專利名稱：一種用于防治糖尿病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥用或功能性保健品用組合物，具體地說，是一種含有天然植物提取物或單體的組合物及其在藥物、功能性保健品方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代科學(xué)的高速發(fā)展，人們越來越重視“天然”藥物。近年來，醫(yī)藥界在治療心腦血管疾病、降血糖等藥用植物研究方面做了諸多工作，加強了對生物活性物質(zhì)的分析和研究，以期進一步明確其功效。然而，取得的成效是有限的。這主要是由于心腦血管疾病、糖尿病的致病機理復(fù)雜，常伴有不同類別的一種或多種并發(fā)癥，已有的單一天然活性成分難以全方位奏效。
自由基損傷是II型糖尿病的重要發(fā)病因素之一，而高血糖又會導(dǎo)致自由基生成。據(jù)報道，咖啡酸、綠原酸可以抗氧化，而梔子能降低血糖，但是各自作用機制并不十分清楚(中國紀(jì)檢監(jiān)察報2000/6/21；郭婷等，國外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊1999，19(4)；桅子降血糖作用的實驗研究中藥新藥與臨床藥理2006年1月，第17卷第1期)，這對于科學(xué)地利用二者的優(yōu)缺點來進一步改善糖尿病的治療是不利的。另外，糖尿病及其并發(fā)癥均需要長期服藥，所以在改善療效的基礎(chǔ)上，減少給藥劑量/次數(shù)、降低治療成本是醫(yī)藥工作者必須解決的一項迫切任務(wù)。
不同藥物的聯(lián)用，似乎總是一種不錯的解決方案。然而，迄今為止，針對單/二咖啡?？鼘幩崮芊衽c梔子聯(lián)合應(yīng)用，二者的作用機制是加合、協(xié)同還是拮抗等基礎(chǔ)問題，現(xiàn)有技術(shù)沒有提供科學(xué)依據(jù)。至于二者是否能聯(lián)合用于其它疾病(例如心腦血管疾病)，現(xiàn)有技術(shù)甚至沒有類似的暗示或嘗試。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在這方面進行了大量的有益探索，并取得了諸多喜人的結(jié)果。
本發(fā)明的一個目的在于提供單和/或二咖啡?？鼘幩崤c梔子的組合在治療和/或預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥、心腦血管疾病、老年癡呆癥、高脂血癥等疾病中的應(yīng)用。
以下對本發(fā)明作進一步闡述。
糖尿病在前期對于含有單/二咖啡?？鼘幩岬乃幱媒M合物研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人對于本發(fā)明組合在糖尿病治療方面的藥效及其作用機制做了詳細(xì)的研究，得出了相當(dāng)滿意的結(jié)果。
我們根據(jù)以下機制設(shè)計了本發(fā)明藥物聯(lián)用①梔子的降血糖機制與提高胰島素分泌有關(guān)。②單/二咖啡?？鼘幩?、咖啡酸具有抗炎性反應(yīng)、抗氧化、降低血粘度、抑制血小板聚集等作用，改善微循環(huán)；③單/二咖啡?？鼘幩?、咖啡酸增強了梔子的降血糖作用④梔子苷增強了單/二咖啡?？鼘幩帷⒖Х人峥寡仔苑磻?yīng)及抗氧化作用，降低胰腺自由基損傷。
所有這些作用，對于糖尿病(尤其是II型糖尿病)的發(fā)生、發(fā)展過程中的病理生理改變都是有益的。
期望不受任何理論或組方所限，在大量實驗的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人推測這是由于梔子苷和單/二咖啡?？鼘幩嶙饔糜诓煌悬c，尤其是在不同病理階段發(fā)揮治療作用，發(fā)揮了藥物聯(lián)用的整體治療優(yōu)勢。
