專(zhuān)利名稱(chēng)：用于癌癥免疫治療的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體而言涉及癌癥領(lǐng)域以及用于癌癥免疫治療的方法和組合物的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療已經(jīng)是治療癌癥(包括白血病、實(shí)體瘤和轉(zhuǎn)移瘤)的公認(rèn)的常規(guī)方法。免疫治療直接地或間接地利用身體的免疫系統(tǒng)來(lái)縮小或消除癌癥，并且已作為常規(guī)癌癥治療的輔助方法被研究了很多年?，F(xiàn)在認(rèn)為，人免疫系統(tǒng)是癌癥治療的未開(kāi)發(fā)資源，一旦我們適當(dāng)控制免疫系統(tǒng)的組分，就可開(kāi)發(fā)有效的治療方法。由于關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)分子和免疫信號(hào)被鑒定并制備為治療劑，這類(lèi)藥劑的臨床有效性可用熟知的癌癥模型來(lái)測(cè)試。免疫治療策略包括給予:疫苗、活化的細(xì)胞、抗體、細(xì)胞因子、趨化因子以及小分子抑制劑、反義寡核苷酸和基因治療物。雖然，關(guān)于控制和指導(dǎo)免疫應(yīng)答，我們已經(jīng)了解了很多，但是仍需要開(kāi)發(fā)更新和更有效的針對(duì)癌癥治療的免疫治療方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明總體而言涉及癌癥領(lǐng)域和用于癌癥免疫治療的方法和組合物的領(lǐng)域。本發(fā)明至少部分基于，以下發(fā)現(xiàn):通過(guò)在腫瘤微環(huán)境中激活抗原呈遞細(xì)胞(APC)并將抗原運(yùn)送到APC進(jìn)行加工并呈遞給腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞，設(shè)計(jì)充當(dāng)免疫佐劑的可生物降解納米顆粒在體內(nèi)可刺激針對(duì)癌癥的T細(xì)胞應(yīng)答。在具體的實(shí)施方案中，瘤內(nèi)注射納米顆粒后冷凍消融腫瘤可產(chǎn)生一種針對(duì)任何類(lèi)型實(shí)體惡性腫瘤的基于細(xì)胞的患者特異性強(qiáng)效腫瘤疫苗。所述納米顆粒與其他免疫控 制物一起協(xié)同作用以克服腫瘤誘導(dǎo)耐受機(jī)制——包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的消極影響、APC抑制以及腫瘤特異性CD4+效應(yīng)輔助性T細(xì)胞缺乏。在佐劑如明礬中乳化的抗原通?？烧T發(fā)2型輔助性T細(xì)胞應(yīng)答和抗體的產(chǎn)生，但是卻不能誘發(fā)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。相反，納米顆粒中的抗原被加工和呈遞以被CD8+T細(xì)胞識(shí)別，其中所述CD8+T細(xì)胞是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵效應(yīng)物。包含納米顆粒的聯(lián)合治療可有效誘發(fā)強(qiáng)效的全身性抗腫瘤免疫，導(dǎo)致消除微小轉(zhuǎn)移、防止早期癌癥復(fù)發(fā)或消退肉眼可見(jiàn)腫瘤和延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移癌患者的生存期。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的方法和組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種用于在患者中治療癌癥的方法包括以下步驟:(a)在癌癥部位或其附近給予有效量的組合物，所述組合物可促進(jìn)針對(duì)所述癌癥的治療性免疫應(yīng)答；和(b)消融所述癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包括(a)聚合物顆粒；和(b)任選的一種或多種治療劑，所述治療劑封裝在所述聚合物顆粒內(nèi)或被納入至所述聚合物顆粒上或內(nèi)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療異常細(xì)胞增殖的方法和組合物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，一種用于在患者中治療異常細(xì)胞增殖的方法包括以下步驟:(a)在異常細(xì)胞增殖部位或其附近給予有效量的組合物，所述組合物可促進(jìn)針對(duì)所述異常細(xì)胞增殖的治療性免疫應(yīng)答，所述組合物包括(i)聚合物顆粒；和(ii)任選的一種或多種治療劑，所述治療劑封裝在所述聚合物顆粒內(nèi)或被納入至所述聚合物顆粒上或內(nèi)；和(b)消融所述異常細(xì)胞增殖。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述一種或多種治療劑是由所述異常增殖細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)的抗原。本發(fā)明的方法可以還包括以下步驟:在給予所述組合物之前或之后，向所述患者給予有效量的藥劑，所述藥劑可減輕抗腫瘤免疫的抑制。在具體的實(shí)施方案中，所述藥劑選自烷化劑、類(lèi)固醇、核苷酸抑制藥物、化學(xué)治療藥物、單克隆抗體、毒素和炎性還原劑。在更具體的實(shí)施方案中，所述藥劑選自環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、阿霉素、地尼白介素、地尼白介素2 (diftitox)、貝伐單抗和多烯紫衫醇。在一些實(shí)施方案中，所述聚合物顆粒包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或其共聚物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述聚合顆粒是PLGA。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還包括一種或多種免疫佐劑，所述佐劑封裝于所述聚合物顆粒內(nèi)或被納入至所述聚合物顆粒上或內(nèi)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述免疫佐劑是Toll樣受體(TLR)配體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述免疫佐劑是單磷脂A(MPL)。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，所述免疫佐劑是脂多糖(LPS)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫佐劑是C型凝集素受體配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫佐劑是核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體配體。所述免疫佐劑也可是維甲酸誘導(dǎo)基因I (RIG)樣受體(RLR)配體?；蛘?，所述免疫佐劑是晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)配體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫佐劑選自LPS或其衍生物、CpG寡核苷酸、TLR3配體、TLR7配體、TLR9配體、MPL配體和RC529。事實(shí)上 ，一種或多種免疫佐劑可封裝于所述聚合物顆粒內(nèi)，或被納入至所述聚合物顆粒上或內(nèi)。例如，TLR4配體和TLR7配體可封裝于所述聚合物顆粒內(nèi)或被納入至聚合物顆粒上或內(nèi)。在一個(gè)具體的方面，所述一種或多種治療劑是癌抗原。在具體的實(shí)施方案中，所述一種或多種治療劑選自腫瘤抗原、CD4+T細(xì)胞表位、細(xì)胞因子、化學(xué)治療劑、放射性核素、小分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、光熱天線、小干擾RNA、單克隆抗體和免疫學(xué)危險(xiǎn)信號(hào)傳遞分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述治療劑是Sipuleucel-T。在這類(lèi)實(shí)施方案中，所述異常細(xì)胞增殖是前列腺癌。所述治療劑還可以是碳酸酐酶IX。在這類(lèi)實(shí)施方案中，所述異常細(xì)胞增殖是腎癌、結(jié)腸癌或?qū)m頸癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑是癌胚抗原。在這些實(shí)施方案中，所述異常細(xì)胞增殖是乳腺癌、肺癌或結(jié)腸癌。在本發(fā)明的方法中，消融癌癥的步驟通過(guò)選自如下的方法實(shí)現(xiàn):冷凍消融、熱消融、放射治療、化學(xué)治療、射頻消融、電穿孔、酒精消融、高強(qiáng)度聚焦的超聲、光動(dòng)力療法、單克隆抗體和免疫毒素。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述消融癌癥的步驟由冷凍消融實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于在患者中治療實(shí)體瘤的方法，所述方法包括以下步驟:(a)向所述患者給予有效量的藥劑，所述藥劑能減輕抗腫瘤免疫的抑制；(b)在腫瘤部位或其部位附近給予有效量的組合物，所述組合物包括(i)聚合物納米顆粒；(ii) TLR配體、C型凝集素受體配體、NOD樣受體配體、RLR配體和/或RAGE配體中的一種或多種，所述配體封裝于所述納米顆粒內(nèi)或被納入至所述納米顆粒上或內(nèi)；和(iii) 一種或多種封裝于所述納米顆粒內(nèi)的腫瘤抗原；和(c)對(duì)所述實(shí)體瘤實(shí)施冷凍消融。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于在患者中治療實(shí)體瘤的方法，所述方法包括以下步驟:(a)在腫瘤部位或部位附近給予有效量的組合物，所述組合物包括(i)聚合物納米顆粒；(ii) TLR配體、C型凝集素受體配體、NOD樣受體配體、RLR配體和/或RAGE配體中的一種或多種，所述配體封裝在所述納米顆粒內(nèi)或被納入至所述納米顆粒上或內(nèi)；
(iii)一種或多種封裝在所述納米顆粒內(nèi)的腫瘤抗原；和(b)消融所述實(shí)體瘤。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種用于在患者中治療癌癥的方法，所述方法包括以下步驟:(a)向所述患者給予有效量的環(huán)磷酰胺；(b)在腫瘤部位或其附近給予有效量的組合物，所述組合物包括(i)包含PLGA的納米顆粒；(ii)被納入至所述納米顆粒上的MPL ;和
(iii)一種或多種封裝在所述納米顆粒內(nèi)的腫瘤抗原；和(c)消融所述癌癥。


