專利名稱：天胡荽有效部位的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中藥提取與應用的技術領域，具體涉及天胡荽有效部位的制備 方法及在制備抗肝纖維化藥物中的應用。
背景技術：
肝纖維化(h印atic fibrosis)是指肝細胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時，肝臟 內(nèi)纖維組織的異常增生，是諸多慢性肝病發(fā)展至肝硬化過程中所共有的病理組
織學變化，是影響慢性肝病預后的重要環(huán)節(jié)。造成肝細胞壞死和炎癥的致病因 子有很多，在國外，尤其是歐美國家，以酒精中毒為多數(shù)，在我國主要由肝炎 病毒所致最常見。
病毒性肝炎肝纖維化，是人體受到肝炎病毒感染后，引起肝內(nèi)慢性炎癥刺 激而產(chǎn)生纖維組織增生。目前研究表明引起慢性肝炎導致肝纖維化的病毒主要 是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)及丁型肝炎病毒(HDV)。在我國 主要是HBV導致的病毒性肝炎肝纖維化。國外學者對小兒慢性肝炎進行了 1一10 年的隨訪研究表明，3.4 32%慢性肝炎可發(fā)展為肝纖維化，年齡越大發(fā)生越顯 著。近年來，流行病學的研究表明，肝硬化患者中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 明顯高于非肝硬化者或一般人群，北京報告肝硬化病人的HBsAg陽性率高達 85.7%，上海報告為85.5%，臺灣報告為85.4%，廣州報告為74. 5%，廣西報告為 71.8%，這說明朋V是導致肝硬化的駐要因素。我國是乙型肝炎的高流行區(qū)，HBV 在全國人群中的感染率為60%, HBsAg攜帶者約有l(wèi)，5億，慢性乙型肝炎患者有 3000萬以上，這些病人如得不到有效的治療，就會演變成肝纖維化，肝纖維化 的許多患者通過不同的途徑，又進一步發(fā)展成肝硬化，在肝硬化的基礎上，又 有一定比例的患者，尤其是病毒性肝炎為病因者可繼續(xù)發(fā)展為肝癌，引起嚴重的不良后果?？梢姴《拘愿窝赘卫w維化是一類嚴重威脅我國人民群眾生命健康、 給國民經(jīng)濟造成重大負擔的疾病。
近年來，抗肝纖維化的治療雖然有了一些進展，但目前仍無理想的藥物， 秋水仙堿，青霉胺等十幾種藥物，雖有抑制肝纖維化的作用，但毒副作用較大， 限制了其臨床上的使用。因此研究開發(fā)抗病毒性肝炎纖維化藥物是一項極為緊 迫而重要的課題。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明通過對天胡荽的研究與提取，設計提 供一種天胡荽有效部位的制備方法及其在抗肝纖維的應用的技術方案。 所述的天胡荽有效部位的制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟
(1) 天胡荽藥材中加入1-10倍重量的乙醇提取1-3次，乙醇的濃度為 30-70%;
(2) 將上述的提取液減壓回收乙醇后上大孔樹脂柱，水洗脫3個體積后用 濃度50-70%的乙醇洗脫；
(3) 經(jīng)步驟(2)的純化液采用硅膠柱層析，收集洗脫液，減壓回收溶劑， 再用甲醇多次重結晶，即得到天胡荽的有效部位。
所述的天胡荽有效部位的制備方法，其特征在于步驟(1)用3-8倍重量的 乙醇提取2-3次，乙醇的濃度為40-60%。
所述的天胡荽有效部位的制備方法，其特征在于步驟(2)采用NKA-9、D101、 AB-8、 HPD100、 HPD400型大孔樹脂裝柱。
所述的天胡荽有效部位的制備方法，其特征在于步驟(3)采用氯仿甲醇 水不同比例的洗脫液進行洗脫。
所述的天胡荽有效部位在制備治療或預防肝纖維化的藥物中的應用。
所述的天胡荽有效部位的應用，其特征在于天胡荽有效部位可制備成藥劑學上使用的片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸、溶液劑和注射劑。
本發(fā)明以民間用于肝炎、肝硬化治療的天胡荽為研究對象，在相關藥效實 驗跟蹤指導下，篩選得到具有抗肝纖維化作用的有效部位，該方法設計合理、 工藝簡單、成本低，而且天胡荽有效部位來源于天然藥物，與同類治療抗肝纖
維化的化學藥品相比具有低毒高效性，并對有效部位進行了對HBV轉(zhuǎn)染H印G2
細胞體外的抑制試驗以及抗肝肝纖維化相關的藥效學實驗，表明其具有顯著的 藥理作用。