心腦血管疾病、老年癡呆癥二者聯(lián)用的有益效果并不僅局限于糖尿病及其并發(fā)癥中。在心腦血管疾病的防治中同樣是適用且有益的。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，如果冠心病、腦卒中已經(jīng)發(fā)生，無論是急性期還是恢復(fù)期治療也同樣有共同的干預(yù)靶點，比如抗氧化及抗炎。對于急性期治療，抗氧化及抗炎藥物可以減少細(xì)胞的死亡，最大限度的保留功能。對于恢復(fù)期治療，抗氧化及抗炎及降低血脂可以延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生，降低再次發(fā)生血栓(或出血)的可能性。
基于上述糖尿病研究所得出的結(jié)論，我們可以認(rèn)為本發(fā)明組合對于冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的防治是適用的。進一步的研究證實了本發(fā)明藥物組合在心腦血管疾病(尤其是缺血性疾病)、老年癡呆癥的治療和/或預(yù)防中表現(xiàn)出極好的治療效果。
所述心腦血管疾病例如包括冠心病、腦卒中(也稱腦中風(fēng))、心肌梗塞，和所述老年癡呆癥包括阿爾茨海默病(簡稱AD)或腦血管性癡呆(簡稱VD)。
高脂血癥在針對上述疾病的研究中，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明組合具有調(diào)節(jié)血脂的作用。
功能性保健品本發(fā)明的另一個目的在于本發(fā)明組合在制備功能性保健品中的應(yīng)用。
由于本發(fā)明組合物具備上述功效，也符合功能性保健品安全性的要求。因此，本發(fā)明上述組合也可作為制備功能性保健食品的主要功能成分、或作為增益劑摻加到食品、飲料中，供適應(yīng)人群長期使用。而且，在本發(fā)明試驗的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，含有本發(fā)明上述組合的功能性保健品至少具有下述保健功能輔助降血脂功能、輔助降血糖功能、輔助調(diào)節(jié)血壓、抗氧化功能、輔助改善記憶功能、功能。
同樣，功能性保健品制備技術(shù)也屬于已知技術(shù)。相對于可藥物而言，本發(fā)明組合物用于功能性保健品的來源、條件可以更為廣泛和寬松。例如，可以使用含有單和/或二咖啡?？鼘幩岬奶崛∥锖蜅d子提取物組合，也可以直接選擇單和/或二咖啡?？鼘幩岷蜅d子苷組合，也可以選擇含有咖啡酸酯的其它植物提取物或使用其化學(xué)全合成、半合成物。在功能性保健品的功效成分構(gòu)成中，可以僅含有本發(fā)明組合，也可以是本發(fā)明組合加其它輔助或加強功效的成分，如添加維生素E用以增強抗氧化功效，在此不再贅述。
本發(fā)明組合及相應(yīng)制劑本發(fā)明組合是指以單獨含有單和/或二咖啡?？鼘幩?、梔子的獨立制劑形式供聯(lián)合施用，或者以同時含有二者的組合物/產(chǎn)品形式提供。
因此，本發(fā)明的另一個目的在于提供用于含有梔子和單和/或二咖啡?？鼘幩岬乃幱媒M合物，其中以單/二咖啡?？鼘幩岷蜅d子中的梔子苷計，二者的重量比例為0.1-10∶1，優(yōu)選0.1-8∶1，更優(yōu)選0.2-5∶1，和更優(yōu)選0.5-2∶1。
本發(fā)明組合物中，梔子可以選擇藥味直接粉碎成粉末入藥，也可以相當(dāng)于上述中藥材生藥量的提取物或其它形式入藥。因此，本發(fā)明藥物組合物的梔子活性組成包括藥材原粉、脂或水溶性提取物、有效部位、或有效成分，或者采用現(xiàn)有技術(shù)中已有的制品形式。例如，所述活性組成包括a).以梔子苷(即京尼平苷，Geniposide)為主要活性成分的物質(zhì)含有梔子總苷的梔子提取物，例如梔子的水提取物、醇提取物，或梔子總苷，或梔子苷單體或其衍生物。梔子總苷是指環(huán)烯醚萜總苷，其中的主要活性成分梔子苷，還可含有羥異梔子苷(gardenoside)、、山梔子苷(shazhiside)、梔子酮苷(gardoside)及京尼平酸苷的混合物，其中也可含有藏紅花素(crocin)、藏紅花酸(crocetin)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，梔子總苷、梔子苷的提取和制備方法為已知技術(shù)(例如中國專利申請CN200510026143.0、CN02124158.9、ZL03109126、ZL 03122071、ZL 03137512、ZL03137512、ZL 200310111038)，在此不作贅述。