圖1描繪了本發(fā)明的顆粒。圖1A是脂多糖(LPS)修飾的、封裝有抗原的納米顆粒的示意圖。圖1B示出納米顆粒的掃描電子顯微鏡照片。圖2說(shuō)明實(shí)施例1中描述的實(shí)驗(yàn)方案。圖3的曲線圖顯示給藥環(huán)磷酰胺(Cy或Cytoxan)和本發(fā)明組合物后冷凍消融的(如在實(shí)施例1中進(jìn)一步描述的)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式應(yīng)理解，本發(fā)明不限于本文所描述的具體方法和組分等，因?yàn)樗鼈兛赡軙?huì)有所不同。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅為了描述具體的實(shí)施方案，并不應(yīng)被認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍。應(yīng)注意，除非文中明確地另有說(shuō)明，本文和所附權(quán)利要求書(shū)中使用的單數(shù)形式“a”、“an”、“the”均包括復(fù)數(shù)指代物。因此，例如，“顆?！笔侵敢粋€(gè)或多個(gè)顆粒，并包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。 除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本公開(kāi)所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。描述了具體的方法、設(shè)備和材料，即使本文所述的這些材料和方法的任何類(lèi)似物或等同物可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明。本文引用的所有出版物——包括期刊文獻(xiàn)、書(shū)、手冊(cè)、公開(kāi)的專(zhuān)利申請(qǐng)和授權(quán)的專(zhuān)利，均以引用的方式納入本文。此外，提供了說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和所附權(quán)利要求書(shū)中使用的一些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)的含義。所述定義在本質(zhì)上并不意味著進(jìn)行限制，而是用于提供對(duì)本發(fā)明某些方面更清晰的理解。1.定義整個(gè)說(shuō)明書(shū)使用了以下定義。其他定義納入說(shuō)明書(shū)中以便于參考。術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指輔助或改善藥物作用的任何物質(zhì)——包括但不限于免疫佐劑，所述免疫佐劑增強(qiáng)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答和/或使針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答多樣化。因此，免疫佐劑是能夠加強(qiáng)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的化合物。免疫佐劑可增強(qiáng)體液和/或細(xì)胞免疫。在一些實(shí)施方案中，免疫佐劑刺激先天性免疫應(yīng)答。免疫佐劑本文中也可以被稱(chēng)為“免疫增強(qiáng)劑”。本文所用的“抗原”是指包含一個(gè)或多個(gè)可誘發(fā)免疫應(yīng)答的表位(例如，線性、構(gòu)象或兩者)的分子。所述術(shù)語(yǔ)可與術(shù)語(yǔ)“免疫原”互換使用。術(shù)語(yǔ)“抗原”可表示亞基抗原，即天然與抗原相關(guān)的整個(gè)有機(jī)體上分開(kāi)且分離的抗原，也可表示死亡的、減毒的或滅活的細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)或其他病原體或腫瘤細(xì)胞?？贵w如抗獨(dú)特型抗體或其片段以及可模擬抗原或抗原決定簇的合成肽模擬表位也在抗原的定義范圍內(nèi)。相似地，在體內(nèi)表達(dá)免疫原性蛋白或抗原決定簇的寡核苷酸或聚核苷酸，如在核酸免疫應(yīng)用中使用的，也包括在本文抗原的定義中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指一種類(lèi)型的過(guò)度增生性疾病——包括以調(diào)控下降的或不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)為特征的惡性物。已知幾乎所有組織的癌癥。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤、白血病或淋巴樣惡性物。這類(lèi)癌癥的更具體實(shí)例在下文記錄，包括鱗狀細(xì)胞癌(例如，鱗狀上皮細(xì)胞癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌和肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、包括胃腸癌的胃癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌，肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌，肝細(xì)胞癌(h印atic carcinoma)以及頭頸癌。術(shù)語(yǔ)“癌癥”包括原發(fā)性惡性物細(xì)胞或腫瘤(例如，其細(xì)胞未遷移至原始惡性物或腫瘤部位之外的受試者身體部位的惡性物或腫瘤)和繼發(fā)性惡性細(xì)胞或腫瘤(例如,惡性細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)移到原始腫瘤部位不同的繼發(fā)部位引起的惡性細(xì)胞或腫瘤)。術(shù)語(yǔ)“癌”包含在更廣義術(shù)語(yǔ)“異常細(xì)胞增殖”的范圍內(nèi)，所述“異常細(xì)胞增殖”也被稱(chēng)為“過(guò)度細(xì)胞增殖”或“細(xì)胞增生性疾病”。與異常細(xì)胞增殖有關(guān)疾病的實(shí)例包括轉(zhuǎn)移性腫瘤、惡性腫瘤、良性腫瘤、癌、前癌、增生、疣和息肉，以及非癌性病癥如良性黑色素瘤、良性軟骨瘤、良性前列腺增生、痣、異常增生痣、發(fā)育異常、增生和表皮層內(nèi)發(fā)生的其他細(xì)胞生長(zhǎng)。前癌的類(lèi)型包括獲得性小的或肉眼可見(jiàn)的前癌、獲得性核異型性大病變、會(huì)發(fā)展成癌的隨遺傳增生綜合征出現(xiàn)的前期病變和獲得性彌漫性增生和彌漫性化生。小的或肉眼可見(jiàn)的前癌的實(shí)例包括HGSIL(高級(jí)別的子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變)、AIN(肛門(mén)上皮內(nèi)瘤形成)、聲帶發(fā)育異常、(結(jié)腸的)異常隱窩、PIN(前列腺上皮內(nèi)瘤形成)。具有核異型的獲得性大病變的實(shí)例包括管狀腺瘤、AILD(血管免疫母細(xì)胞性淋巴腺病伴蛋白異常血癥)、非典型腦膜瘤、胃息肉、大斑塊副銀屑病、骨髓發(fā)育不良、乳頭狀移行細(xì)胞原位癌、伴胚細(xì)胞增多的頑固性貧血和Schneiderian乳頭狀瘤。本文所用的“表位”是給定物質(zhì)(例如抗原分子或抗原復(fù)合體)決定其免疫特異性的那部分。表位在本申請(qǐng)抗原定義的范圍內(nèi)。通常，表位是天然存在抗原中的多肽或多糖。在人工抗原中，它可以是小分子量物質(zhì)如氨苯胂酸衍生物。通常，B細(xì)胞表位包括至少約5個(gè)氨基酸，但也可以小至3-4個(gè)氨基酸。T細(xì)胞表位例如CTL表位通常包括至少約7-9個(gè)氨基酸，輔助性T細(xì)胞表位基通常包括至少約12-20個(gè)氨基酸。對(duì)抗原或給定物質(zhì)(例如抗原性分子、癌細(xì)胞、異常細(xì)胞增殖等)的“免疫性應(yīng)答”或“免疫應(yīng)答”是受試者對(duì)感興趣組合物中存在的分子發(fā)生體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的過(guò)程?！氨Ｗo(hù)性免疫應(yīng)答”或“治療性免疫應(yīng)答”是指對(duì)源自致病性抗原的抗原(例如來(lái)自癌細(xì)胞的腫瘤抗原)的免疫應(yīng)答，所述應(yīng)答以某種方式預(yù)防、改善、治療(如本文所定義的)或至少部分地減輕疾病癥狀、副作用或惡化。本文所用的術(shù)語(yǔ)“顆?！蓖ǔＪ侵钢睆皆诩sIOOOnm和小于約0.1nm之間，直徑在約500和約IOnm之間，或這更特別是直徑在約20nm和約500nm之間，的納米顆粒。所述術(shù)語(yǔ)通常還指直徑在約0.5和約1000微 米之間，直徑在約I微米和約500微米之間，或者更特別是直徑在約10微米和約100微米之間，的微米顆粒。本文所用的“受試者”或“患者”是指?jìng)€(gè)體，可包括家養(yǎng)動(dòng)物(如貓、狗等)；家畜(如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鳥(niǎo)類(lèi)。在一方面，所述受試者是哺乳動(dòng)物如靈長(zhǎng)類(lèi)或人。具體地，所述術(shù)語(yǔ)是指被診斷患有癌癥的人。本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”、“進(jìn)行治療”等是指獲得所需的藥理學(xué)效果和/或生理學(xué)效果。所述效果可以是預(yù)防性的，即完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀，并且/或者可以是治療性的，即完全或部分治愈疾病和/或疾病所導(dǎo)致的不良影響。本文使用的“治療”涵蓋對(duì)受試者尤其是人的疾病的任何治療，包括:(a)預(yù)防所述疾病在受試者中發(fā)生，所述受試者可能易患所述疾病但尚未被診斷出患有所述疾??；(b)抑制所述疾病，即阻止其發(fā)展；和(c)緩解所述疾病，例如引起所述疾病的消退，例如以完全或部分地消除所述疾病的癥狀。I1.聚合物顆粒本發(fā)明的方法使用了促進(jìn)免疫應(yīng)答的組合物。在具體的實(shí)施方案中，所述組合物包括顆粒。在具體的實(shí)施方案中，所述顆粒是聚合物顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合顆粒是微米顆粒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚合顆粒是納米顆粒。形成顆粒、修飾顆粒的方法(例如封裝、附著或其他納入到顆粒上或內(nèi)的方法)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi) N0.2011/0038900、N0.2010/0104503、N0.2009/0269397 和N0.2011/0239789?？缮锝到饩酆衔锘蚍强缮锝到饩酆衔锟捎糜谛纬伤鲱w粒。在具體的實(shí)施方案中，所述微米顆粒由可生物降解聚合物形成。非可生物降解聚合物可用于口服給藥。在一些實(shí)施方案中，可使用合成聚合物，但可使用天然聚合物并且其可能具有同等的或甚至更好的性質(zhì)，尤其是可通過(guò)水解降解的一些天然生物聚合物，例如一些聚羥基烷酸酯。