具體實施例方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，實施例中HAS、 HHAS為本發(fā)明 人對從天胡荽有效部位中分離得到的兩個單體成分的命名，天胡荽藥材采于杭 州地區(qū)，經(jīng)專家鑒定為傘形科植物天胡荽///^rozoO^e wT^/ or^'wWa Lam. 的全草。
實施例l
(1) 天胡荽藥材用8倍重量的乙醇提取3次，乙醇的濃度為50%，每次l 小時；提取工藝的驗證取藥材2kg，按最佳提取工藝進行提取，以HAS的提 取得率為考察指標，結果HAS的轉(zhuǎn)移率為87. 2%，有效部位的提取得率按HAS、 HHAS的總量計為1. 2%;
(2) 將上述的提取液減壓回收乙醇后，上HPD400型大孔樹脂柱，上樣液 的濃度為0.20mg (生藥)/ml，上樣量折合生藥與樹脂比為1: 4 (kg/L)，水洗 脫3個體積后用濃度70%的乙醇洗脫；
(3)取純化后的有效部位，采用硅膠柱層析，用CHC13:Me0H:H2O20:3:l (上層)-CHC13:Me0H:H20=10:3:l (上層)洗脫，收集CHC13:Me0H:H20二10:3:l 洗脫液，減壓回收溶劑，用甲醇多次重結晶，即得HAS，得率為0. 51% (HAS: 生藥)。實施例2
(O天胡荽藥材用6倍重量的乙醇提取2次，乙醇的濃度為60%，每次l
小時；
(2)將上述的提取液減壓回收乙醇后，上HPD400型大孔樹脂柱，上樣液 的濃度為0.25mg (生藥)/ml，上樣量折合生藥與樹脂比為1: 4 (kg/L)，水洗 脫3個體積后用濃度50%的乙醇洗脫；
(3)取純化后的有效部位，采用硅膠柱層析，用CHC13:Me0H:H2O20:3:l (上層)-CHC13:MeOH:H20=10:3:l (上層)洗脫，收集CHC13:Me0H:H20=10:3:1 洗脫液，減壓回收溶劑，用甲醇多次重結晶，即得HAS，得率為0. 52% (HAS: 生藥)。
實施例3
(1) 天胡荽藥材用10倍重量的乙醇提取1次，乙醇的濃度為70%;
(2) 將上述的提取液減壓回收乙醇后上NKA-9、 DlOl、 AB-8或HPD100大 孔樹脂柱，上樣液的濃度為0.25mg (生藥)/ml， 0. 30mg (生藥)/ml、 0. 15mg
(生藥)/ml上樣量折合生藥與樹脂比為1: 4 (kg/L)，水洗脫3個體積后用濃 度60%的乙醇洗脫；
(3)取純化后的有效部位，采用硅膠柱層析，用CHC13:MeOH:H2(^20:3:l
(上層)-CHC13:Me0H:H20=10:3:l (上層)洗脫，收集CHC13:Me0H:H20=10:3:1 洗脫液，減壓回收溶劑，用甲醇多次重結晶，即得HAS，得率為0. 49% (HAS: 生藥)。
一有效部位對HBV轉(zhuǎn)染H印G2細胞的體外抑制試驗
(1)藥物毒性試驗(TC50): MTT法測定結果表明50%死亡藥物濃度(TC50) 為18mg/ml。(2) 藥物對2.2. 15細胞分泌HBsAg、 HBeAg的抑制作用(IC50):有效部位 各劑量組對2. 2. 15細胞分泌的HBsAg活性有顯著的抑制作用，并顯示一定的量 效關系。有效部位三個高劑量組對2. 2. 15細胞分泌的HBeAg活性有顯著的抑制 作用，并顯示一定的量效關系，兩個低劑量組(1.1mg/ml和0.55mg/ml)無明
顯抑制作用(P〉0.05)。(表l， 2)
(3) 有效部位的治療指數(shù)依據(jù)有效部位對HBsAg、 HBeAg的抑制作用情況， 選擇HBsAg、 HBeAg作為藥物效果的篩選指標，通過MTT法測定藥物的細胞毒性 濃度，并計算出相應治療指數(shù)(TI)來評價藥物臨床應用前景，用TI的數(shù)值范 圍評價HAS抗乙肝病毒的活性。藥物效價評定TI》2:有效低毒；1<TI<2: 低效低毒；TI<1:有毒性作用，不適宜作為抗病毒藥物(表3)。
表1有效部位在2. 2. 15細胞培養(yǎng)中對冊sAg活性的抑制作用
組另IJ劑量(mg/ml)cpm抑制率(%)
空白對照組...14518±252. 44…
有效部位組0. 5511697±306. 88*42.45
1. 111491 ±346. 48*43. 5
2.211150±164. 05*45. 1
4. 58543 ±159. 81**58. 0
97913±523. 97林*61. 1
187148±422. 85***80. 1
注與空白對照組比較:*P<0. 05' **P<0. 01, *P<0. 001
表2有效部位在2. 2. 15細胞培養(yǎng)中對朋eAg活性的抑制作用組另U劑量(mg/ml)cpm抑制率(%)
空白對照組... 9841.331089.42...