b).以單和/或二咖啡?？鼘幩釣橹饕钚猿煞值奈镔|(zhì)咖啡?？鼘幩崾且活愑煽鼘幩?quinic acid)與數(shù)目不等的咖啡酸(caffeic acid)通過酯化縮合而成的酚酸類天然成分，也稱為咖啡酸酯。根據(jù)奎寧酸分子上連接的咖啡?；鶖?shù)目不同可以將該類成分分為單(一)咖啡酰奎寧酸、二咖啡?？鼘幩?、三咖啡?？鼘幩岷退目Х弱？鼘幩岬阮悇e。
可以自多種植物提取出來的單/二咖啡?？鼘幩?，如含有單和/或二咖啡酰奎寧酸的植物提取物，例如燈盞細(xì)辛水提取物；含有咖啡酸、單寧酸(丹寧酸)、單咖啡?？鼘幩?如綠原酸)的咖啡提取物，優(yōu)選其中不含咖啡因；含有綠原酸和/或異綠原酸的金銀花、杜仲提取物；或直接取綠原酸、異綠原酸、或者其它單咖啡?？鼘幩帷⒒蛘叨Х弱？鼘幩帷?br> 單/二咖啡?？鼘幩帷⒖Х人釀t來源很為廣泛。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明所用單/二咖啡?？鼘幩岬膩碓床⒉痪窒抻谏鲜鲋参?。試驗表明，只要含有單和/或二咖啡酰奎寧酸，其它植物或植物部位(提取物)也可實現(xiàn)本發(fā)明，例如茜草科咖啡屬咖啡豆或菊科植物，蒼耳子、向日葵、艾葉、茼蒿、燈盞細(xì)辛、茵陳、旋覆花、紫菀、菜薊、山萵苣、林蔭千里光，及蜂膠、杜仲、金銀花及其它忍冬科植物、繼木、咖啡、可可樹、北劉寄奴、狹葉紫錐花、苦丁茶及其它冬青屬植物、甘薯葉、甘薯、梔子、土豆、常春藤屬植物、或魚眼草屬植物。同時，需要指出的是，采用這些植物提取單和/或二咖啡酰奎寧酸或相應(yīng)單體的提取和制備方法為已知技術(shù)，例如藥物分析雜志2005年，25(7)751-755、瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報1999年，22(6)469-470、醫(yī)學(xué)綜述2004年，10(4)249-250、EP0299107、US5401858、ZL01115358X、ZL031287298、ZL99105113、ZL200310113536、ZL94102414、ZL97109109、ZL01144170、ZL02133448、ZL02811814、ZL02824704、ZL03110999、ZL03134575、ZL200310111180、ZL200510000484、ZL03117754，在此不作贅述。
由于單咖啡酰奎寧酸和二咖啡?？鼘幩幔渌幚砉πЬ哂袠O大的相同性，并且，自植物中提取的咖啡酰奎寧酸往往是單、二咖啡酰奎寧酸的混合物，甚至還含有少量三咖啡酰奎寧酸，且單、二咖啡?？鼘幩嵋渤Ｊ歉鞣N同分異構(gòu)體的混合物質(zhì)(也即總咖啡酸酯)。因此，本發(fā)明既可以采用含有單咖啡?？鼘幩帷⒒蚝卸Х弱？鼘幩岬闹参锾崛∥锘騿误w，也可采用單咖啡?？鼘幩釂误w、二咖啡酰奎寧酸單體的混合物，也可以采用含有單、二、三咖啡?？鼘幩岬奶崛∥?。
單咖啡?？鼘幩峥梢匀∽?-咖啡?？鼘幩?綠原酸)、5-咖啡?？鼘幩?異綠原酸)，或者它們的混合物。
根據(jù)咖啡酰基取代位置不同，二咖啡?？鼘幩岱譃?，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、1，3-二-O-咖啡酰奎寧酸、1，4-二-O-咖啡酰奎寧酸、3，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、3，4-二-O-咖啡?？鼘幩?、4，5-二-O-咖啡?？鼘幩帷?br> 可單獨或者采用上述單、二咖啡?？鼘幩岬幕旌衔?，例如綠原酸、異綠原酸、3，4-位、3，5-位、1，5-位二咖啡?？鼘幩岬幕旌衔?，或者例如含有1，5-位二咖啡?？鼘幩岬奶崛∥铮蛘呃缇G原酸單體(即3-咖啡?？鼘幩?、異綠原酸單體(即5-咖啡酰奎寧酸)、或者綠原酸和異綠原酸的混合物，或者3，5-二-O-咖啡?？鼘幩釂误w、和/或1，5-位二咖啡?？鼘幩釂误w。上述單、二咖啡?？鼘幩嵫苌锘蛩幱名}也適于本發(fā)明。