代表性合成聚合物包括但不限于聚(羥基酸)(如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-共-乙醇酸))、聚(丙交酯 )、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、聚酰胺、聚碳酸酯，、聚烯烴如聚乙烯和聚丙烯、聚亞烷基二醇如聚(乙醇)、聚環(huán)氧烷如聚(環(huán)氧乙烷)、聚亞烷基對(duì)苯二酸酯如聚(對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯鹵化物如聚(氯乙烯)、聚乙烯吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚(乙烯醇)、聚(乙酸乙烯酯)、聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯和其共聚物、衍生纖維素如烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝酸纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素，羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧乙基纖維素、三乙酸纖維素和纖維素硫酸鈉鹽(本文中統(tǒng)稱(chēng)為“合成纖維素”)、丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物或其共聚物或衍生物包括酯類(lèi)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(異丙基丙烯酸酯)、聚(異丁基丙烯酸酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)(本文統(tǒng)稱(chēng)為“聚丙烯酸類(lèi)”)、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-共-己內(nèi)酯)、環(huán)糊精以及其共聚物和共混物。本文所用術(shù)語(yǔ)“衍生物”包括具有化學(xué)基團(tuán)的置換、增加和本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)制備的其他修飾的聚合物。在具體的實(shí)施方案中，PLGA被用作可生物降解聚合物。可用于本發(fā)明的可生物降解聚合物的實(shí)例包括羥基酸如乳酸和乙醇酸的聚合物，以及與PEG、聚酐、聚(原)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內(nèi)酯)的共聚物，及其共聚物和共聚物。天然聚合物包括但不限于蛋白質(zhì)如白蛋白、膠原、明膠和谷醇溶蛋白如玉米醇溶蛋白、多糖類(lèi)如藻朊酸鹽、纖維素衍生物和聚羥基鏈烷酸酯如聚羥基丁酸酯。生產(chǎn)過(guò)程中，可通過(guò)使用聚合物如與聚乙二醇(PEG)共聚的聚(丙交酯-共-乙交酯)來(lái)調(diào)節(jié)顆粒的體內(nèi)穩(wěn)定性。由于PEG的疏水性，如果PEG被暴于外表面，那么這可以增加這些材料循環(huán)的時(shí)間。非可生物降解聚合物的實(shí)例包括乙烯乙酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺以及其共聚物和混合物。A.顆粒的修飾顆粒的外表面可通過(guò)將耦合劑或配體偶聯(lián)到所述顆粒的表面來(lái)修飾。在一些實(shí)施方案中，所述配體是免疫佐劑，該免疫佐劑被封裝在所述顆粒內(nèi)，或被納入到所述顆粒上或內(nèi)。免疫佐劑包括但不限于Toll樣受體(TLR)配體、C型凝集素受體配體、核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體(NLR)配體、維甲酸誘導(dǎo)型基因I(RIG)樣受體(RLR)配體和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)配體。在具體的實(shí)施方案中，所述耦合劑或配體以高密度存在于所述顆粒的表面上。本文所用的術(shù)語(yǔ)“高密度”是指具有高密度偶聯(lián)劑或配體的顆粒，特別是每平方微米顆粒表面積具有約1000至約10000000，更特別是約10000至約1000000個(gè)偶聯(lián)劑或配體。這可通過(guò)熒光染色溶解的顆粒并將所述熒光校準(zhǔn)為溶液中已知量的游離熒光分子進(jìn)行測(cè)量。可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)不同的分子附著于所述配體或偶聯(lián)劑例如靶分子、附著分子和/或治療的、營(yíng)養(yǎng)的、診斷的或預(yù)防疾病的藥劑，來(lái)進(jìn)一步修飾所述顆粒。靶分子是將所述顆粒指向至選定細(xì)胞或組織類(lèi)型的受體位點(diǎn)的物質(zhì)，可以充當(dāng)粘附分子，或用來(lái)偶聯(lián)或粘附另外的分子。本文所用的“指向”是指使分子優(yōu)先粘附到選擇的細(xì)胞或組織類(lèi)型。這可用于指向如下詳述的細(xì)胞材料、分子或藥物。

所述顆粒被設(shè)計(jì)用來(lái)經(jīng)數(shù)天或數(shù)周釋放封裝或粘附的分子。影響釋放持續(xù)時(shí)間的因素包括周?chē)橘|(zhì)的PH(因?yàn)樗岽呋腜LGA水解，在pH5和以下釋放速率更高)和聚合物組合物。通過(guò)改變所述顆粒的聚合物組成和形態(tài)，可有效調(diào)配多種受控釋放特性，使得在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)有適當(dāng)?shù)暮愣▌┝?。已有多種材料用于設(shè)計(jì)有或沒(méi)有表面功能的固體顆粒。參見(jiàn) Brigger et al., 54ADV.DRUG DELIV.REV.631-51 (2002)。也許最廣泛使用的材料是脂族聚酯，特別是疏水性聚(乳酸)(PLA)，更親水的聚(乙醇酸)(PGA)及它們的共聚物，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。這些聚合物的降解速率和相應(yīng)的藥物釋放速率，可從數(shù)天(PGA)到數(shù)月(PLA)變化，可通過(guò)改變PLA與PGA的比例容易地操作。PLGA和其同聚物PGA和PLA的生物相容性已被證實(shí)可在人中安全使用。這些材料在多種人臨床應(yīng)用包括給藥體系中已有超過(guò)30年的歷史。此外，PLGA顆?？杀慌渲瞥赏ㄟ^(guò)被動(dòng)或主動(dòng)祀向來(lái)改善藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和在靶組織的生物分布的多種形式。在具體的實(shí)施方案中，所述聚合物展示了持續(xù)約I至約30天的降解動(dòng)力學(xué)。B.顆粒的形成可使用不同的方法，從不同的聚合物制造顆粒。在溶劑蒸發(fā)法中，將聚合物溶解在揮發(fā)性有機(jī)溶劑如二氯甲烷中。將治療劑(可溶的或分散為細(xì)粒的)加入上述溶液，并將所述混合物懸浮在包含有表面活性劑如聚(乙烯醇)的水性溶液中。攪拌所得乳劑，直至大部分有機(jī)溶劑蒸發(fā)，留下固體顆粒。用水洗滌所得顆粒，并在冷凍干燥機(jī)內(nèi)過(guò)夜干燥。可以通過(guò)這種方法獲得不同尺寸(約0.5至約1000微米)和形態(tài)的顆粒。這種方法可用于相對(duì)穩(wěn)定的聚合物，如聚酯類(lèi)和聚苯乙烯。熱熔封裝法和溶劑去除法可用于不穩(wěn)定的聚合物，如在制造過(guò)程中由于水的存在而降解的聚酐。在熱熔封裝法中，先將聚合物融化，然后將其與固體顆?；旌?。將所述混合物懸浮在非混溶的溶液(如硅油)中，并一直攪拌加熱至聚合物熔點(diǎn)之上5°C。一旦所述乳劑穩(wěn)定后，將其冷卻直到聚合物顆粒固化。通過(guò)用石油醚傾析洗滌所得顆粒以得到自由流動(dòng)的粉末?？梢砸赃@種方法獲得尺寸在約0.5至約1000微米的顆粒。以這種技術(shù)制備的球體的外表面通常是光滑和致密的。這種方法用于制備由聚酯和聚酐制備的顆粒。然而，這個(gè)方法通常限于分子量在約1000至約50000的聚合物。溶劑去除技術(shù)主要被設(shè)計(jì)用于聚酐。在這個(gè)方法中，治療劑分散或溶解于所選的聚合物的有機(jī)溶液如二氯甲烷的溶液中。將這個(gè)混合物通過(guò)攪拌懸浮在有機(jī)油(如硅油)中以形成乳液。與溶劑蒸發(fā)不同，這個(gè)方法可用于由高熔點(diǎn)和不同分子量的聚合物制造的顆粒?？赏ㄟ^(guò)這種方法獲得直徑在約I至約300微米范圍內(nèi)的顆粒。這種技術(shù)產(chǎn)生的球體的外部形態(tài)高度取決于所使用的聚合物類(lèi)型。噴霧干燥是用于形成本發(fā)明顆粒的另一種方法。在這個(gè)方法中，將聚合物溶解于有機(jī)溶劑。將已知量的所述治療劑懸浮(難溶性藥物)或共溶解(可溶藥物)在所述聚合物溶液中。然后，噴霧干燥所述溶液或所述分散體。小型噴霧干燥器(Buchi)的常規(guī)處理參數(shù)如下:聚合物濃度=0.04g/mL，入口溫度=約24°C，出口溫度=13_15°C，吸氣設(shè)置=15，泵設(shè)置=IOmL/分鐘，噴霧流速=600Nl/hr，噴嘴直徑=0.5mm。可獲得范圍在約I至約10微米的顆粒，所述顆粒的形態(tài)取決于所用的聚合物的類(lèi)型。由凝膠型聚合物如藻酸鹽制造的顆?？赏ㄟ^(guò)傳統(tǒng)的離子膠凝技術(shù)產(chǎn)生。將聚合物先溶解于水性溶液中，與硫酸鋇或某些生物活性劑混合，然后用微滴成型設(shè)備擠出，所述微滴成型設(shè)備在一些情況下使用氮?dú)饬鱽?lái)中斷所述微滴。緩慢攪拌(約100-170RPM)的離子硬化浴鍋被放置在擠出設(shè)備下以捕獲所形成的微滴。將所述顆粒留在所述浴鍋中孵育二十至三十分鐘以使其有足夠的時(shí)間發(fā)生膠凝化。通過(guò)使用不同尺寸的擠壓機(jī)或改變氮?dú)饣蚓酆衔锶芤旱牧魉倏刂祁w粒尺寸?？赏ㄟ^(guò)將聚合物溶解在酸性溶液中并與三聚磷酸鹽交聯(lián)來(lái)制備殼聚糖顆粒。可以通過(guò)將聚合物溶解在酸性溶液中并以鉛離子沉淀顆粒來(lái)制備羧甲基纖維素(CMC)顆粒。在帶負(fù)電的聚合物(例如，藻酸鹽，CMC)的情況下，不同分子量的帶正電的配體(例如，聚賴(lài)氨酸、聚乙亞胺)可被離子地粘附。I1.與顆粒相連的分子在本發(fā)明中，向患者給藥促進(jìn)免疫應(yīng)答的組合物。所述組合物可包括本文所述的顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述顆粒的外表面被偶聯(lián)劑和/或配體包覆。所述配體可以是免疫佐劑。所述佐劑可以包埋在所述顆粒內(nèi)、與所述顆粒表面相連(例如，吸附或綴合(直接地或間接地)到所述顆粒表面)和/或以其他可能的方式與所述顆粒不同程度相連(例如，在液體懸浮液中與所 述顆?；旌?，在固體組合物中與所述顆?；旌?，例如與所述顆粒共凍干等)?？梢耘c所述顆粒相連的免疫佐劑的實(shí)例包括但不限于TLR配體、C型凝集素受體配體、NLR配體、RLR配體和RAGE配體。TLR配體可包括脂多糖(LPS)和其衍生物以及脂質(zhì)A和其衍生物，包括但不限于單磷酰質(zhì)脂A(MPL)、吡喃葡萄脂A、PET-脂質(zhì)A和3-0-desaCyl-4-單磷酰脂A。在具體的實(shí)施方案中，所述免疫佐劑是MPL。在另一實(shí)施方案中，所述免疫佐劑是LPS。TLR配體還可包括但不限于TLR3配體(例如，聚肌苷酸聚胞苷酸(聚(1: C))、TLR7配體(例如，咪喹莫特和瑞喹莫德)和TLR9配體。使用顆粒(其中一種或多種涂層藥劑或配體被所述顆粒封裝在內(nèi)或納入至所述顆粒上或內(nèi))在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。例如，所述包括聚合物顆粒的組合物可還包括一種或多種免疫佐劑，所述佐劑封裝在聚合物顆粒內(nèi)或被納入至聚合物顆粒上或內(nèi)。所述組合物可還包括一種或多種治療劑，所述治療劑封裝在聚合物顆粒內(nèi)或被納入至聚合物顆粒上或內(nèi)。在具體的實(shí)施方案中，TLR4配體和TLR7配體可以封裝在聚合物顆粒內(nèi)或被納入到聚合物顆粒上或內(nèi)。在更具體的實(shí)施方案中，MPL (TLR4配體)和R837 (TLR7配體)可以封裝在聚合物顆粒內(nèi)或被納入到聚合物顆粒上或內(nèi)。這類(lèi)顆粒也可包括治療劑，如抗原。參見(jiàn) Kasturi et al.