有效部位組0.55 9148.0±502. 057.04
1.1 8173.5±19.0916. 95
2.2 7657.5 ±34. 65*22, 19
4.5 4544. ±75. 66林*53. 82
9 4124±311. 13林*58. 09
18 2725.5 ±231. 22林*87. 0
注與空白對照組比較:*P<0.05,**P<0. 01， *** P<0. 001
表3有效部位的治療指數(shù)
升^ HBsAg HBeAg
藥物 -
一___II__^_IL
有效部位 s n ^ ^ i T
二有效部位對小鼠急性肝損傷的試驗1. 1. 1藥物制備
①有效部位粉末溶于水中，每5g加植物油和吐溫各一滴助溶，分別配成濃
度為100mg/ml、 50mg/ml、 25mg/ml、 12. 5mg/ml及6. 25mg/ml的溶液。②聯(lián)苯 雙酯滴丸，42丸(1.5mg/丸)研磨成細粉，加吐溫和植物油各一滴，溶于10ml 水中，制成6.34mg/ml的溶液。冰箱保存?zhèn)溆谩?1. 1. 2急性肝損傷模型制備
健康ICR小鼠94只，隨機分為正常對照組、模型對照組、聯(lián)苯雙酯組、有 效部位5個劑量組。其中，正常組10只，其余各組各12只。正常組、模型組 均灌胃(ig)蒸餾水10ml/kg，其余各組分別給予聯(lián)苯雙酯50mg/kg，有效部位 2g/kg、 lg/kg、 0. 5g/kg、 0.25g/kg及0. 125g/kg。每天灌胃一次，連續(xù)5天。 末次給藥l小時后，除正常對照組腹腔注射生理鹽水10ml/kg外，其余各組均 腹腔注射TM 40mg/kg，禁食17h后進行指標測定。 1. 1. 3測定方法 1. 1. 3. 1血清樣品處理
小鼠摘眼球取血約1.5ml，靜置30分鐘，待血液凝固后，3500轉(zhuǎn)/分離心 IO分鐘，取上層血清，4'C冰箱低溫保存。 1. 1.3.2 ALT、 AST活性檢測
改良賴氏法測定，血清中的ALT能與丙氨酸和a -酮戊二酸反應生成丙酮酸 及谷氨酸，丙酮酸與2， 4-二硝基苯肼生成的2， 4-二硝基苯腙在堿性溶液中顯 棕紅色，在505nm處有最大吸收值。血清中的AST能與門冬氨酸和a -酮戊二酸 反應生成草酰乙酸和谷氨酸，草酰乙酸也可與2， 4-二硝基苯肼生成棕紅色的2， 4-二硝基苯腙，同上法測定。按試劑盒的說明操作，應用半自動生化儀測定。 1. 1. 3. 3病理標本的采集及HE染色
肝組織均取自肝左葉的相同部位，大小約5mmX5mmX5mm， 10%福爾馬林固
8定，常規(guī)石蠟切片。經(jīng)HE染色后，光鏡下觀察肝臟組織、細胞的病理變化。
1. 2統(tǒng)計方法
計量資料以^士S表示，組間差異采用EXCEL統(tǒng)計軟件以t檢驗進行統(tǒng)計 學處理。
2、 實驗結果
2. 1 —般生化測定
不同劑量有效部位組能顯著降低TAA所致小鼠急性肝損傷中的ALT含量， 且具有一定的量效關系。但對AST未見有何影響(表4)。
表4有效部位對TAA所致急性化學性肝損傷的影響
組另ilnALT(U/L)AST(U/L)
正常對照組1043. 9 ±7. 4**199±37. 5
急性肝損傷模型組12299. 1±135. 6292 ±89. 4
有效部位2g/kg組12126. 6±69. 7林280±89. 0
有效部位lg/kg組12154. 0±96. 7*271±119. 5
有效部位0. 5g/kg組12160. 8±92. 8*298±130. 4
有效部位0. 25g/kg組12178. 5±91. 6*239±69. 1
有效部位0. 125g/kg組12187. 3±92.0219±78.8
聯(lián)苯雙酯組12207. 1±138. 9354±144. 1
2.2病理檢査結果
光鏡下可見正常組動物肝小葉結構完整，細胞正常；模型組動物肝小葉 中央靜脈周圍肝細胞大面積變性、壞死，有大量炎細胞浸潤和肝組織充血。有 效部位治療組和陽性對照組動物肝小葉中央靜脈附近僅有少量肝細胞壞死，有 少量炎細胞浸潤和肝組織充血。 三有效部位對CCL所致大鼠慢性肝損傷的試驗
1. 1. 1藥物制備有效部位制備將有效部位粉末溶于水中，每5g加植物油和吐溫各一滴
助溶，分別配成濃度為12. 5mg/ml、 62. 5mg/ml及187. 5mg/ml的溶液。
漢防己甲素制備將100g漢防己甲素，加植物油以及吐溫各一滴作為乳 化劑，溶于100ml水中，配置成為L00ml/ml的溶液。4"C冰箱中保存?zhèn)溆谩?1.1.2慢性肝纖維化模型制備
