專利名稱：一種鴨疫里默氏桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種鴨疫里默氏桿菌及其應(yīng)用，即一株可引起鴨神經(jīng)癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎的細(xì)菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鴨傳染性漿膜炎，又稱鴨疫里默氏桿菌病、鴨疫巴氏桿菌病、新鴨病等，是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella Anatipestifer,簡稱RA)引起的鴨、鵝、火雞及其他家禽和野禽的一種急性或慢性接觸性傳染病，主要侵害2 7周齡雛鴨，以神經(jīng)癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。本病于1932年在美國紐約首次發(fā)現(xiàn)，我國鄺榮祿等于1975年首次報道本病在廣州的存在；郭玉璞等(1982)在北京地區(qū)商品鴨中首次分離出該病原菌；隨后，我國廣東、上海、福建、北京、四川、湖南、江蘇、海南、山東、重慶、湖北等地區(qū)均報道了發(fā)生該病的情況。迄今為止，國際上報道鴨疫里默氏桿菌共有21個血清型。由于缺乏相應(yīng)的參考菌株，在早期研究中，我國關(guān)于RA血清型的報道不多。早年高福等(1987)對從北京、廣東和上海等地分離的205個菌株經(jīng)凝集和瓊擴試驗鑒定證明均屬血清I型。但近年來發(fā)現(xiàn)其血清型已發(fā)生了巨大變化除了血清2型、6型、10型、11型、13型和14型，汪銘書等(2001)還報道了血清4型及血清8型鴨疫里默氏桿菌在我國的存在；李文楊等(2002)從福建省103個肉鴨場116份病料中共分離到細(xì)菌107株，其中鴨疫里默氏菌84株，占78. 5% ；大腸桿菌23株，占21. 5%。在分離鑒定的84株鴨疫里默氏桿菌中，血清2型占60. 7%，I型占25. 0%，其它占14. 3%。韋強等(2003)研究結(jié)果表明，優(yōu)勢血清型在不同的年份出現(xiàn)不同的變化，2000年鴨疫里默氏桿菌以I型為主，占總分離菌數(shù)的51. 9% ；2001年以后2型占絕對優(yōu)勢，占總分離菌數(shù)的89. 5% ；2002年RA2型依舊占53. 3%的絕對優(yōu)勢?？梢娢覈壳傲餍械镍喴呃锬暇溲逍鸵寻l(fā)生了明顯變化，2型已成為主要流行的血清型。當(dāng)前，鴨疫里默氏桿菌對養(yǎng)殖業(yè)的危害除直接引起動物發(fā)病、死亡外，感染過鴨疫里默氏桿菌的鴨因飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長發(fā)育遲緩而帶來的間接經(jīng)濟損失也十分嚴(yán)重，鴨疫里默氏桿菌雖然對部分抗菌藥物敏感，但難于清除，尤其是該菌侵入氣囊后，藥物難以到達(dá)，由于不合理的用藥方案，鴨疫里默氏桿菌耐藥現(xiàn)象普遍存在，耐藥率高且廣泛，同時造成一定的藥物殘留等問題。目前防止該病的重要手段是接種鴨疫里默氏桿菌疫苗，但國內(nèi)針對該病的商品化疫苗非常少。因此，篩選出致病力強、免疫原性好的鴨疫里默氏桿對于制備疫苗具有重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一株鴨疫里默氏桿菌及其應(yīng)用，以該菌為抗原制備的疫苗可有效防治以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎，為鴨傳染性漿膜炎的預(yù)防和治療提供了產(chǎn)品和使用方法。本發(fā)明的鴨疫里默氏桿菌(Riemeralla anatipestifer) RA BYT06株已于2012年11月15日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6832。上述的鴨疫里默氏桿菌用于制備鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗，所制得的疫苗可以預(yù)防以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生。本發(fā)明篩選得到的鴨疫里默氏桿菌具有高致病性，用其制備的滅活疫苗，能夠預(yù)防以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生，具有良好的市場推廣前景。