，470NATURE 543-50(2011)。在另一些實(shí)施方案中，其他分子可封裝在所述顆粒內(nèi)或被納入到所述顆粒上或內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，治療劑可封裝在所述顆粒內(nèi)或被納入到所述顆粒上或內(nèi)。治療劑包括但不限于腫瘤抗原、CD4+T細(xì)胞表位、細(xì)胞因子、化學(xué)治療劑、放射性核素、小分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、光熱天線、小干擾RNA、單克隆抗體和免疫學(xué)危險(xiǎn)信號(hào)傳遞分子。在具體的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的組合物中可任選提供一種或多種抗原?？乖梢园裨谒黾{米顆粒內(nèi)、與所述納米顆粒表面相連(例如，吸附或綴合到所述納米顆粒表面)和/或以其他可能的方式與所述納米顆粒不同程度相連(例如，在液體懸液中與所述納米顆?；旌?，在固體組合物中與所述納米顆粒混合，例如與所述納米顆粒共凍干等)。可以有效量(例如，對(duì)本發(fā)明的治療、預(yù)防或診斷方法有效的量)提供每種抗原。本發(fā)明可用的抗原包括但不限于細(xì)菌抗原、病毒抗原、真菌抗原以及腫瘤抗原或癌抗原。本發(fā)明的組合物可以包括一種或多種腫瘤抗原或癌抗原。腫瘤抗原可以是，例如，含肽的腫瘤抗原，如多肽腫瘤抗原或糖蛋白腫瘤抗原。腫瘤抗原還可以是，例如，含糖的腫瘤抗原如糖脂腫瘤抗原或 神經(jīng)節(jié)苷脂腫瘤抗原。腫瘤抗原可以進(jìn)一步是，例如，表達(dá)含多肽的腫瘤抗原的含多核苷酸的腫瘤抗原，例如，RNA載體構(gòu)建體或DNA載體構(gòu)建體，如質(zhì)粒DNA。腫瘤抗原包括但不限于，(a)含多肽的腫瘤抗原，包括多肽(例如，其長(zhǎng)度范圍是從約8至約20個(gè)氨基酸，但此范圍之外的長(zhǎng)度也很常見(jiàn))、脂多肽和糖蛋白；(b)含糖的腫瘤抗原，包括多糖、粘蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂、糖脂和糖蛋白；和(C)表達(dá)抗原多肽的多核苷酸。此外，腫瘤抗原可以是(a)與癌細(xì)胞相關(guān)的全長(zhǎng)分子，(b)同系物和同系物的修飾形式，包括具有缺失、增加和/或替換部分的分子，(C)它們的片段，和(d)腫瘤細(xì)胞的提取物或裂解物?？梢蕴峁┲亟M形式的腫瘤抗原。腫瘤抗原包括，例如CD8+淋巴細(xì)胞識(shí)別的I類(lèi)限制性抗原或CD4+T淋巴細(xì)胞識(shí)別的II類(lèi)限制性抗原。許多腫瘤抗原在本領(lǐng)域是已知的，包括:(a)癌-睪丸抗原如NY-ES0_1、SSX2、SCP1以及 RAGE、BAGE、GAGE 和 MAGE 家族多肽，例如，GAGE-1、GAGE-2、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6和MAGE-12 (它們可用于例如論述黑色素瘤、肺腫瘤、頭頸腫瘤、NSCLC腫瘤、乳腺腫瘤、胃腸腫瘤和膀胱腫瘤)，(b)突變的抗原，例如，p53(與多種實(shí)體瘤，例如，結(jié)腸直腸癌、肺癌、頭頸癌相關(guān))、p21/Ras (與，例如，黑色素瘤、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌相關(guān))、CDK4(與，例如，黑色素瘤相關(guān))、MUM1 (與，例如黑色素瘤相關(guān))、胱天蛋白酶8 (與，例如頭頸癌相關(guān))、CIA0205(與，例如，膀胱癌相關(guān))、HLA-A2-R1701、^連環(huán)蛋白(與，例如，黑色素瘤相關(guān))、TCR(與，例如，T細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤相關(guān))、BCR-abl (與，例如，慢性髓細(xì)胞性白血病相關(guān))、磷酸丙糖異構(gòu)酶、KIA 0205、⑶C-27和LDLR-FUT。(c)過(guò)表達(dá)的抗原，例如，半乳凝素4 (與，例如，直腸結(jié)腸癌相關(guān))、半乳凝素9 (與，例如，霍奇金病相關(guān))、蛋白酶3 (與，例如，慢性髓細(xì)胞性白血病相關(guān))、WTl (與，例如，多種白血病相關(guān))、碳酸酐酶(與，例如，腎癌相關(guān))、醛縮酶A(與，例如，肺癌相關(guān))、PRAME(與，例如，黑色素瘤相關(guān))、HER_2/neu (與，例如，乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和卵巢癌相關(guān))、a -胎蛋白(與，例如，肝癌相關(guān))、KSA(與，例如，大腸癌相關(guān))、胃泌素(與，例如，胰腺癌和胃癌相關(guān))、端粒酶催化蛋白、MUC-1 (與，例如，乳腺癌和卵巢癌相關(guān))、G-250(與，例如，腎細(xì)胞癌相關(guān))、癌胚抗原(與，例如，乳腺癌，肺癌，及胃腸癌，如結(jié)腸直腸癌有關(guān))，(d)共同的抗原，例如，黑色素瘤-黑色素細(xì)胞分化抗原如MART-l/Melan A、gpl00、MClR、促黑色素細(xì)胞激素受體、酪氨酸酶，酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相關(guān)蛋白_2/TRP2(與，例如，黑色素瘤相關(guān))，
(e)前列腺相關(guān)抗原如PAP、PSA、PSMA,PSH-PU PSM-PU PSM-P2，與，例如，前列腺癌相關(guān)，
(f)免疫球蛋白獨(dú)特型(例如，與骨髓瘤和B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān))，和(g)其他腫瘤抗原，如多肽和含糖抗原，包括(i)糖蛋白，如唾液酸Tn和唾液酸Lex (與，例如，乳腺癌和結(jié)腸直腸癌相關(guān))，以及多種粘蛋白；糖蛋白可被偶聯(lián)到載體蛋白(例如，MUC-1可以偶聯(lián)到KLH)上；
(ii)脂多肽(例如，連接到脂質(zhì)部分的MUC-1) ；(iii)多糖(例如，Globo H合成己糖)，其可偶聯(lián)到載體蛋白(例如，KLH)上；(iv)神經(jīng)節(jié)苷脂如GM2、GMl2,⑶2、⑶3 (與，例如，腦癌，肺癌，黑色素瘤相關(guān))，其也可以耦合到載體蛋白(例如，KLH)上。其他腫瘤抗原包括pl5、Hom/Mel-40、H-ras、E2A-PRL、H4-RET、IGH-1GK、MYL-RAR、Epstein Barr病毒抗原、EBNA、人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原(包括E6和E7)、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、人T淋巴細(xì)胞病毒抗原、TSP-180、pl85erbB2、pl80erbB_3、c-met、mn-23Hl、TAG-72-4, CA 19-9, CA72-4、CAMl 7.U NuMa, K_ras、pl6、TAGE, PSCA、CT7、43-9F、5T4、791Tgp72、^ _HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15_3(CA27.29\BCAA)、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\KP1 、C0-029、FGF-5，Ga733 (EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7_Ag、M0V18、NB/70K、NY-C0-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90 (Mac-2 結(jié)合蛋白 \ 親環(huán)素 C(cyclophilinC)相關(guān)蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、TPS 等。依照本發(fā)明的包含多核苷酸的抗原通常包括編碼多肽癌抗原(如上文列出的那些)的多核苷酸。包含具體多核苷酸的抗原包括能在體內(nèi)表達(dá)多肽癌抗原的DNA或RNA構(gòu)建載體，例如質(zhì)粒載體(如PCMV)。腫瘤抗原可以衍生自，例如，突變或改變的細(xì)胞組分。在改變后，所述細(xì)胞組分不再發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能，因此細(xì)胞發(fā)生不受控制的生長(zhǎng)。改變的細(xì)胞組分的代表性實(shí)例包括ras、p53、Rb、Wilms'腫瘤基因編碼的改變蛋白質(zhì)、泛素、粘蛋白、DCC基因編碼的蛋白、APC基因編碼的蛋白和MCC基因編碼的蛋白，以及受體結(jié)構(gòu)或受體樣結(jié)構(gòu)如神經(jīng)膜、甲狀腺激素受體、血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)受體、胰島素受體、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體和集落刺激因子(CSF)受體。這些細(xì)胞組分以及其他細(xì)胞組分記載在如美國(guó)專(zhuān)利N0.5，693，522和其中引用的參考文獻(xiàn)中。細(xì)菌抗原和病毒抗原可與本發(fā)明的組合物綴合，用于治療癌癥。具體地，載體蛋白如CRM197、破傷風(fēng)類(lèi)毒素或鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗原可與本發(fā)明的化合物結(jié)合/綴合，用于治療癌癥。所述癌抗原組合療法與現(xiàn)有的治療法相比，可以顯示增強(qiáng)的療效和生物利用度。II1.減輕抗腫瘤免疫的抑制的藥劑本發(fā)明的方法還包括給予能減輕抗腫瘤免疫的抑制的藥劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥劑破壞或以另外抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述藥劑改變腫瘤微環(huán)境中抗原呈遞細(xì)胞的構(gòu)成，例如殺死髓樣來(lái)源的抑制細(xì)胞。能減輕抗腫瘤免疫的抑制的藥劑的實(shí)例包括但不限于烷化劑、類(lèi)固醇、核苷酸抑制藥物、化學(xué)治療藥物、單克隆抗體、毒素和炎性還原劑。更具體的實(shí)例包括但不限于環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、阿霉素、地尼白介素、diftitox、貝伐單抗和多西紫杉醇。在具體的實(shí)施方案中，所述藥劑是環(huán)磷酰胺(也稱(chēng)為Cy或Cytoxan)。這些藥劑可在所述顆粒組合物之前或之后給藥。IV.組織消融根據(jù)本發(fā)明，用于物理破壞癌細(xì)胞的多種方法可與給藥能夠減輕抗腫瘤免疫的抑制的藥劑和/或促進(jìn)或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的組合物相結(jié)合使用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“消融”、“進(jìn)行消融”和其衍生詞是指組織特別是癌性組織、癌性細(xì)胞或者腫瘤的實(shí)質(zhì)性改變。所述術(shù)語(yǔ)也適用于任何增生性增長(zhǎng)或癌前損害的改變，如發(fā)育不良痣、結(jié)腸息肉、纖維瘤、子宮肌瘤、傳染性軟疣、宮頸乳頭狀瘤或皮膚疣。在一些實(shí)施方案中，所述術(shù)語(yǔ)“消融”是指靶細(xì)胞如癌細(xì)胞的物理破壞。