SD大鼠50只，隨機分為正常對照組、模型對照組、漢防己甲素組 (10mg/kg)、有效部位高劑量組(L5g/kg)、有效部位中劑量組(0.5g/kg)、 有效部位低劑量組(0. lg/kg)。其中，模型組10只，其余各組各8只。采用 CCh制備慢性大鼠肝纖維化模型，即用40。/。CCL的橄欖油溶液皮下注射，首劑 量5ml/kg體重，從第二次開始3ml/kg體重，每3天造模一次，共6周。三個 給藥組和陽性組均從造模的第1天開始給藥，均為灌胃給藥。正常組、模型組 給予等量的蒸餾水。實驗持續(xù)6周。各組動物最后一次灌胃后24小時斷頭取 血，取肝臟組織浸泡于10%福爾馬林中固定。 1.1.3觀察指標及測定方法 1.1.3.1對大鼠一般情況及體重的觀察
每天觀察大鼠的一般癥狀，飲食變化，行為(自主活動，精神狀態(tài))及毛 發(fā)變化。
1.1.3.2血清ALT、 AST、 Alb、 TP水平的測定
取血后靜置30min，血液凝固后，于3500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上層血清， 按試劑盒操作，應用上海ANALYTECH-738PLUS半自動生化儀測定ALT、 AST水 平。
總蛋白的測定采用雙縮脲法，蛋白質(zhì)多肽鏈中的肽鍵在堿性溶液中與銅離 子作用產(chǎn)生紫紅色絡合物，在540nm波長處有特定吸收峰。按試劑盒的說明操 作。
10白蛋白測定采用BCG法，白蛋白具有與陰離子結合的特性，在PH4.2的環(huán) 境中溴甲酚綠(BCG)與白蛋白結合形成藍綠色復合物，在628rra波長處有最 大吸收值。按試劑盒的說明操作。 1.1.3.3病理標本的采集
肝組織均取自肝左葉的相同部位，大小約5mmX5mmX5mm， 10%福爾馬林固 定，常規(guī)石蠟切片。
1.1.3.4 HE染色，光鏡下觀察肝臟組織、細胞的病理變化，并做半定量分析。
1.1.3.5 VG染色光鏡下觀察肝臟組織纖維化程度，做半定量分析。
1. 1. 3. 6肝勻漿中羥脯氨酸含量測定肝組織加少量生理鹽水磨成勻漿，用95% 酒精脫脂半日，再用丙酮脫脂兩天，取出后在ll(TC烤箱中烘干，研成細粉， 測定羥脯氨酸含量。具體方法是取肝粉40mg放于磨口試管中，加6mol/L鹽 酸3ml，加蓋，于125。C烤箱中水解5小時(每30min補足鹽酸一次)，冷卻后 移入50ml容量瓶中，用6mol/L氫氧化鈉調(diào)PH接近6，稀釋并定容至50ml， 過濾。吸取濾液2ml放入試管中，加0.05mol/L氯氨T溶液lral，搖勻，室溫 放置20min，加3. 15mol/L過氯酸lml，放置5min，再加lml的10%對二甲氨 基苯甲醛溶液，于60。C水浴中保溫20min，顯色，冷卻后在550nra波長下比色。 試劑配制①檸檬酸緩沖液檸檬酸50g，冰醋酸12ml，醋酸鈉(3H20) 120g，氫氧化鈉34g，蒸餾水溶解并稀釋至1000ml，調(diào)PH至6.0，冰箱保存。 ②0.05mol/L氯氨T溶液1. 41g氯氨T溶于20ml水中，加30ml乙二醇甲醚， 再加50ml檸檬酸緩沖液，冰箱保存。③3. 15mol/L過氯酸70。/。過氯酸27ml， 蒸餾水稀釋至100ml。
10%對二甲氨基苯甲醛溶液對二甲氨基苯甲醛10g 溶于100ml乙二醇甲醚中，如不溶，在60。C水浴中加熱，冰箱保存。⑤標準試 劑稱取100mg羥脯氨酸溶于0. 01mol/L鹽酸中，移入100ml容量瓶，稀釋至 刻度，作為貯存標準液。取貯存液2ml，稀釋至100ml作為應用液，其濃度為20 u g/ml。
計算根據(jù)半自動生化儀讀出吸光度值X20ng/ml+2H (標準試劑的吸光 度值)X50 (稀釋倍數(shù))+40 (稱取肝粉的mg數(shù))二lmg干肝粉中所含Hyp 的i^g數(shù)(也即mg/g干肝)。 1. 2療效判定標準 1. 2. 1細胞變性壞死程度評分標準
肝組織大體及鏡下病理學改變按文獻肉眼觀察小鼠肝臟的外形、體積、顏 色及質(zhì)地的改變。HE染色后顯微鏡下觀察肝組織切片的病理變化，重點觀察肝 細胞變性、壞死，將肝細胞變性壞死程度化分成4級，即O級正常肝組織， 無變性壞死，評分O分；I級肝細胞變性范圍不超過肝小葉半徑的1/2，以 水變性為主，肝細胞呈點狀或小灶狀壞死，匯管區(qū)炎癥細胞浸潤，評分l分； II級肝細胞變性范圍超過肝小葉半徑1/2，以氣球樣變性為主，較多肝細胞 呈碎片狀壞死，匯管區(qū)大量炎癥細胞的浸潤，評分2分；III級肝細胞大片變
性壞死，范圍超過肝小葉半徑的2/3，并以肝細胞的碎片狀和橋接狀壞死為主，
肝實質(zhì)內(nèi)大量纖維組織增生，向內(nèi)伸展包繞肝小葉，且可見中央靜脈偏位，評
分3分。
1. 2. 2膠原纖維增生程度半定量標準
VG染色后，按如下半定量標準判斷膠原纖維增生程度。0級正常肝組織，
