專利名稱：重組人Prx-6蛋白在治療角膜損傷方面的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術和醫(yī)學領域，具體地說，涉及重組人Prx-6蛋白在治療角膜損傷方面的用途。
背景技術：
眼睛是對紫外輻射最為敏感的部位。研究表明，波長230nm的紫外線可全部為角膜上皮吸收，280nm的紫外線對角膜損傷力最大。紫外線被角膜上皮細胞吸收后,會產生大量的氧自由基，發(fā)生脂質過氧化作用，引起細胞死亡，細胞溶解脫落后會釋放大量炎癥刺激 因子，一般在暴露后6 10小時出現(xiàn)迅即加重的異物刺痛感和隨之而來的畏光、流淚等癥狀，嚴重的會發(fā)生角膜上皮水腫、脫落、透明度下降等。在紫外線輻射較強的地區(qū)，上述影響十分明顯。如在陽光照耀的海面上或沙漠中長期了望的士兵、海員，常有暗適應能力下降的現(xiàn)象出現(xiàn)；在空氣稀薄的雪山高原上，工作人員因受雪面強烈反射的紫外反射的損傷，易患雪盲癥；人們在雪地、沙漠或海面上暴露時間過長，因受紫外輻射影響較強，易患日光性眼炎；焊工直接暴露在電弧光下每天累計15分鐘，即可發(fā)生上述病癥,稱為電光性眼炎。目前治療主要為對癥、全身用止痛鎮(zhèn)靜藥物，冷敷眼瞼，包扎遮光，嚴重者可在結膜囊內滴入少量局部麻醉藥0.5%地卡因，并用抗生素眼藥水預防繼發(fā)感染。大多都沒有針對角膜上皮細胞損傷的修復、清除自由基等治療措施。Peroxiredoxins (Prxs)是新近發(fā)現(xiàn)的一類非硒依賴過氧化物酶家族蛋白，廣泛存在于各種生物體內。根據(jù)Prxs蛋白保守cys個數(shù)的不同(I個或2個)，可分為I-Cys或2-Cys亞類。迄今，已在哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)了 6種Prxs蛋白。其中Prx 1_5為2_Cys酶，以硫氧還蛋白作為電子供體；Prx-6蛋白是哺乳動物中唯一的I-Cys酶，以谷胱苷肽(GSH)為電子供體(還原劑)。Prx-6蛋白首先是在牛眼睫狀體中被分離獲得的，又名LTW4、抗氧化蛋白2、Clara細胞蛋白26、p67吞噬細胞氧化酶(phox)結合蛋白、角質化細胞生長因子(KGF)調節(jié)基因I等，由224個氨基酸組成，分子量為25. IKDa0分析該蛋白的晶體結構，發(fā)現(xiàn)了一個由80個氨基酸組成的硫氧還蛋白折疊，其中包含四個3折疊和兩個a螺旋。大量研究表明，硫氧還蛋白折疊結構在一些參與氧化還原反應的蛋白(如硫氧還蛋白、谷氧還蛋白、GPxl蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶等)中普遍存在。另外，盡管Prx-6和GPxl蛋白的一級結構只有17%的同源性，但是它們的三級結構具有極高的同源性。這種結構上的相似性，預示著這兩種蛋白在功能上的相關。從初期細胞實驗到近年來動物體內實驗，越來越多的研究證明了 Prx-6蛋白具有抗氧化損傷功能。細胞水平的研究表明，過表達Prx-6蛋白能明顯減少脂質過氧化作用，降低細胞質膜損傷；抑制Prx-6蛋白的表達，可觀察到明顯的脂質過氧化、脂膜損傷及細胞凋亡?；铙w水平研究表明，Prx-6轉基因小鼠對高氧損傷有顯著的保護作用；Prx-6敲除小鼠的抗氧化損傷能力明顯降低。我們在研究人類精子成熟時，發(fā)現(xiàn)Prx-6蛋白由人附睪分泌到附睪管腔液中，能夠結合在精子赤道、頂體后和主段(編號為HEL-S-128m，已注冊于國際人類組織基因庫GenBank,登錄號EU794652)，具有較強的保護精子細胞抗過氧化損傷的功能，論文發(fā)表在美國雜志 Mol Cell Proteomics. 2010. 9(11) : 2517-2528。
鑒于Prx-6自身的生物學特性，我們將其用于燒燙傷的治療，取得了良好的療效，并已申請專利(申請?zhí)?01010573594. 7)。我們推測Prx_6在治療其他與氧化損傷相關的疾病中也有重要的作用。以往的研究主要是關于Prx-6蛋白在心臟、肺或皮膚組織中的抗氧化損傷作用，并未涉及到Prx-6蛋白在治療角膜損傷方面的用途。據(jù)對青藏高原武警官兵眼晶狀體混濁度調查顯示，駐拉薩市武警官兵(年齡25歲 以上的志愿兵、機關和基層干部)，眼晶狀體混濁發(fā)病率高達39. 56%，并且發(fā)病率與被調查者進藏的時間增長成正比。可見紫外線對我軍官兵的眼睛健康造成了嚴重的威脅(http://www. ynnw. gov. cn/Modules/Document/infoShowl. aspx kid=80375)。