更具體地，所述術(shù)語(yǔ)可以指組織的直接壞死。在具體的實(shí)施方案中，任何消融方法可導(dǎo)致細(xì)胞/組織釋放促進(jìn)抗腫瘤免疫的腫瘤抗原和/或免疫學(xué)危險(xiǎn)信號(hào)，如高遷移率族蛋白-1 (HMGBl)、三磷酸腺苷(ATP)、熱休克蛋白(HSP)、S100蛋白，SAP130、RNA、雙鏈基因組DNA、透明質(zhì)酸 、雙糖鏈蛋白多糖糖、多功能蛋白聚糖、硫酸類(lèi)肝素、線粒體甲酰肽、線粒體DNA、脫水焦磷酸鈣晶體、￠-淀粉樣蛋白、膽固醇晶體、白介素(IL)-1a、IL-33、尿酸晶體或尿酸單鈉晶體。例如，冷凍消融——即冷凍細(xì)胞——會(huì)破壞細(xì)胞膜并釋放完整的腫瘤抗原，所述腫瘤抗原由抗原呈遞細(xì)胞捕獲，呈遞給腫瘤引流淋巴結(jié)中的抗腫瘤淋巴細(xì)胞。參見(jiàn)den Brok et al.，95BR.J.CANCER896-905 (2006)。涉及包覆有免疫佐劑的顆粒(例如，包覆MPL的顆粒)的某些實(shí)施方案可導(dǎo)致隨后腫瘤冷凍消融毒性降低，因?yàn)镸PL可“關(guān)閉”由內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)的釋放所誘導(dǎo)的炎性信號(hào)傳遞。因此，用于消融組織的方法可包括但不限于冷凍消融、熱消融、光聲消融、放射療法、化學(xué)療法、射頻消融、電穿孔、乙醇消融、高強(qiáng)度聚焦超聲、光動(dòng)力療法、單克隆抗體、免疫毒素等。用于醫(yī)療治療的腫瘤消融技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，包括如以下的治療方式:射頻(RF)、聚焦超聲如高強(qiáng)度的超聲波束、微波、激光、熱電加熱、使用直流電(DC)或交流電(AC)的電極傳統(tǒng)加熱方法以及應(yīng)用熱流體和冷療法(如冷凍手術(shù)，也稱(chēng)為冷凍療法或冷凍消融。冷凍消融的信息參見(jiàn)CSA Medical, Inc.(Baltimore,MD)(美國(guó)專(zhuān)利N0.7，255，693、N0.6,027,499 和 N0.6, 383181) ；Endocare, Inc./HealthTronics, Inc.(Austin, TX)(美國(guó)專(zhuān)利 N0.7，921，657、N0.7，621，889、N0.6，972，014、N0.6，936，045、N0.，6，544，176 和6，251，105 ;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi) N0.20110040297、N0.20110009854、N0.20100180607 和N0.20020087152)；以及 Galil Medical (Arden Hills, MN)(美國(guó)專(zhuān)利 N0.7，942，870、N0.7，850，682,N0.7，846，154,N0.7，625，369,N0.7，604，605,N0.7，479，139,N0.6，905，492和 N0.6，875，209 ;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi) N0.20110009748,N0.20100019918,N0.20100168567、N0.20100152722、N0.20090306639、N0.20090306638 和 N0.20080045934)。
不可逆電穿孔(IRE)是一種非熱消融技術(shù)，它可在不提高消融區(qū)域溫度的情況下誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。更具體地說(shuō)，IRE是一種這樣的技術(shù)，即向組織施加納秒到微秒范圍的電脈沖，以產(chǎn)生細(xì)胞壞死和不可逆的細(xì)胞膜通透。更準(zhǔn)確地說(shuō)，IRE治療這樣起作用，形成納米尺寸并導(dǎo)致內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞的細(xì)胞膜缺陷，而不損傷連接和支架結(jié)構(gòu)或組織。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi) N0.2007/0043345 和 N0.2006/0293731,以及國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi) W02005/06284A2。V.組合物制劑和給藥因此，本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方案涉及給予有效量的組合物，所述組合物包括減輕抗腫瘤免疫的抑制的藥劑(例如環(huán)磷酰胺、地尼白介素等)和本文所述的顆粒(例如，包覆有免疫佐劑并/或封裝有治療性藥劑的納米顆粒)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“有效的”是指足以實(shí)現(xiàn)所需的、所希望的或預(yù)期結(jié)果。更具體地，“有效量”或“治療有效量”可互換使用，是指本發(fā)明的組合物(例如，環(huán)磷酰胺和/或顆粒)單獨(dú)地或與其他治療劑組合地使用提供所需治療效果所必需的量，例如有效預(yù)防、緩解、治療或改善疾病的癥狀或延長(zhǎng)治療的受試者的生存期的量。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，所需的精確量在對(duì)于不同受試者有所不同，取決于受試者的年齡、健康情況、所治療病癥的嚴(yán)重性、給予的具體化合物和/或組合物等。任何個(gè)體病例的合適“治療有效量”可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)參照相關(guān)文本和文獻(xiàn)和/或通過(guò)使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。應(yīng)理解，提到的藥物組合物、它的制劑、給藥等，根據(jù)上下文，是指一種或多種能減輕抗腫瘤免疫的抑制的藥劑(例如，環(huán)磷酰胺、地尼白介素等)和本文所述的顆粒(例如，包覆有免疫佐劑并/或封裝有治療劑的納米顆粒)。本發(fā)明的組合物的是適于向受試者體內(nèi)給藥的生物相容形式。所述藥物組合物還包括可藥用載體。術(shù)語(yǔ)“可藥用的”是指由聯(lián)邦政府或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或者是美國(guó)藥典或其他公認(rèn)的藥典中列出可用于動(dòng)物(更特別是人)的。術(shù)語(yǔ)“載體”是指與cit-PAD4多肽一起給予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運(yùn)載體。這類(lèi)藥物載體可以是無(wú)菌液體，例如水和油一包括 石油、動(dòng)物油、植物油或源自合成的油(包括但不限于花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)。當(dāng)所述藥物組合物被口服時(shí)，可用水作為載體。當(dāng)所述藥物組合物被靜脈給藥時(shí)，可用鹽水和葡萄糖水溶液作為載體。鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可被用作可注射溶液的液體載體。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。所述藥物組合物還可包含少量的潤(rùn)濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。本發(fā)明的藥物組合物的形式可以是溶液、懸液、乳劑、緩釋制劑等。在具體的實(shí)施方案中，藥物組合物包括有效量的本發(fā)明的顆粒連同適合量的可藥用載體，以便于適合給予患者的形式。所述制劑應(yīng)適合給藥模式。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)任意具體的給藥途徑來(lái)給予，這些給藥途徑包括但不限于口服、腸胃外、皮下、肌肉、靜脈、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、舌下或鼻內(nèi)方式。大多數(shù)合適的途徑是靜脈注射，肌肉注射或皮下注射。在具體的實(shí)施方案中，所述組合物被給予靶區(qū)域處或附近，如瘤內(nèi)注射。通常，所述藥物組合物以通過(guò)常規(guī)測(cè)試確定的合適劑量單獨(dú)地或與其他治療劑一起使用，目的是獲得最佳療效，而使任何潛在毒性最小化。使用本發(fā)明的藥物組合物的劑量方案可根據(jù)多種因素來(lái)選擇，包括患者的類(lèi)型、物種、年齡、體重、性別、醫(yī)療條件；待治療病癥的嚴(yán)重性；給藥途徑；患者腎功能和肝功能；以及所施用的具體藥物組合物。普通的內(nèi)科醫(yī)生可以很容易地確定和開(kāi)具預(yù)防、對(duì)抗或阻止病癥發(fā)展所需的有效量的所述藥物組合物(以及可能存在的其他藥劑，包括治療劑)。在產(chǎn)生最大療效并具有最小毒性的范圍內(nèi)，實(shí)現(xiàn)治療方案濃度的最佳精度，可能需要基于所述藥物組合物對(duì)一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)的可用性的動(dòng)力學(xué)的方案。當(dāng)確定治療方案的最佳濃度時(shí)，可考慮藥物組合物的分布、平衡和清除。當(dāng)組合使用以實(shí)現(xiàn)所需的效果時(shí)，可調(diào)整本文公開(kāi)的藥物組合物的劑量。在另一方面，所述藥物組合物和多種治療劑的劑量可獨(dú)立地優(yōu)化并結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)協(xié)同的結(jié)果，其中病理比單獨(dú)使用兩種中的任一種均減少得多。特別地，所述藥物組合物的毒性和治療效果可以通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)步驟來(lái)確定，例如確定LD5tl (群的50%致死劑量)和ED5tl (群的50%治療有效劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)，它可表示為L(zhǎng)D5(i/ED5(i的比值。除了當(dāng)所述組合物的細(xì)胞毒性是所需的活性或治療結(jié)果時(shí)，呈現(xiàn)大的治療指數(shù)的藥物組合物是優(yōu)選的。雖然可以使用呈現(xiàn)毒性副作用的藥物組合物，但送遞體系可將這類(lèi)組合物靶向至受影響組織的部位，目的是使得對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損壞最小化，由此減小副作用。通常，本發(fā)明的藥物組合物可以以使效果最大化且使毒性最小化的方式給藥。獲自細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可用于配制用于人的劑量范圍。這類(lèi)組合物的劑量?jī)?yōu)選地在循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，該范圍包括毒性很小或沒(méi)有毒性的ED5tl。所述劑量可以在該范圍內(nèi)變化，取決于使用的劑量形式和使用的給藥途徑。對(duì)于本發(fā)明方法使用的任何組合物來(lái)說(shuō)，最初可從細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定估計(jì)治療有效劑量?？