無膠原纖維增生，評分O分；I級膠原纖維明顯增多，從匯管區(qū)或中央靜脈 呈星狀向外延伸，無纖維隔形成，評分l分；II級膠原纖維明顯增多形成彼 此不連接的不完全性纖維隔，評分2分；ni級膠原纖維增多形成完全的相互 連接的纖維隔，分割肝實質(zhì)，評分3分。 1.3統(tǒng)計方法
計量資料以^ 士S表示，組間差異采用EXCEL統(tǒng)計軟件以t檢驗進行統(tǒng)計
12學處理。
2實驗結果
2.1大鼠一般情況
正常組大鼠毛色光澤，較溫順；模型組大鼠表現(xiàn)煩躁，易激怒。進食量及 飲水量各組大鼠無明顯區(qū)別。實驗過程中，各組大鼠無死亡記錄，模型組大鼠 毛發(fā)蓬松，且有部分皮膚潰爛；漢防己甲素組和有效部位組大鼠在外觀上與正 常組大鼠比較無明顯差異(表5)。
表5有效部位對各組大鼠體重變化及肝臟系數(shù)的影響
組另lj大鼠數(shù)體重(g)肝重(g)肝臟系數(shù)
正常對照組8280. 62 ±54. 6914. 23±3. 360. 0328 ±0.0046"
模型對照組10257. 11±43. 199. 01 ±0. 830. 0599±0. 0057
漢防己甲素組8257. 29±51. 0214. 21±3. 230. 0557±0. 0097
高劑量組8258. 58±46. 5015. 34±2. 680. 0552士0.0051'
中劑量組8253. 69±42. 7914. 18±2. 300. 0563±0. 0049
低劑量組8254. 36±43. 2814. 18±2. 010. 0559±0.0099
注與模型組比較*代0, 05，林AO. 01
2. 2 —般生化測定
除空白組外，與模型組比較，各組大鼠的ALT、 AST、 TP、 Alb指標變化無 明顯差異(表6)。
表6有效部位對肝纖維化大鼠肝功能的影響
組另lj大鼠數(shù)ALT(U/L)Alb (g/L)TP (g/L)
正常對照組89.8±1. 7932.80±1. 1063. 6±4. 72
模型對照組10216. 57±34. 4526. 86±3. 7261. 57±7. 63
漢防己甲素組8116. 43 ±39. 2928. 14±4. 4957. 71±2. 81
高劑量組8160. 43±27. 1827. 57±2. 1553. 86 ±4. 70
中劑量組8150±30.9429. 28±3. 4554. 28 ±3. 35
低劑量組8127. 86±20. 6128. 28±1.8054. 28 ±3. 45
注由于ALT值超出正常測量范圍，所得數(shù)值為血清稀釋10倍所測得
2. 3對肝臟羥脯氨酸含量的影響
低、中、高三種劑量的有效部位均能顯著降低大鼠肝臟Hyp含量(表7)。
13表7有效部位對肝纖維化人鼠肝組織中羥脯氨酸含量的影響
組別
大鼠數(shù)
Hyp (mg/g干肝)
正常對照組
模型對照組
漢防己甲素組
高劑量組
中劑量組
低劑量組
8 10
8 8 8 8
20. 28±3. 18*: 39. 69 ±4. 29
24. 38 ±2. 29*
25. 20 ±1.54" 24. 64±2. 10*' 27. 11 ±2. 85*'
注與模型組比較**A0.01
2.4對大鼠肝臟病理學的影響 2.4.1肉眼觀察
正常對照組肝臟呈紅褐色，表面光滑，質(zhì)軟；慢性肝損傷組肝臟明顯腫脹，
粗糙，色蒼黃，部分肝表面呈結節(jié)狀，質(zhì)硬，油膩；漢防己甲素組和各有效部
位給藥組部分肝臟輕度腫大，黃褐色，表面尚光滑。
2. 4. 2 HE染色觀察有效部位的療效
光鏡下正常組肝臟結構正常，肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，未見
明顯病變。模型的肝細胞明顯腫脹變性，部分氣球樣變性，其中多為脂肪變性、
小灶性壞死，部分肝細胞呈結節(jié)樣再生，門脈區(qū)及壞死區(qū)纖維組織大量增生，
包繞肝細胞形成大小不等的假小葉；高倍鏡下假小葉內(nèi)中央靜脈偏位或缺失，
肝細胞呈脂肪變性，肝纖維組織明顯增生，與正常組比有顯著性差異(P〈0. 01)。
漢防己甲素組和有效部位高劑量給藥組肝組織結構較完整，肝細胞變性、壞死
較損傷組輕(P〈0.05)，中、低劑量組治療效果沒有顯著差異(表8)。
表8有效部位對各組大鼠肝細胞變性壞死程度的影響
組另IJ士開粉肝細胞變性壞死程度
入眠雙0IIIIII平均
正常組862000. 25"
模型組10000103.00
漢防己甲素組802242. 25*
高劑量組801342. 37*
中劑量組801252.50
低劑量組800262. 75
注與模型組比較:*代0. 05,**代0. 012. 4. 3 VG染色觀察肝臟組織纖維化程度