具體實施例方式本發(fā)明對山東、廣東、福建、廣西等地的疑似鴨疫里默氏桿菌病死鴨進(jìn)行病原分離、鑒定，獲得38株病原為鴨疫里默氏桿菌，對其進(jìn)行血清型鑒定表明，其中有7株為血清2型；動物回歸及毒力試驗表明RA BYT06株毒力最強，可致鴨只10/10發(fā)病且其中5只死亡；免疫原性試驗結(jié)果表明，當(dāng)免疫劑量為O. 25mL (抗原含量達(dá)到1. OX 108CFU/mL)時即可使攻毒保護達(dá)到9/10。以上結(jié)果表明，篩選得到一株血清2型鴨疫里默氏桿菌，其致病力最 強、免疫原性好、制備的油苗攻毒保護效果好，確定為生產(chǎn)用菌株，于2012年11月15日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6832。下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、鴨疫里默氏桿菌的分離及鑒定⑴將從山東、廣東、福建、廣西等地收集的病死鴨進(jìn)行無菌操作，取病死鴨心、血、肝或腦組織劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(使用前加5%犢牛血清)平板、鮮血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于含5%C02的37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。其中38株的結(jié)果如下在胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，置含5%C02恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，菌落呈圓形奶白色，突起，光滑，邊緣整齊，斜光觀察時菌落發(fā)綠光，有的培養(yǎng)基亦被襯成綠色，不同菌株綠光深淺程度不同，在鮮血瓊脂上呈圓形，不溶血，有閃光，呈奶油狀菌落，麥康凱瓊脂和普通營養(yǎng)瓊脂上均不生長，38株分離菌分別命名為RA BYTOU RA BYT02至RABYT38。⑵取純培養(yǎng)的細(xì)菌的單個菌落涂于干凈的載玻片上，然后分別用瑞氏染色法染色和革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態(tài)特征。革蘭氏染色，為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，呈單個或成對分布，偶爾呈鏈狀排列，不運動，無芽胞；瑞氏染色大部分菌體兩極濃染。⑶取純培養(yǎng)物分別進(jìn)行吲哚(靛基質(zhì))試驗，甲基紅(M.R.)試驗，V-P試驗，過氧化氫酶試驗，接觸酶試驗，尿素酶試驗，葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇、鼠李糖、果糖發(fā)酵試驗。37°C培養(yǎng)，連續(xù)觀察7天。結(jié)果表明其中9株菌部分發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖外，其余菌株均不發(fā)酵糖類，不產(chǎn)生硫化氫，過氧化氫酶試驗、接觸酶試驗、尿素酶試驗均為陽性，V-P試驗、甲基紅(M. R.)試驗、吲哚(靛基質(zhì))試驗均為陰性，符合鴨疫里默氏桿菌的生化反應(yīng)特征。⑷取初步分離保存的各株鴨疫里默氏桿菌純培養(yǎng)物，分別用鴨疫里默氏桿菌定型血清作平板凝集試驗，以確定其血清型。結(jié)果顯示,38株細(xì)菌分離株中7株為血清型2型，4株為血清型I型’3株為血清型3型，3株為血清型4型，I株為血清型5型，2株為血清型6型，3株為血清型7型，3株為血清型9型，3株為血清型10型，I株為血清型11型，其中2型為優(yōu)勢血清型。(5) 7株血清2型鴨疫里默氏桿菌毒力測定試驗分別將分離菌純培養(yǎng)的單個菌落劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(使用前加5%犢牛血清)平板上，37°C培養(yǎng)24h，刮取平板上所有菌落混于滅菌生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，以
0.5mL/只劑量肌肉注射19日齡健康易感鴨10只，同時設(shè)立滅菌生理鹽水注射對照組10只。攻毒后連續(xù)觀察10天，每日記錄鴨子的精神、食欲、飲水、運動及死亡情況，并對死亡鴨進(jìn)行病理剖檢、細(xì)菌分離及鑒定。結(jié)果表明，RA BYT06株所攻毒鴨在攻毒40h后，鴨開始出現(xiàn)精神萎靡，行動遲緩或俯臥不起，眼、鼻流分泌物，共濟失調(diào)等癥狀，其余株部分在90h后出現(xiàn)癥狀，部分未臨床出現(xiàn)癥狀；RA BYT06株攻毒后全部發(fā)病，10天內(nèi)多數(shù)發(fā)病鴨死亡，死亡達(dá)到5/10，剖檢可見典型的心包炎、肝周炎、氣囊炎，RA BYT17.RA BYT2URA BYT24株發(fā)病3/10 7/10，死亡0/10 2/10，因此可確定RA BYT06株毒力最強，詳見表I。取心血涂片和肝組織印片進(jìn)行瑞氏染色后顯微鏡下觀察檢查，RA BYT06株可見兩極濃染的小桿菌，單個或成對存在，并能從心血和肝組織在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上分離出接種菌，其生化及 培養(yǎng)特征與RA BYT06株株鑒定結(jié)果一致，因此本研究選用RA BYT06株作為疫苗用強毒菌株。并送中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為 CGMCC No. 6832。表1:7株血清型2型鴨疫里默氏桿菌的毒力測定試驗結(jié)果