稍趧?dòng)物模型中配制劑量，以實(shí)現(xiàn)包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)定的IC5tl (實(shí)現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的所測(cè)試組合物濃度)的循環(huán)血藥濃度范圍。這類(lèi)信息可用于準(zhǔn)確確定人的有用劑量。例如，可通過(guò)高效液相色譜測(cè)量血漿中的水平。此外，本發(fā)明的組合物的給藥劑量可以使用藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)模型系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。例如，可選擇一種或多種劑量方案，并使用藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)模型來(lái)確定所述一種或多種劑量范圍的藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)譜。接來(lái)下，基于具體的藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)譜，選擇可達(dá)到所需藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)反應(yīng)的一種給藥劑量方案。參見(jiàn)W000/67776，其以引用的方式全文納入本文。 更具體地，所述藥物組合物可以以單個(gè)日劑量給藥，或總的日劑量可以每日分成二、三或四次給藥。在口服的情況下，所述組合物的日劑量可在很寬的范圍變化，每人每天從約0.1ng至約lOOOmg。所述范圍更具體是每天從約0.001ng/kg體重至10mg/kg體重,對(duì)于成人(約 60kg)，每天約 0.1-100 V- g,約 1.0-50 V- g 或約 1.0_20mg。所述藥物組合物的日劑量可在很寬的范圍變化，從約0.1ng至約IOOOmg/成人/天。對(duì)于口服，所述組合物可以片劑的形式提供，所述片劑含有從約0.1ng至約IOOOmg的所述組合物，或 0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,15.0、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550，600、650、700、800、900或IOOOmg的所述組合物，用于對(duì)癥調(diào)整待治療患者的劑量。所述藥物組合物的有效量的通常以每天約0.lng/kg體重至約20mg/kg體重的劑量水平提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述范圍是從每天約0.2ng/kg體重至約10mg/kg體重。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述范圍是從 每天約0.5ng/kg體重至約10mg/kg體重。所述藥物組合物可按每天約I至約10次的方案給藥。
在注射的情況下，通常方便的是通過(guò)靜脈途徑向成人(約60kg)給予每天約0.0001 u g_30mg、約0.01 u g-20mg或約0.0l-1Omg的量。在其他動(dòng)物的情況下，也可給予從60公斤計(jì)算的劑量。本發(fā)明藥物組合物的劑量可任選包括0.0001 ii g至1000mg/kg/給藥、0.001 U g至100.0mg/kg/給藥、0.01 ii g至10mg/kg/給藥、0.1 y g至10mg/kg/給藥，包括但不限于 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99和/或100_500mg/kg/給藥，或其任意范圍、值或部分，或達(dá)到以下血清濃度:0.1,0.5,0.9,1.0,1.1, 1.2,1.5,1.9,2.0,2.5,2.9,3.0,3.5,3.9,4.0,4.5,4.9,5.0, 5.5, 5.9,6.0,6.5,6.9, 7.0, 7.5, 7.9,8.0,8.5,8.9,9.0, 9.5, 9.9，10，10.5，10.9，11,11.5,11.9，20，12.5，12.9，13.0，13.5，13.9，14.0，14.5,4.9,5.0,5.5,5.9,6.0,6.5,6.9，7.0,7.5,7.9,8.0,8.5,8.9,9.0,9.5,9.9，10，10.5，10.9,11,11.5,11.9,12，12.5，12.9，13.0，13.5，13.9，14，14.5，15，15.5，15.9，16，16.5，16.9，17，17.5，17.9，18，18.5，18.9，19，19.5，19.9,20,20.5,20.9，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，96，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500,2000,2500,3000，3500，4000，4500和/或5000 y g/ml血清濃度/單次或多次給藥或其任意范圍、值或部分。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆?？梢约sIug至約Ig的劑量給藥。在其他實(shí)施方案中，環(huán)磷酰胺可以口服每天約50mg至靜脈給予每天約50mg/kg的劑量給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，在消融前，每天兩次口服約50mg環(huán)磷酰胺，持續(xù)約至少兩周。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，在消融前一天，靜脈給予約50mg/kg的環(huán)磷酰胺。作為非限制性實(shí)例，對(duì)受試者進(jìn)行治療可以使用單劑量、輸注劑量或重復(fù)劑量，在以下天的至少一天:1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39 或 40，并且 / 或者，在以下周的至少一周:1，2，3，4， 5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51 或 52，并且 / 或者，在以下年的至少一年:1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20年、或其任意組合,來(lái)提供如下一次性或周期劑量的本發(fā)明的組合物:0.1ng至IOOmg/kg，例如每天 0.1ng 到 100mg/kg 如 0.0001,0.001,0.01,0.10.5，0.9，1.0，1.1, 1.5,2,3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，45,50,60,70,80,90 或 100mg/kg。具體地，可每周至少一次給予本發(fā)明的藥物組合物，持續(xù)數(shù)周的時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方案中，每周至少一次給予所述藥物組合物，持續(xù)數(shù)周至數(shù)月。在另一實(shí)施方案中，每周一次給予所述藥物組合物，持續(xù)4到8周。在又一實(shí)施方案中，每周一次給予所述藥物組合物，持續(xù)4周。更具體地，可按如下方式給予所述藥物組合物:每天至少一次持續(xù)約2天，每天至少一次持續(xù)約3天,每天至少一次持續(xù)約4天,每天至少一次持續(xù)約5天,每天至少一次持續(xù)約6天,每天至少一次持續(xù)約7天,每天至少一次持續(xù)約8天,每天至少一次持續(xù)約9天,每天至少一次持續(xù)約10天，每天至少一次持續(xù)約11天，每天至少一次持續(xù)約12天,每天至少一次持續(xù)約13天,每天至少一次持續(xù)約14天,每天至少一次持續(xù)約15天,每天至少一次持續(xù)約16天,每天至少一次持續(xù)約17天,每天至少一次持續(xù)約18天,每天至少一次持續(xù)約19天,每天至少一次持續(xù)約20天,每天至少一次持續(xù)約21天,每天至少一次持續(xù)約22天,每天至少一次持續(xù)約23天,每天至少一次持續(xù)約24天,每天至少一次持續(xù)約25天,每天至少一次持續(xù)約26天,每天至少一次持續(xù)約27天,每天至少一次持續(xù)約28天,每天至少一次持續(xù)約29天,每天至少一次持續(xù)約30天,或每天至少一次持續(xù)約31天?；蛘撸砂慈缦路绞浇o予所述藥物化合物:約I天一次、約2天一次、約3天一次、約4天一次、約5天一次、約6天一次、約7天一次、約8天一次、約9天一次、約10天一次、約11天一次、約12天一次、約13天一次、約14天一次、約15天一次、約16天一次、約17天一次、約18天一次、約19天一次、約20天一次、約21天一次、約22天一次、約23天一次、約24天一次、約25天一次、約26天一次、約27天一次、約28天一次、約29天一次、約30天一次或約31天一次?；蛘?，可按如下方式給予本發(fā)明藥物組合物:約I周一次、約2周一次、約3周一次、約4周一次、約5周一次、約6周一次、約7周一次、約8周一次、約9周一次、約10周一次、約11周一次、約12周一次、約13周一次、約14周一次、約15周一次、約16周一次、約17周一次、約18周一次·、約19周一次、約20周一次?；蛘?，可按如下方式給予本發(fā)明藥物組合物:約I月一次、約2月一次、約3月一次、約4月一次、約5月一次、約6月一次、約7月一次、約8月一次、約9月一次、約10月一次、約11月一次或約12月一次?；蛘撸砂慈缦路绞浇o予本發(fā)明藥物組合物:每周至少一次持續(xù)約2周、每周至少一次持續(xù)約3周、每周至少一次持續(xù)約4周、每周至少一次持續(xù)約5周、每周至少一次持續(xù)約6周、每周至少一次持續(xù)約7周、每周至少一次持續(xù)約8周、每周至少一次持續(xù)約9周、每周至少一次持續(xù)約10周、每周至少一次持續(xù)約11周、每周至少一次持續(xù)約12周、每周至少一次持續(xù)約13周、每周至少一次持續(xù)約14周、每周至少一次持續(xù)約15周、每周至少一次持續(xù)約16周、每周至少一次持續(xù)約17周、每周至少一次持續(xù)約18周、每周至少一次持續(xù)約19周或每周至少一次持續(xù)約20周?；蛘?，可按如下方式給予本發(fā)明藥物組合物:每周至少一次持續(xù)約I月、每周至少一次持續(xù)約2月、每周至少一次持續(xù)約3月、每周至少一次持續(xù)約4月、每周至少一次持續(xù)約5月、每周至少一次持續(xù)約6月、每周至少一次持續(xù)約7月、每周至少一次持續(xù)約8月、每周至少一次持續(xù)約9約、每周至少一次持續(xù)約10月、每周至少一次持續(xù)約11月或每周至少一次持續(xù)約12月。對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員明顯的是，本發(fā)明的藥用組合物可以與一種或多種治療劑結(jié)合使用。尤其地，本發(fā)明的組合物和其他治療劑可以通過(guò)相同或不同的給藥途徑同時(shí)或依次給藥。確定本發(fā)明方法中使用的治療劑的種類(lèi)和量可以由普通醫(yī)生使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆?？梢耘c有效量的治療癌癥的第二治療劑結(jié)合給藥。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的顆?？