普通光鏡下正常肝組織膠原纖維及肝竇網(wǎng)狀纖維均成鮮紅色。正常對照組 肝臟形態(tài)學正常，僅見血管壁有少量纖細膠原，肝組織內(nèi)無纖維組織增生。模 型對照組可見肝小葉結構紊亂，匯管區(qū)擴大，纖維組織明顯增生，較粗纖維間 隔形成，并向外延伸分割肝小葉。有效部位組及漢防己甲素組肝小葉結構較紊 亂，與模型組比較，中央靜脈周圍及匯管區(qū)纖維組織輕度增生或有纖細的纖維
間隔形成，纖維條索變少、變細。各組大鼠纖維化程度見表9。
表9有效部位對各組大鼠纖維增生程度的影響
組別
大鼠數(shù)
纖維化分期
II
III
平均
正常對照組
模型對照組
漢防己甲素組
高劑量組
中劑量組
低劑量組
8 10 8 8 8 8
0
2. 80 1. 50" 1. 75**
1. 50"
2. 13*
注與模型組比較*代0.05， **代0.01
四有效部位及HAS對豬血清所致大鼠慢性肝損傷的試驗
1. 1. 1藥物制備
有效部位制備將有效部位粉末溶于水中，每5g加植物油以及吐溫各一滴 助溶，分別配置成為50mg/ml， 150mg/ml的溶液。
HAS制備將HAS粉末溶于水中，每5g加植物油以及吐溫各一滴助溶，分 別配置成為50mg/ml， 150mg/ml的溶液。
陽性藥制備將100萬單位的Y干擾素粉末溶于5ml的生理鹽水，制備成 20萬單位/ml的T干擾素注射液。
以上藥物均放置在4'C冰箱中保存?zhèn)溆谩?1. 1. 2肝纖維化模型制備以及分組
15Wistar大鼠70只，隨機分成正常對照組，模型對照組，陽性藥(Y干擾 素)對照組(0. 5ml/kg)， HAS中劑量組(0. 5g/kg)， HAS高劑量組(1.5g/kg)， 有效部位中劑量組(0.5g/kg)， v高劑量組(1.5g/kg)。其中模型組12只，空 白組8只，其余各組均為10只。采用豬血清致免疫型纖維化模型，即采用0. 5ml 的精制豬血清進行腹腔注射，每周兩次，共八周?？瞻捉M大鼠腹腔注射0.5ml 生理鹽水作為對照。
HAS (中，高)組，有效部位(中，高)組和陽性藥組于造模首日起開始給 藥，陽性藥組采用肌肉注射的方法給藥，其余4四組采用灌胃給藥?？瞻捉M， 模型組予以等量蒸餾水作為對照。
實驗共持續(xù)八周，用藥期間每三天稱重一次。于最后一次給藥后，各組動 物禁食24小時，眼睚取血后處死，取肝臟組織浸泡于10%福爾馬林中固定。 1.1.3觀察指標及其測定方法
1.1.3.1血清指標取血后靜置30min后，于4000r/min離心10分鐘，取上層 血清，按試劑盒操作，測定ALT， AST， ALB， TP。
1.1.3.2 HYP測定肝組織加少量生理鹽水磨成勻漿，用95%酒精脫脂一天， 再用丙酮脫脂兩天，取出后在ll(TC烘箱中烘干，碾成肝粉，用于測定HYP的 含量。取肝粉40mg放于磨口試管中，加6mo1/1鹽酸3ml，加蓋后，放于125 t:烘箱中水解5h，每30min補足鹽酸，冷卻后，利用6mo1/1氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH 接近6，稀釋并定容致50ml，過濾。吸取濾液2ml放入試管中，假如0. 05mol/l 氯胺T溶液lml，搖勻，室溫放置20min，加3. 15mol/l高氯酸lml，放置5min， 再加入lml的10%對二甲氨基苯甲醛溶液，于6(TC水浴中保溫20min，顯色， 冷卻后在550nm波長下比色。
試劑配置 檸檬酸緩沖液檸檬酸50g，冰醋酸12ml，醋酸鈉120g，氫 氧化鈉34g，蒸餾水溶解并稀釋至1000ml，調(diào)節(jié)PH至6.0， 4"C保存?zhèn)溆?。?br> 160. 05ml/l氯胺T溶液1.41g氯胺T溶于20ml水中，加30ml乙二醇甲醚。再 加50ml檸檬酸緩沖液，4。C保存?zhèn)溆?。?. 15mol/l高氯酸70。/。高氯酸27ml， 蒸餾水稀釋至100ml。④l(m對二甲氨基苯甲醛溶液對二甲氨基苯甲醛溶液10g 溶于100ml乙二醇甲醚中，如不溶，在6(TC水浴中加熱，冰箱保存。(DHYP標 準試劑，稱取100mgHYP溶于0.01mol/l鹽酸中，定容至100ml，作為C:存保準 液。取其中2ml，稀釋至100ml作為應用液，其濃度為20 u g/ml。
1. 1. 3. 3取材以及病理半定量分析肝組織均取自肝左葉的相同部位，大小約 為5mmX5mmX5mm, 10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片。在光鏡下對H-E染色切 片和MASSON染色切片進行觀察，并進行半定量分析。
1. 1.4療效判定標準
1. 1. 4. 1采用組織學療效評估采用半定量計分系統(tǒng)(SSS)對肝臟纖維化程度進 行量化處理，進而評估藥物對于肝纖維化的治療效果。其具體標準見表IO。