但目前還沒有理想有效的治療藥物，為此我們根據(jù)Prx-6蛋白的功能，首次進行了保護和治療紫外線損傷眼睛的治療性研究，獲得了顯著療效。綜上所述，本中心首次將Prx-6蛋白用于治療紫外線造成的角膜損傷并取得了良好療效，填補了針對角膜損傷病因的治療藥物空白。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供重組人Prx-6蛋白在治療角膜損傷方面的應用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種Prx-6蛋白在制備治療角膜損傷的藥物中的用途。在另一優(yōu)選例中,所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的Prx-6蛋白是重組蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的Prx-6蛋白包括氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的蛋白或其與表達標簽(如6XHis)形成的融合蛋白。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于治療角膜損傷的藥物組合物，所述的藥物組合物含有Prx-6蛋白以及藥學上可接受的載體，并且所述的藥物組合物為眼用制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的Prx-6蛋白是重組蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的眼用制劑是滴眼液、眼用凝膠或眼膏。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種治療角膜損傷的方法，包括步驟對需要治療的對象，將Prx-6蛋白或本發(fā)明第二方面中所述的藥物組合物滴入或涂入結膜囊內。在另一優(yōu)選例中，所述的治療包括抑制角膜新生血管的生成；修復受損的角膜上皮細胞；減輕角膜水腫，恢復角膜透明度及視力；清除自由基抗氧化，促進炎癥病變組織恢復。在另一優(yōu)選例中，所述的對象是哺乳動物(包括人)。在另一優(yōu)選例中，所述的施用包括滴入或涂入。
應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再
累述。


圖I顯示了 Prx-6基因PCR擴增結果。泳道I :空白對照；泳道2 Prx-6 ; M 分子量標準品。圖2顯示了 Prx-6蛋白親和純化色譜圖。峰I :雜蛋白；峰2 Prx-6目的蛋白。
圖3顯示了 Prx-6蛋白純化電泳圖(12%SDS_PAGE)。泳道I :蛋白分子量標準品 (Fermentas);泳道2 :親和層析純化并脫鹽后的Prx_6蛋白；泳道3 :峰I ;泳道4 :上樣穿出蛋白；泳道5 :破菌上清(上樣的樣品)。圖4顯示了重組Prx-6蛋白對HEF細胞的抗氧化保護作用(P〈0. 05)。圖5顯示了重組Prx-6蛋白對H9C2細胞的抗氧化保護作用(P〈0. 05)。圖6顯示了用裂隙燈顯微鏡觀察重組Prx-6蛋白治療大鼠角膜損傷的結果。圖中，各圖片從左至右依次為對照組(2只)；Prx-6組(2只)。從上至下依次為紫外線照射前；紫外線照射后；治療4天；治療8天；治療12天。
具體實施例方式本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，除了發(fā)現(xiàn)Prx-6蛋白具有抗氧化作用可保護ffiF等細胞之外，還首次發(fā)現(xiàn)Prx-6蛋白具有修復紫外線造成的角膜損傷的作用。在此基礎上完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明的重組人Prx-6蛋白可直接滴入結膜囊內，能有效的抑制角膜新生血管的生成；清除紫外線產生的大量氧自由基，修復受損的角膜上皮細胞，促進炎癥病變組織恢復，減輕疼痛；減輕角膜水腫，恢復角膜透明度及視力。具有刺激性小、可有效控制感染、療程短等優(yōu)點。Prx-6 蛋白