梢耘c其他治療劑相結(jié)合，所述其他治療劑包括但不限于免疫調(diào)節(jié)劑、抗炎劑(例如，腎上腺類(lèi)皮質(zhì)激素、皮質(zhì)類(lèi)固醇(例如，倍氯米松、布地奈德、氟尼縮松、氟替卡松、去炎松、甲基強(qiáng)地松龍、波尼松龍、強(qiáng)的松、氫化可的松)、糖皮質(zhì)激素、類(lèi)固醇和非類(lèi)固醇抗炎藥(例如，阿司匹林、布洛芬、雙氯芬酸和C0X-2抑制藥)和白三烯拮抗物(例如，孟魯司特、甲基黃嘌呤、扎魯司特和齊留通)；P 2-受體激動(dòng)藥(例如，沙丁胺醇、biterol、非諾特羅、isoetharie、奧西那林、批布特羅、沙丁胺醇、特布他林福莫特羅、沙美特羅和沙丁胺醇特布他林)；抗膽堿能劑(如異丙托溴銨和氧托溴銨)、柳氮磺胺吡啶、青霉胺、氨苯砜、抗組胺劑、抗瘧疾劑(例如，羥化氯喹)；抗病毒劑；以及抗生素(如放線菌素D(以前稱(chēng)為放線菌素)、博來(lái)霉素、紅霉素、盤(pán)尼西林、光神霉素和氨茴霉素(AMC))。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物與第二治療劑結(jié)合可按如下方式給藥:間隔小于5分鐘、間隔小于30分鐘、間隔I小時(shí)、間隔約I小時(shí)、間隔約I至約2小時(shí)、間隔約2小時(shí)至約3小時(shí)、間隔約3小時(shí)至約4小時(shí)、間隔約4小時(shí)至約5小時(shí)、間隔約5小時(shí)至約6小時(shí)、間隔約6小時(shí)至約7小時(shí)、間隔約7小時(shí)至約8小時(shí)、間隔約8小時(shí)至約9小時(shí)、間隔約9小時(shí)至約10小時(shí)、間隔約10小時(shí)至約11小時(shí)、間隔約11小時(shí)至約12小時(shí)、間隔約12小時(shí)至18小時(shí)、間隔18小時(shí)至24小時(shí)、間隔24小時(shí)至36小時(shí)、間隔36小時(shí)至48小時(shí)、間隔48小時(shí)至52小時(shí)、間隔52小時(shí)至60小時(shí)、間隔60小時(shí)至72小時(shí)、間隔72小時(shí)至84小時(shí)、間隔84小時(shí)至96小時(shí)或間隔96小時(shí)至120小時(shí)。在具體的實(shí)施方案中，兩種或多種治療物在一次患者就診中給藥。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的顆粒與一種或多種其他治療物循環(huán)地給藥。循環(huán)療法包括給予第一治療物(例如，本發(fā)明的顆粒)等待一段時(shí)間，接著給予第二治療物(例如，另一治療劑)等待一段時(shí)間，任選接著給予第三治療物等待一段時(shí)間，等待，重復(fù)該順序給藥，例如循環(huán)，目的是減少對(duì)其中一種治療物的抗性發(fā)生、避免或減少其中一種治療物的副作用和/或改善這些治療物的效力。在一些實(shí)施方案中，可以重復(fù)給予本發(fā)明的結(jié)合治療物，并且所述給藥可以間隔至少I(mǎi)天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個(gè)月、75天、3個(gè)月或至少6個(gè)月。在沒(méi)有進(jìn)一步闡述的情況下，應(yīng)認(rèn)為，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用先前的描述可最大程度地利用本發(fā)明。下面的 實(shí)施例僅是說(shuō)明性的，而不以任何方式限制本公開(kāi)的其余部分。實(shí)施例提出下面的實(shí)施例是為了便于向本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和評(píng)估本文所描述和要求保護(hù)的化合物、組合物、物品、設(shè)備和/或方法的完整披露和說(shuō)明，旨在純粹地進(jìn)行說(shuō)明，而并非旨在限制本發(fā)明人認(rèn)為的發(fā)明范圍。已努力確保數(shù)值(例如，數(shù)量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但本文也可能存在一些錯(cuò)誤和偏差。除非另有說(shuō)明，份是重量份，溫度是攝氏度或在環(huán)境溫度下，壓力為在大氣壓下或接近大氣壓。有眾多反應(yīng)條件的改變和組合，例如組分濃度、所需溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力和其他反應(yīng)范圍和條件，這些范圍和條件可被用于優(yōu)化從所述方法得到的產(chǎn)物純度和收率。僅需要合理的和常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)優(yōu)化這些方法條件。材料和方法納米顆粒構(gòu)建。固有粘度為0.59dL/g 的 50: 50PLGA購(gòu)自 Lactel Polymers, Inc.(Pelham，AL，USA)。聚乙烯醇(PVA)(平均分子量 30_70kD)和 LPS (大腸桿菌(Escherichiacoli)株 0111:B4)獲自 Sigma-Aldricho 色譜級(jí)二氯甲燒由 Fisher Scientific 提供。
LPS修飾的可牛物降解納米顆粒的制備。將改良的水包油包水(W/0/W)乳劑法用于制備LPS修飾的PLGA顆粒。第一乳劑可以用于將分子如腫瘤抗原、用于CD4+T細(xì)胞的抗原、細(xì)胞因子、危險(xiǎn)分子、藥物、放射性核素或小分子封裝到所述納米顆粒的核心中。為了將抗原納入所述第一乳劑(W/0)中的納米顆粒內(nèi)，將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的超濃縮抗原(20-100mg/ml)逐滴加入到渦旋的溶解于二氯甲烷中PLGA溶液中(2ml)。然后，將聚合物和密封劑逐滴加入至第二乳劑中5%的PVA(W/0/W)中。得到各乳劑后，使用裝配有CV26型
超聲破碎儀的Tekmar Sonic Distributor-振幅設(shè)為38%,將樣品在冰上超聲處理30
秒。將第二乳劑快速加至0.3% PVA中。將這個(gè)外部相在恒定室溫下劇烈攪拌3小時(shí)，以揮發(fā)二氯甲烷。將LPS(在去離子(DI)水中20mg/ml)加入至含有5% PVA的第二乳劑中來(lái)制備LPS修飾的顆粒。在12000rpm下離心15分鐘收集顆粒，將所述顆粒用DI水洗滌三次。將所述顆粒冷凍干燥，并儲(chǔ)存于-20°C備用。納米顆粒在-20°C可穩(wěn)定數(shù)年。圖1A示出LPS修飾的、封裝有抗原的納米顆粒示意圖。圖1B示出按上述制備的納米顆粒的掃描電子顯微照片。納米顆粒的瘤內(nèi)給藥。將所述納米顆粒從冰箱中取出，稱(chēng)重，然后懸浮在IXPBS中至濃度lmg/ml。將所述顆粒用移液管懸浮約I分鐘。一旦與PBS混合，保存于4°C的納米顆?？墒褂瞄L(zhǎng)達(dá)12小時(shí)。如果保存時(shí)間超過(guò)12小時(shí)，不應(yīng)再使用PBS中的所述顆粒。用浴鍋超聲波破碎儀輕微超聲或輕微渦旋所述顆粒，以制備均勻的懸液。不能將所述顆粒置于注射器中而不聞不問(wèn)，因?yàn)樗鼈儠?huì)沉降，然后堵塞注射器。在理想的情況下，應(yīng)該在將充分混合的納米顆粒懸液抽入注射器后的10-30秒內(nèi)完成注射。對(duì)于具有直徑5-8_的腫瘤的小鼠，將體積0.1ml的IOOmg顆粒直接注入至腫瘤內(nèi)。實(shí)施例1:小鼠中轉(zhuǎn)移癌的免疫治療假設(shè)腫瘤冷凍消融可釋放可促進(jìn)抗腫瘤免疫的腫瘤抗原和免疫學(xué)危險(xiǎn)信號(hào)如HMGBl和ATP。進(jìn)一步假設(shè)本發(fā)明的顆粒能夠在腫瘤抗原呈遞時(shí)增強(qiáng)冷凍免疫治療的免疫原性。 10只BALB小鼠的組，其中每只小鼠接受從側(cè)面皮下接種IO4個(gè)高轉(zhuǎn)移性、同系乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞。從第14天開(kāi)始，當(dāng)注射部位出現(xiàn)3-5mm的腫瘤結(jié)節(jié)時(shí)，在第14天以腹膜內(nèi)注射200mg/kg環(huán)磷酰胺處理小鼠,在第15天瘤內(nèi)注射LPS修飾的納米顆粒(lOOy g/小鼠)，并在第16天切除或冷凍消融所述腫瘤。參見(jiàn)圖2。圖3A示出，環(huán)磷酰胺(Cy或cytoxan)不能引發(fā)冷凍消融的全身性抗腫瘤效果，因?yàn)橛肅y加冷凍消融進(jìn)行治療的動(dòng)物沒(méi)有比用Cy加手術(shù)切除皮下結(jié)節(jié)進(jìn)行治療的動(dòng)物顯著地存活更長(zhǎng)的時(shí)間。相反，用Cy、納米顆粒和冷凍消融治療的帶腫瘤小鼠的存活顯著長(zhǎng)于用Cy、納米顆粒和外科切除術(shù)治療的帶腫瘤的小鼠(圖B ;p = 0.002)。該結(jié)果顯現(xiàn)了一種可能性，即4T1腫瘤的冷凍消融可釋放腫瘤抗原，但并沒(méi)有釋放足夠的危險(xiǎn)信號(hào)來(lái)刺激抗腫瘤免疫，但該缺陷可以通過(guò)在冷凍消融前注射納米顆粒來(lái)克服?？傊@些結(jié)果表明，納米顆粒提供了佐劑效應(yīng)來(lái)刺激抗局部腫瘤冷凍消融釋放的腫瘤抗原的免疫，并導(dǎo)致了具有轉(zhuǎn)移癌的動(dòng)物的生存期的延長(zhǎng)。實(shí)施例2 (預(yù)言性的):患者前列腺癌的免疫治療專(zhuān)利的腫瘤抗原如Dendreon的前列腺酸性磷酸酶-GM-CSF融合蛋白被封裝在LPS修飾的納米顆粒中。局部腫瘤臨消融前，將所述含有腫瘤抗原的納米顆粒注入至前列腺腫瘤癌床內(nèi)。這種治療可應(yīng)用于剛診斷出患有前列腺癌、最終放射療法后局部復(fù)發(fā)的前列腺癌或轉(zhuǎn)移性前列腺癌的患者。可用間歇性皮下注射Sipuleucel-T( Provenge (Dendreon Corp., Seattle,WA))加強(qiáng)針對(duì)冷凍免疫治療的免疫應(yīng)答。在冷凍消融前，可將患者以每日口服50mg環(huán)磷酰胺持續(xù)兩周進(jìn)行處理，以耗盡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。實(shí)施例3 (預(yù)言性的):患者乳腺癌的免疫治療通過(guò)將Her2/neu表位封裝于LPS修飾的納米顆粒內(nèi)、在冷凍消融前注射所述納米顆粒并用Lapuleucel-T (Dendreon Corp., Seattle, WA)進(jìn)行加強(qiáng)，實(shí)施例2中描述的方法可以施用于具有乳腺癌的患者。實(shí)施例4 (預(yù)言性的):患者腎癌的免疫治療通過(guò)將碳酸酐酶9封裝至LPS修飾的納米顆粒內(nèi)(用于腎細(xì)胞癌的冷凍免疫治療)，實(shí)施例2描述的方法可以施用于患有腎癌的患者。實(shí)施例5:患者癌癥的免疫治療將來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的免疫顯性pp65蛋白的重疊十五肽庫(kù)封裝于LPS修飾的納米顆粒中，并在臨冷凍消融前，將其注射入CMV血清陽(yáng)性個(gè)體的腫瘤中。這個(gè)策略將CMV特異性CD4+T細(xì)胞吸引至消融過(guò)的腫瘤部位或至腫瘤引流淋巴結(jié)，在這些部位細(xì)胞可幫助腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的持續(xù)激活?；蛘?，可向癌癥患者接種含CD4+T細(xì)胞表位的抗原。在接種兩周后(以允許產(chǎn)生抗原特異性記憶⑶4+T細(xì)胞)和臨冷凍消融之前，所述患者接受瘤內(nèi)注射含有抗原或抗原內(nèi)CD4+T細(xì)胞表位的LPS修飾的納米顆粒。這個(gè)策略也會(huì)將記憶CD4+T輔助細(xì)胞吸引至⑶8+T細(xì)胞遇到腫瘤抗原的部位。