表io纖維化半定量計分系統(tǒng)
記小葉(L)匯管區(qū)纖維間隔
分靜脈周/竇周(P)數(shù)量(N)寬度(w)
0 1 2 3 4無 局限，少數(shù) 彌散，多數(shù)無 擴大無隔 擴大有隔 肝硬化無 《6/10mm 》6Zl0mm 肝硬化細 疏松，寬 致密，寬 》2/3活檢面積
計分L+P+2x (NxW) 1.1.4.2肝表面纖維束徑寬的定量分析，各組MASS0N染色切片在X10鏡下， 各取3個視野，并用Motic Images Advanced 3. 0測試系統(tǒng)軟件對其進行周長 和面積的測定，用周長與面積的比值作為其徑寬的量度，進而來判斷藥效。 1.2統(tǒng)計方法
各計量資料以^ ±S表示，組間差異采用EXCEL統(tǒng)計軟件以t檢驗進行統(tǒng)計 學處理。
172.實驗結果
2. 1對于大鼠體征的影響
造模前，各組大鼠健康狀態(tài)良好，進食、飲水均正常，糞便成形，毛色有 光澤。造模后，模型組大鼠毛色較其他各組大鼠黯淡，且糞便大多粘濕，較稀。 除了正常組外，其余各組間的體重以及肝臟系數(shù)無明顯差異。各組大鼠體重， 肝重以及肝臟系數(shù)見表ll。
表ll HAS及有效部位對各組大鼠的體重，肝重以及肝臟系數(shù)的影響
組別大鼠數(shù)體重(g)肝重(g)肝臟系數(shù)
正常組8334. 18±25. 78'10. 35 ±0. 940. 03096±0. 00104"
模型組12313. 59±16. 7110. 56±0. 860.03367±0. 00184
Y干擾素組10311. 53±26. 0110. 38±1. 350. 03319±0. 00221
HAS中劑量組10316. 18±21.0311.06±1. 060. 03柳±0. 00167
HAS高劑量組10314. 01±16. 6810. 94±1. 120. 03480±0. 00254
有效部位中劑量組10318. 98±8. 9110. 81±0. 620. 03389±0. 00129
有效部位高劑量組10317. 28±11.8611.03±0. 560.03477±0. 00221
注與模型組比較*P<0.05， **P<0. 01
2. 2對于血清中ALT以及AST活性的影響
模型組大鼠血清中的ALT以及AST活性明顯高于正常大鼠(P<0.01)，說明 豬血清作為異種蛋白，對大鼠的肝組織造成實質(zhì)性肝損傷。而HAS組，有效部 位組以及Y干擾素組的ALT以及AST的活性明顯低于模型組(P<0. Ol—O. 05)。 結果見表12。
表12HAS對血清中ALT以及AST的影響
組別大鼠數(shù)ALT(U/L)AST(U/L)
正常組862 ±13"167 ±28**
模型組12116±18271 ±25**
Y干擾素組1073±1廣186 ±29"
HAS中劑量組1095 ±14'228±50'
HAS高劑量組1088 ±14"222 ±35"
有效部位中劑量組1080 ±14'*196 ±30"
有效部位高劑量組1079 ±15"192 ±29"
注與模型組比較*P<0.05， "P<0.01
2. 3對于血清中TP， ALB， Glb影響
通過TP和ALB的含量來計算GLB的含量(GLB二TP-ALB)，并計算血清中
18ALB/GLB的含量比。各組大鼠血清中的ALB/GLB差異不顯著，豬血清并不能影 響血清中TP， ALB， GLB的含量。結果見表13。
表13 HAS及有效部位對血清中ALB， TP， GLB以及ALB/GLB的影響
組別大鼠數(shù)TP (g/L)ALB (g/L)GLB (g/L)ALB/GLB
空白組863. 75±11. 4827. 50±5. 1036. 25±12. 970. 88±0. 40
模型組1271. 72±14. 8832. 00±5. 3939. 72 ±16. 401.09±0. 99
y干擾素組1057. 41±6. 9227. 10±2. 5130. 31±6. 080. 93±0. 26
HAS中劑量組1061.80±7. 6528. 00±2. 9833. 80±7. 150. 87±0. 23
HAS高劑量組1069. 05±16. 0030. 20±5. 4338. 85±16. 390. 92 ±0. 49
有效部位1057. 15±15. 5728. 10±4.9132. 54±12. 24l.Ol土O. 46
(中劑量組)
有效部位1059. 66±19. 9027. 20±4. 9232. 46 ±18. 851. 00±0. 34
(高劑量組)
2. 4對肝臟HYP的影響