前株編號_攻毐·攻毐H齡汗始發(fā)病時間發(fā)病數(shù)泣(11/〗0)及死亡數(shù)歟
RA BYT06 0.5mL/只肌注 19 H齡 4龜發(fā)病10只，其屮死亡5只RA BYT17 O.SmL/只肌注 19 H齡 120h 發(fā)_ 3只，其中死亡O只RA BYT21 0.5mL/只肌注請日齡 90h 發(fā) 7只，其中死亡2只RABYT24 0.5mL./只肌注 19 □齡 96h 發(fā)病6只，其中死C 2只RABYT28 0.5mL/只肌注 19 口齡 - 發(fā)病O只，其中死亡O只RA BYT31 0.5mL/只肌注 19 H齡 - 發(fā)病O只，其屮死亡O只RA BYT37 0.5mL/只肌注 19 Π齡 - 發(fā)病O只，+K-中死Γ: O只對照饑_t理鹽水_19 D齡_-_U 其中死Γ: O K注〃_〃表不未發(fā)病(6)鴨疫里默氏桿菌強毒分離株RA BYT06株的免疫原性測定將確定的強毒分離株RA BYT06接種胰蛋白胨大豆肉湯(使用前加5%犢牛血清)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，以平板培養(yǎng)計數(shù)法進(jìn)行活菌計數(shù)，收集菌體，將其濃度稀釋到3. OX 106、3. OX IO7,3. OX IO8,3. OX IO9,3. OX 1010CFU/mL五組，分別按照油水比為2:1的比例做成油佐劑滅活疫苗，使配苗后每毫升抗原液菌數(shù)分別為1. 0X106、1. OXlO'l. 0X108、
1.OX 109、1. OX IOltlCFU,取5日齡健康易感雛鴨60只，10只/組，分別用含有不同濃度抗原的滅活疫苗進(jìn)行頸部皮下注射，O. 25mL/只，10只作為非免疫對照，接種后14日，每只鴨各肌肉注射O. 5mL(1.0X106CFU/mL)RA BYT06株菌液，觀測10日，測定疫苗的免疫保護效果。結(jié)果如表3所示，當(dāng)抗原含量達(dá)到1. O X 107CFU/mL以上，免疫劑量為O. 25mL時，保護8/10，當(dāng)抗原含量達(dá)到1. O X 108CFU/mL以上，免疫劑量為O. 25mL時，保護達(dá)到9/10，對照組10/10發(fā)病且其中5只死亡，結(jié)果表明當(dāng)抗原含量達(dá)到1. O X 108CFU/mL時，攻毒保護達(dá)到9/10，免疫原性好；具體結(jié)果見表2。表2 RA BYT06分離株的免疫原性試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種鴨疫里默氏桿菌，其保藏編號為CGMCC No. 6832。
2.權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌在制備疫苗中的應(yīng)用。
3.一種滅活疫苗，所述的滅活疫苗是以權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌作為抗原制備的。
4.權(quán)利要求3所述的滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟取注射用白油94份、6份司本-80混合后，加入2%硬脂酸鋁，加熱熔化至透明，混合均勻，制成油相，取鴨疫里默氏桿菌的菌液96份，加入高壓滅菌的4份吐溫-80，充分溶解混勻；從油相罐內(nèi)將2份油相打到乳化罐內(nèi)，開動電機預(yù)乳化，同時徐徐加入制備好的鴨疫里默氏桿菌液I份，加完后再以3500r/min乳化40分鐘；在乳化終止前加入1%硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01% ;定量分裝，加蓋密封。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨疫里默氏桿菌，保藏號為CGMCC No.6832。上述的鴨疫里默氏桿菌用于制備鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗，所制得的疫苗可以預(yù)防以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生。滅活疫苗中鴨疫里默氏桿菌6832的數(shù)量不低于1×108CFU/mL。本發(fā)明篩選得到的鴨疫里默氏桿菌具有高致病性，用其制備的滅活疫苗，能夠預(yù)防以神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生，具有良好的市場推廣前景。
文檔編號A61K39/02GK103007261SQ20121057397
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者蔣皓靜, 凌紅麗, 叢雁方, 蔣貽海, 孫海新 申請人:青島康地恩藥業(yè)股份有限公司, 青島寶依特生物制藥有限公司