，血凝素滴度和唾液中IgA滴度均較高。在本實施例中粘膜粘合劑羧甲基纖維素導致了最好的免疫反應。
表1
5只小鼠/組，用所采集血清數(shù)據(jù)庫進行的測定表明了用50μg流感病毒A/Udorn(只用它時為對照組)，或單獨用或與各種粘膜粘合劑混合經(jīng)皮下注射或口管飼法免疫前和免疫后的28天在唾液中的抗體滴度(用ELISA法測IgG)和血清中抗體滴度(用ELISA法和血凝素抑制滴度測定總Ig)。
實施例3為了確定達到最佳免疫反應所需的粘膜粘合劑濃度，小鼠通過口管飼法用在各種濃度的羧甲基纖維素(取代型號7MF)粘膜粘合劑中制備的病毒制劑進行免疫。此外，2組小鼠通過口管飼法用在取代的羧甲基纖維素(型號為9M31FPH或12M31P)流感A/Udorn病毒進行免疫中制成的。10組小鼠，每組5只，雌性BALB/C小鼠，免疫方法是用如實施例2所述制備的含有福爾馬林化流感病毒(A/Udorn)的粘膜粘合劑制劑，不同的是在收獲病毒時以0.02％(W/V)的濃度將防腐劑硫柳汞加到尿囊液中，并且在病毒制備的所有后續(xù)步驟中都保持同樣的濃度。小鼠被免疫后，采集血清，測定血凝素抑制滴度。雖然皮下注射游離病毒免疫后第14天和第28天血清血凝素抑制滴度呈陽性，但在濃度為0.05％到4.0％(W/V)的粘膜粘合劑羧甲基纖維素存在下在口服免疫后，沒有得到血清血凝素抑制滴度。唾液中IgA和抗體水平未能用ELISA方法測到。
實施例4在口管飼法灌胃時小鼠胃中內容物對免疫結果的影響通過改變小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境進行了研究。四組小鼠，每組5只雌性BALB/C小鼠，置于禁食或禁水的環(huán)境中，之后經(jīng)口管飼法用含有2％(W/V)羧甲基纖維素粘膜粘合劑和50μg福爾馬林化流感病毒A/Udorn制劑(制法如實施例3所述)的制劑進行免疫。亦即病毒是在防腐劑(0.02％硫柳汞)存在下制成的。小鼠被免疫后，按照實施例2所述方法采血并測定血清血凝素滴度。這些實驗組(包括可自由攝取食物和水的對照組)在第14天未得到血清血凝素抑制滴度。用ELISA法未測定出唾液中IgA和抗體含量。
實施例5實施例2表明，口服按照實施例2所述的方案制備的流感病毒(A/Udorn)進行免疫時，在粘膜粘合劑(包括羧甲基纖維素)存在下，產(chǎn)生了陽性的血清血凝素滴度。反之，實施例3和4，表明，按照實施例3制備的流感A/Udorn病毒，在羧甲基纖維素存在下口服免疫后未產(chǎn)生陽性的血清血凝素滴度，但皮下注射游離病毒免疫時，卻產(chǎn)生了陽性的血清血凝素滴度。按照實施例3制備流感病毒所用的方案包括使用防腐劑硫柳汞。按實施例2所述的制備病毒時若省略該防腐劑，會在病毒儲液中造成細菌污染。因此，要對病毒儲液進行培養(yǎng)以確定是否有細菌污染。有硫柳汞存在時制備的儲液證明沒有細菌污染，而沒有硫柳汞存在時制備的病毒儲液會有細菌污染。仔細地分析該病毒制劑證明細菌的污染是克雷白桿菌和黃單胞桿菌。
含有克雷白桿菌和黃單胞桿菌的流感病毒A/Udorn/307/72(H3N2)，BK6，Egg3，克隆3A(7-25-89)存放于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，馬里蘭)。
實施例6在羧甲基纖維素存在下，病毒儲液的細菌污染對免疫結果的影響通過對按實施例3制備的病毒儲液免疫小鼠的比較進行了確定，并已知沒有污染，并且已知該儲液被克雷白桿菌和黃單胞桿菌污染。小鼠被免疫后，采血，用ELISA法測定血清血凝素抑制滴度和血清抗流感總免疫球蛋白抗體，所有步驟如實施例2所述。
結果如表2所示，按實施例2制備的流感病毒儲液中沒在硫柳汞并已知被細菌污染時，經(jīng)皮下注射或口服給藥時，用ELISA法或血清血凝素抑制作用測定，表明對引發(fā)小鼠的免疫反應是有效的。當在粘膜粘合劑和細菌污染物存在下，口服免疫所引發(fā)的免疫反應比用只含細菌污染物而沒有粘膜粘合劑的免疫原引發(fā)的免疫反應要高，這表明細菌污染物和粘膜粘合劑對于有效地引發(fā)免疫反應都是需要的。反之，按照實施例3有硫柳汞存在下制備的病毒儲液已知沒有細菌污染，皮下注射免疫原時，能夠引發(fā)免疫反應，但在口服免疫原時，即使在粘膜粘合劑羧甲基纖維素存在下，也不能引發(fā)明顯的免疫反應。而且，用ELISA檢測法對1、2、4、組測定所得到的結果合并后，總和與第5組的ELISA結果相比較時，表明本發(fā)明的免疫原，佐劑和粘膜粘合劑之間是有協(xié)同作用的。