模型組肝臟中的HYP含量明顯高于正常組大鼠(P<0.01)，證實了豬血清誘 導的肝纖維化模型已經(jīng)復制成功。不同劑量HAS以及有效部位均能顯著降低HYP
的含量(P〈0.01)，并顯示出--定的量效關系。結果見表14
表14 HAS及有效部位對肝臟HYP的影響組別大鼠數(shù)HYPug/g (干肝)
正常組864. 3±21"
模型組12170. 0±35
y干擾素組1088. 5±32. 3"
HAS中劑量組10102. 0±23"
HAS高劑量組1097. 5 ±16**
有效部位中劑量組10111. 5±33"
有效部位高劑量組10108. 5土25"
注與模型組比較"P<0.01
2. 5肝纖維化半定量計分
在光鏡對于各組大鼠肝臟的MASSON染色切片進行觀察比較，參照SSS系統(tǒng) 對其進行纖維化半定量計分。結果見表15
表15肝纖維化半定量計分
組別大鼠數(shù)計分
正常組80±0"
模型組1214. 67±3. 11
Y千擾素組107, 60 ±1.90**
HAS中劑量組1012. 90±3. 75HAS高劑量組 10 有效部位中劑量組 10 有效部位高劑量組 _^_
注與模型組比較"P<0.01
2.6肝表面纖維束的定量計算
利用Motic Images Advanced 3. 0測試系統(tǒng)軟件測量MASSON染色切片下的 纖維束的面積和周長，通過其面積與周長的比值來考查HAS對肝表面纖維的治 療效果。結果表明，Y干擾素，高劑量HAS以及兩個劑量的有效部位均能減少 豬血清所致的肝臟纖維化程度(P〈0. 05-0. 01),結果見表16。
表16 HAS及有效部位對于肝纖維束的影響
組別大鼠數(shù)總面積(cm2)面積/周長
空白組80±0"0±(T
模型組120, 193±0. 013112.91±9.06
Y干擾素組100. 134±0. 014'*90. 97±8. 86**
HAS中劑量組100. 167±0.022*106. 30 ±10. 80
HAS高劑量組100. 147±0. 012**98. 09±8. 37**
有效部位中劑量組100. 133±0.013"97. 47 ±10. 19**
有效部位高劑量組100. 135±0. 015"96. 00 ±14. 71**
注與模型組比較*P<0.05， **P<0.01
9. 60±2. 72' 8. 22士1.56' 8. 29±2. 63'
權利要求
1. 天胡荽有效部位的制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟(1)天胡荽藥材中加入1-10倍重量的乙醇提取1-3次，乙醇的濃度為30-70％；(2)將上述的提取液減壓回收乙醇后上大孔樹脂柱，水洗脫3個體積后用濃度50-70％的乙醇洗脫；(3)經(jīng)步驟(2)的純化液采用硅膠柱層析，收集洗脫液，減壓回收溶劑，再用甲醇多次重結晶，即得到天胡荽的有效部位。
2. 如權利要求1所述的天胡荽有效部位的制備方法，其特征在于步驟(1) 用3-8倍重量的乙醇提取2-3次，乙醇的濃度為40-60%。
3. 如權利要求1所述的天胡荽有效部位的制備方法，其特征在于步驟(2) 采用NKA-9、 D101、 AB-8、 HPD100、 HPD400型大孔樹脂裝柱。
4. 如權利要求1所述的天胡荽有效部位的制備方法，其特征在于步驟(3) 采用氯仿甲醇:水不同比例的洗脫液進行洗脫。
5. 天胡荽有效部位在制備治療或預防肝纖維化的藥物中的應用。
6. 如權利要求5所述的天胡荽有效部位的應用，其特征在于天胡荽有效部 位可制備成藥劑學上使用的片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸、溶液劑和注射劑。
全文摘要
天胡荽有效部位的制備方法及應用，屬于中藥提取與應用的技術領域。其有效部位的制備方法包括天胡荽藥材中加入1-10倍重量的乙醇提取1-3次，乙醇的濃度為30-70％；將提取液減壓回收乙醇后上大孔樹脂柱，水洗脫3個體積后用濃度50-70％的乙醇洗脫；將純化液采用硅膠柱層析，收集洗脫液，減壓回收溶劑，再用甲醇多次重結晶，即得到天胡荽的有效部位，天胡荽有效部位具有治療或預防肝纖維化的作用，本發(fā)明設計合理、工藝簡單、成本低，而且天胡荽有效部位來源于天然藥物，與同類治療抗肝纖維化的化學藥品相比具有低毒高效性，并對有效部位進行了對HBV轉(zhuǎn)染HepG2細胞體外的抑制試驗以及抗肝肝纖維化相關的藥效學實驗，表明其具有顯著的藥理作用。
文檔編號A61K36/23GK101474222SQ20091009581
公開日2009年7月8日 申請日期2009年2月5日 優(yōu)先權日2009年2月5日
發(fā)明者張如松 申請人:張如松