如本文所用，術語“本發(fā)明蛋白”、“ Peroxiredoxins蛋白” “prdx6蛋白”、“Prx_6蛋白” “過氧化氧化還原蛋白”等可互換使用，都指具有人Prx-6氨基酸序列的蛋白或多肽。它們可含有或不含起始的甲硫氨酸。應理解，這些術語既包括人(源)的蛋白，也包括在其他哺乳動物(如狗、牛、羊、猴、嚙齒動物(如小鼠))中的具有同種功能的同系物或同源蛋白。此外，該術語包括野生型和突變型Prx-6蛋白。人prx-6基因的 cDNA 序列 GenBank登錄號NM_004905. 2，如 SEQ ID NO: I 所示。人Prx-6的氨基酸序列的登錄號為NP_004896，如SEQ ID NO: 2所示。應理解，由于人等哺乳動物的prdx6蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是已知的，可以用本領域常規(guī)的DNA重組技術而獲得其蛋白。一類特別優(yōu)選的蛋白是Prx-6類似物，即在其他哺乳動物(如牛、羊、兔、狗、猴、鼠等)中Prx-6的同源蛋白。這些其他物種的同源蛋白的編碼序列，可根據(jù)prdx6的序列，通過雜交或擴增的方法而獲得，進而通過常規(guī)重組方法獲得這些同源蛋白。藥物組合物和施用方法
本發(fā)明還提供了藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明prx-6蛋白和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)生理鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、泊洛沙姆、卡波姆及其組合。例如，可將本發(fā)明蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為6-8，較佳地pH約為6. 8-7. 6，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)局部給藥、結膜下注射等。一種優(yōu)選的方式是直接滴入或涂入結膜囊內。
藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成滴眼液、眼用凝膠或眼膏的形式，宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約10微克/千克體重-約10毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內的。此外，本發(fā)明的蛋白還可與治療角膜損傷的其他治療劑一起使用。在優(yōu)選例中，可將本發(fā)明蛋白按0. 05-0. 2mg/次的用量直接滴入或涂入結膜囊內。本發(fā)明的主要優(yōu)點包括
(I)開發(fā)了人Prx-6蛋白新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應用領域。紫外線照射照成的角膜損傷，在滴入或涂入Prx-6蛋白后，能有效的抑制角膜新生血管的生成；清除紫外線產生的大量氧自由基，修復受損的角膜上皮細胞，促進炎癥病變組織恢復，減輕疼痛；減輕角膜水腫，恢復角膜透明度及視力。具有刺激性小、可有效控制感染、療程短等優(yōu)點。(2) Prx-6蛋白是源自人的蛋白，使用安全無毒副作用，有很好的藥用前景。(3)人Prx-6蛋白做成滴眼液、眼用凝膠或眼膏等，使用方便。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則份數(shù)和百分比按重量計。實施例I pET32b(+)/Prx-6表達載體構建
根據(jù)編碼Prx-6成熟蛋白的基因序列設計并合成了一對特異引物(上游引物5’ - tatccatatgcccggaggtctgcttc - 3’ (SEQ ID NO: 3),下游引物5’ -ttactcgagaggctggggtgtgtagcg - 3’ (SEQ ID NO: 4)),酶切位點分別為 UeI 及ZAoI,
以實驗室制備的人附睪cDNA文庫為模板，進行PCR擴增。結果見圖1，檢測到與理論值相符的688bp的擴增片段。用膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收目的片段，用RXhol進行雙酶切。然后，將經過雙酶切的片段連接到已用和通ol切成線性的pET32b(+)表達載體(購自Novagen)中，轉化常規(guī)的大腸桿菌T0P10F’(購自Invitrogen)。通過菌落PCR的方法篩選陽性克隆，并測序進一步證實序列及表達閱讀框的正確性，得到重組表達質粒pET32b (+) /Prx-6。該表達載體所表達的Prx-6蛋白在C端附加8個氨基酸LEHHHHHH，以便于分離純化。實施例2 Prx-6蛋白的表達