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權(quán)利要求
1.一種用于在患者中治療癌癥的方法，包括步驟: a.在癌癥部位或其附近給予有效量的組合物，所述組合物促進(jìn)針對(duì)所述癌癥的治療性免疫應(yīng)答，和 b.消融所述癌癥。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括在給予所述組合物之前或之后，向所述患者給予有效量的減輕抗腫瘤免疫的抑制的藥劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述藥劑選自烷化劑、類(lèi)固醇、核苷酸抑制藥物、化學(xué)治療藥物、單克隆抗體、毒素和炎性還原劑。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述藥劑選自環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、阿霉素、地尼白介素、地尼白介素2 (diftitox)、貝伐單抗和多烯紫衫醇。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物包括(a)聚合物顆粒；和(b)任選的一種或多種治療劑，所述治療劑封裝在所述聚合物顆粒內(nèi)或被納入至所述聚合物顆粒上或內(nèi)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述聚合物顆粒包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)或其共聚物。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述聚合物顆粒是PLGA。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述組合物還包括一種或多種免疫佐劑，所述佐劑封裝在所述聚合物顆粒內(nèi)或被納入至所述聚合物顆粒上或內(nèi)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫佐劑是Toll樣受體(TLR)配體。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫佐劑是C型凝集素受體配體。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫佐劑是核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體配體。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫佐劑是維甲酸誘導(dǎo)基因I(RIG)樣受體(RLR)配體。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫佐劑是晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)配體。
14.權(quán)利要求9的方法，其中所述免疫佐劑是單磷脂A(MPL)。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所述免疫佐劑是脂多糖(LPS)。
16.權(quán)利要求8的方法，其中所述免疫佐劑選自LPS或其衍生物、CpG寡核苷酸、TLR3配體、TLR7配體、TLR9配體、MPL配體和RC529。
17.權(quán)利要求5的方法，其中所述一種或多種治療劑是癌抗原。
18.權(quán)利要求5的方法，其中所述一種或多種治療劑選自腫瘤抗原、CD4+T細(xì)胞表位、細(xì)胞因子、化學(xué)治療齊IJ、放射性核素、小分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、光熱天線、小干擾RNA、單克隆抗體和免疫學(xué)危險(xiǎn)信號(hào)傳遞分子。
19.權(quán)利要求5的方法，其中所述治療劑是Sipuleucel-T。
20.權(quán)利要求5的方法，其中所述治療劑是碳酸酐酶IX。
21.權(quán)利要求5的方法，其中所述治療劑是癌胚抗原。
22.權(quán)利要求1的方法，其中消融所述癌癥的步驟通過(guò)選自以下的方式實(shí)現(xiàn):冷凍消融、熱消融、放射療法、化學(xué)療法、射頻消融、電穿孔、乙醇消融、高強(qiáng)度聚焦超聲、光動(dòng)力療法、單克隆抗體和免疫毒素。
23.權(quán)利要求1的方法，其中消融所述癌癥的步驟通過(guò)冷凍消融完成。
24.一種用于在患者中治療異常細(xì)胞增殖的方法，包括步驟:a.在異常細(xì)胞增殖部位或其附近給予有效量的促進(jìn)針對(duì)所述異常細(xì)胞增殖的治療性免疫應(yīng)答組合物，所述組合物包括(i)聚合物顆粒；和(ii)任選的一種或多種治療劑，所述治療劑封裝在所述聚合物顆粒內(nèi)或被納入至所述顆粒上或內(nèi)； b.消融所述異常細(xì)胞增殖。
25.權(quán)利要求24的方法，還包括在給予所述組合物之前或之后，向所述患者給予有效量的減輕抗腫瘤免疫的抑制的藥劑。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述藥劑選自烷化劑、類(lèi)固醇、核苷酸抑制藥物、化學(xué)治療藥物、單克隆抗體、毒素和炎性還原劑。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述藥劑選自環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、阿霉素、地尼白介素、地尼白介素2 (diftitox)、貝伐單抗和多烯紫衫醇。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述聚合物顆粒包括PLA、PGA、PLGA或其共聚物。
29.權(quán)利要求24的方法，其中所述聚合物顆粒是PLGA。
30.權(quán)利要求24的方法，其中所述組合物還包括一種或多種免疫佐劑，所述佐劑封裝在所述聚合物顆粒內(nèi)或被納入至所述聚合物顆粒上或內(nèi)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述免疫佐劑是TLR配體。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述免疫佐劑是C型凝集素受體配體。
33.權(quán)利要求30的方法，其 中所述免疫佐劑是NOD樣受體配體。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述免疫佐劑是RLR配體。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所述免疫佐劑是RAGE配體。
36.權(quán)利要求31的方法，其中所述免疫佐劑是單磷脂A(MPL)。
37.權(quán)利要求31的方法，其中所述免疫佐劑是脂多糖(LPS)。
38.權(quán)利要求30的方法，其中所述免疫佐劑選自LPS或其衍生物、CpG寡核苷酸、TLR3配體、TLR7配體、TLR9配體、MPL配體和RC529。
39.權(quán)利要求24的方法，其中所述一種或多種治療劑是由異常增殖細(xì)胞優(yōu)先表達(dá)的抗原。
40.權(quán)利要求24的方法，其中所述一種或多種治療劑是癌抗原。
41.權(quán)利要求24的方法，其中所述一種或多種治療劑選自腫瘤抗原、CD4+T細(xì)胞表位、細(xì)胞因子、化學(xué)治療劑、放射性核素、小分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、光熱天線、小干擾RNA、單克隆抗體，和免疫學(xué)危險(xiǎn)信號(hào)傳遞分子。
42.權(quán)利要求24的方法，其中所述治療劑是Sipuleucel-T。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述異常細(xì)胞增殖是前列腺癌。
44.權(quán)利要求24的方法，其中所述治療劑是碳酸酐酶-1X。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述異常細(xì)胞增殖是腎癌、結(jié)腸癌或?qū)m頸癌。
46.權(quán)利要求24的方法，其中所述治療劑是癌胚抗原。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述異常細(xì)胞增殖是乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌。
48.權(quán)利要求24的方法，其中消融所述癌癥的步驟通過(guò)選自以下的方式實(shí)現(xiàn):冷凍消融、熱消融、放射療法、化學(xué)療法、射頻消融、電穿孔、乙醇消融、高強(qiáng)度聚焦超聲、光動(dòng)力療法、單克隆抗體和免疫毒素。
49.權(quán)利要求24的方法，其中消融所述癌癥的步驟通過(guò)冷凍消融完成。
50.一種用于在患者中治療實(shí)體瘤的方法，包括以下步驟: a.向所述患者給予有效量的藥劑,所述藥劑減輕對(duì)抗腫瘤免疫的抑制； b.在腫瘤部位或其附近給予有效量的組合物,所述組合物包括(i)聚合物納米顆粒；(ii)TLR配體、C型凝集素受體配體、NOD樣受體配體、RLR配體和/或RAGE配體中的一種或多種，所述配體封裝在所述納米顆粒內(nèi)或被納入至所述納米顆粒上或內(nèi)一種或多種封裝在納米顆粒內(nèi)的腫瘤抗原； c.對(duì)所述實(shí)體瘤實(shí)施冷凍消融。
51.一種用于在患者中治療實(shí)體瘤的方法，包括以下步驟: a.在腫瘤部位或其附近給予有效量的組合物,所述組合物包括(i)聚合物納米顆粒；(ii)TLR配體、C型凝集素受體配體、NOD樣受體配體、RLR配體和/或RAGE配體中的一種或多種，所述配體封裝在所述納米顆粒內(nèi)或被納入至納米顆粒上或內(nèi)一種或多種封裝在納米顆粒內(nèi)的腫瘤抗原； b.消融所述實(shí)體瘤。
52.一種用于在患者中治療癌癥的方法，包括以下步驟: a.向所述患者給予有效量的環(huán)磷酰胺； b.在腫瘤部位或其附近給予有效量的組合物,所述組合物包括(i)包含PLGA的納米顆粒；(ii)被納入到納米顆粒上的MPL ;和(iii) 一種或多種封裝在所述納米顆粒內(nèi)的腫瘤抗原；和` c.消融所述癌癥。
全文摘要
本發(fā)明總體而言涉及癌癥領(lǐng)域和用于癌癥免疫治療的方法和組合物的領(lǐng)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，一種用于在患者中治療癌癥的方法包括步驟(a)在癌癥部位或其附近給予有效量的組合物，所述組合物促進(jìn)針對(duì)所述癌癥的治療性免疫應(yīng)答，和(b)消融所述癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種用于在患者中治療異常細(xì)胞增殖的方法包括步驟(a)在異常細(xì)胞增殖部位或其附近給予有效量的促進(jìn)針對(duì)所述異常細(xì)胞增殖的治療性免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物包括(i)聚合物顆粒；和(ii)任選的一種或多種治療劑，所述治療劑封裝在所述聚合物顆粒內(nèi)或被納入至所述顆粒上或內(nèi)；和(b)消融所述異常細(xì)胞增殖。
文檔編號(hào)A61K31/56GK103118678SQ201180044693
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者E·J·富克斯, T·M·法赫米 申請(qǐng)人:約翰斯·霍普金斯大學(xué), 耶魯大學(xué)