表2
表2(續(xù)
每組5只小鼠，用所采集血清數(shù)據(jù)庫進行的測定表明了用在無硫柳汞存在并已知被細菌污染的情況下制備的(實施例1方案)，或在有硫柳汞存在但沒有細菌污染的情況下制備的(實施例2方案)50μg流感A/Udorn病毒(只用它時為對照)進行免疫之前和免疫后28天血清中的抗體滴度(用ELISA法和血凝素抑制滴度測定總Ig)。病毒與或不與粘膜粘合劑羧甲基纖維素，取代型號7MF(2％水溶液W/V)混合，經(jīng)皮下注射或口管飼法給藥。實施例7如實施例6所示，已知被細菌污染的病毒制劑當在有粘膜粘合劑羧甲基纖維素存在下時能夠引發(fā)免疫反應。但口服的病毒制劑未被細菌污染、即使有粘膜粘合劑羧甲基纖維素存在下，也不引發(fā)免疫反應。細菌的功能可能是實施例6的佐劑作用，用包括有其它佐劑的配方進行了試驗。在粘膜粘合劑羧甲基纖維素存在下，測定了佐劑脂多糖和胞壁酰二肽的作用。為此，將小鼠用50μg流感病毒制劑口服免疫，該制劑已知未被細菌污染、加入500μl2％的羧甲基纖維素，加入或不加入作為佐劑的LPS或MDP。
結果如表3所示，將來自克雷白桿菌或埃氏大腸桿菌的LPS加到羧甲基纖維素粘膜粘合劑制劑中，引發(fā)了如用血清血凝素滴度或唾液IgA滴度測得的陽性免疫反應。加入胞壁酰二肽也引發(fā)了如用血清血凝素滴度或唾液IgA測得的免疫反應，但唾液IgA滴度水平略低于用LPS得到的滴度水平。
表3<
表3(續(xù)
每組5只小鼠，經(jīng)皮下注射或口管飼法用混有或未混有粘膜粘合到羧甲基纖維素(取代型號7MF)的2％(W/V)水溶液的50μg流感A/Udorn病毒(只用它時為對照)免疫之前和免疫后的14和28天在血清中的抗體滴度(血凝素抑制滴度)和在免疫之前和免疫后28天在唾液中的抗體滴度(用ELISA測定IgA)。
權利要求
1.一種免疫組合物，包含有免疫量的抗原和含量足以能誘導或增強對抗原的免疫反應的粘膜粘合劑。
2.權利要求1的組合物，其中抗原是流感病毒抗原。
3.權利要求1的組合物，其中粘膜粘合劑選自羧甲基纖維素鈉和其它纖維素類，聚親碳劑和Carbopol。
4.一種免疫組合物，包含有(a)免疫量的抗原，和(b)含量足以能誘導或增強對抗原的免疫反應的粘膜粘合劑和佐劑。
5.權利要求4的組合物，其中抗原是流感病毒抗原。
6.權利要求4的組合物，其中粘膜粘合劑選自羧甲基纖維素鈉和其它纖維素類，聚親碳劑和Carbopol。
7.權利要求4的組合物，其中佐劑選自胞壁酰二肽，角鯊烯，皂草苷和脂質A的一磷酰衍生物。
8.一種使動物免疫的方法，其中該方法包括給動物服用的免疫量的權利要求1的組合物。
9.權利要求8的方法，其中抗原是流感病毒抗原。
10.權利要求8的方法，其中粘膜粘合劑選自羧甲基纖維素鈉和其它纖維素類，聚親碳劑和Carbopol。
11.權利要求8的方法，其中服用該免疫組合物的方法是口服、鼻腔、直腸或扁桃體拭子給藥。
12.一種使動物免疫的方法，其中該方法包括給動物服用免疫量的權利要求4的組合物。
13.權利要求12的方法，其中抗原是流感病毒抗原。
14.權利要求12的方法，其中粘膜粘合劑選自羧甲基纖維素鈉和其它纖維素類，聚親碳劑和Carbopol。
15.權利要求12的方法，其中佐劑選自胞壁酰二肽，角鯊烯、皂草苷和脂質A的一磷酰衍生物。
16.權利要求12的方法，其中服用該免疫組合物的方法是口服、鼻腔、直腸或扁桃體拭子給藥。
17.一種使動物免疫的方法，其中該方法包括給動物口服免疫量的權利要求4的組合物。
18.權利要求17的方法，其中抗原為流感病毒抗原。
19.權利要求18的方法，基中給動物服用的抗體是包腸溶衣的劑型單位。
20.權利要求19的方法，基中抗原、粘膜粘合劑和佐劑同時給動物服用。
全文摘要
一種誘導動物對感染媒介產(chǎn)生免疫反應的藥物組合物，它含有對抗該感染媒介的抗原、粘膜粘合劑和任選的佐劑，以提高動物對抗原的免疫反應，抗原最好來自流感病毒。該藥物組合物經(jīng)口服給動物，可用于使動物免疫的方法中。
文檔編號A61K9/48GK1120310SQ94191614
公開日1996年4月10日 申請日期1994年3月11日 優(yōu)先權日1993年3月11日
發(fā)明者J·D·鄧肯, D·P·謝弗 申請人:塞科雷泰克公司