將質粒pET32b (+) /Prx-6轉化大腸桿菌Origami B (DE3)(購自Novagen),將陽性克隆接種于含IOOii g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過夜。次日按I :100轉接于含IOOii g /ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)至菌密度OD6tltl=O. 6 0. 8后，力口A IPTG至終濃度0. 4mM以誘導目的蛋白Prx_6的表達，3_4h后離心收集菌體。實施例3 Prx-6蛋白的純化
將離心收集的菌體重懸于緩沖液A中(20mM磷酸鹽緩沖液，150mM氯化鈉，pH7. 2)，冰浴中超聲破碎，20000g低溫(4°C)離心15min取上清為待純化的樣品。使用緩沖液A平衡鎳親和層析柱后，將樣品上柱，然后用含50mM咪唑的緩沖液A沖洗柱子去除雜蛋白(峰I)，用含300mM咪唑的緩沖液A將目的蛋白洗脫下來(峰2)(見圖2)。最后用G-25脫鹽柱將洗脫的蛋白置換于緩沖液A中以去除咪唑，SDS-PAGE電泳檢測。經分析，獲得了純度在95%以上Prx-6蛋白，分子量約26. lkD。(見圖3)。實施例4蛋白的抗氧化活性(HEF細胞氧化損傷實驗)
HEF細胞為常用的人胚胎成纖維細胞(Zavada et al. , Nature New Biology, 240:124-125 (1972) ^US 7，811，817)。用培養(yǎng)基(高糖 DMEM+5%FBS)復蘇細胞，培養(yǎng) 48h，待細胞長至90%匯合后，按照下面實驗方法先將實施例3中獲得的Prx-6蛋白(Prdx-6-His融合蛋白)加入培養(yǎng)體系中，再加入H2O2，作用30min后，MTT方法檢測細胞存活率。實驗設計
H2O2 濃度(lmM、0. 5 mM、0. 25 mM、0. 125 mM、0 mM)
Prdx-6-His 濃度(0. 5mg/ml、0. 25 mg/ml >0. 125 mg/ml >0 mg/ml)
各實驗組的H2O2和Prdx-6-His濃度如表I所示。表I
權利要求
1.一種Prx-6蛋白在制備治療角膜損傷的藥物中的用途。
2.如權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。
3.如權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是重組蛋白。
4.如權利要求I所述的用途，其特征在于，所述的Prx-6蛋白包括氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示的蛋白或其與表達標簽形成的融合蛋白。
5.一種用于治療角膜損傷的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物含有Prx-6蛋白以及藥學上可接受的載體，并且所述的藥物組合物為眼用制劑。
6.如權利要求5所述的藥物組合物,其特征在于,所述的Prx-6蛋白是人Prx-6蛋白。
7.如權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的Prx-6蛋白是重組蛋白。
8.如權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的眼用制劑是滴眼液、眼用凝膠或眼膏。
9.一種治療角膜損傷的方法，其特征在于，包括步驟對需要治療的對象，將Prx-6蛋白或權利要求5所述的藥物組合物滴入或涂入結膜囊內。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的治療包括抑制角膜新生血管的生成；修復受損的角膜上皮細胞；減輕角膜水腫，恢復角膜透明度及視力；清除自由基抗氧化，促進炎癥病變組織恢復。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組人Prx-6蛋白在治療角膜損傷方面的用途。具體的，本發(fā)明提供了人Prx-6蛋白在制備治療角膜損傷的藥物中的用途。本發(fā)明的實驗表明，Prx-6蛋白在治療角膜損傷過程中有抑制角膜新生血管的生成；修復受損的角膜上皮細胞；減輕角膜水腫，恢復角膜透明度及視力；清除自由基抗氧化，促進炎癥病變組織恢復等作用。
文檔編號A61K38/44GK102793911SQ20111013670
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月24日 優(yōu)先權日2011年5月24日
發(fā)明者李建遠 申請人:李建遠