有利的是，上述活性成分當(dāng)以提取物形式入藥時，梔子苷在所述提取物中的純度為2-98wt％、優(yōu)選25％、50％、75％或92wt％，和單/二咖啡?？鼘幩嵩谒鎏崛∥镏械募兌葹?-98wt％、優(yōu)選40％、75％或96wt％。
在上下文中，“本發(fā)明藥用組合”所涉及術(shù)語“單/二咖啡酰奎寧酸”、“梔子”、“梔子(總)苷”具有上述定義。
下面的試驗將證實按照本發(fā)明描述的具有上述定義之“單/二咖啡?？鼘幩帷迸c“梔子”的組合，具有本發(fā)明所述的有益效果。鑒于現(xiàn)有技術(shù)中業(yè)已存在著相當(dāng)成熟有效的制備上述定義組分的技術(shù)，在此不作重點描述。例如，可以采用現(xiàn)代提取和分離技術(shù)以提高活性物質(zhì)的純度、盡量除去不需要的雜質(zhì)，類似的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中已相當(dāng)成熟有效。
可針對梔子苷類、單/二咖啡酰奎寧酸的溶解特性和體內(nèi)吸收特點(中國藥科大學(xué)學(xué)報2003，34(01)65-9；沈陽藥科大學(xué)學(xué)報1999，16(4)250-3；中國藥理學(xué)通報1992，8(4)278-80)，采用標(biāo)準(zhǔn)制劑技術(shù)，與藥用輔料一起制成適宜的口服或非腸道給藥劑型，類似的技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中也已相當(dāng)成熟有效，例如片劑(ZL01115358、ZL03112999)；分散片(ZL03112974、ZL02153445)；口腔速崩片(ZL03102405、ZL200410016510、ZL200410041256)；混懸劑(ZL200410080266)、乳劑(ZL200410080265)、緩控釋制劑(ZL01117620、ZL02109758、ZL02116795、ZL02129313、ZL02134118、ZL03100021、ZL03133897)、滴丸(ZL01133515、ZL03135325、ZL200310119222)；軟膠囊(ZL01117620)；注射或輸液劑(ZL03129007、ZL200410008734、ZL200410022438、ZL200410080023、ZL93106319、ZL95104038、ZL97101107、ZL02155001、ZL021332983、ZL031279953、ZL03141614、ZL03113037、ZL2003101210259、ZL200410013845)；或含磷脂制劑(ZL03111469、ZL01138902、ZL03153496)。
本發(fā)明組合物臨床使用中，示例性的每日口服推薦劑量為單/二咖啡?？鼘幩?0-1000mg(優(yōu)選80-200mg)、梔子苷10-200mg(優(yōu)選50-150mg)。
本發(fā)明的上述藥物組合克服了已有藥物存在的作用單一、服藥量大等缺點，代表了天然藥物治療和預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥、心腦血管疾病的新趨勢。
藥理藥效學(xué)試驗研究一.糖尿病方面的藥理作用1.對鏈佐菌素所致糖尿病大鼠血糖和血清胰島素的影響方法取雄性SD大鼠按標(biāo)準(zhǔn)方法制備小劑量鏈佐菌素致糖尿病大鼠模型，3d后根據(jù)大鼠血糖值隨機分組，每組8只。
各組連續(xù)灌胃給藥8d，每日1次，空白組給予等量蒸餾水。最后一次給藥后2小時(二甲雙胍組1小時)摘眼球取血，測定血糖和血清胰島素。
實驗藥物陽性藥二甲雙胍組300mg/kg；咖啡酸酯組(mg/kg)二咖啡酰奎寧酸120、50；梔子組(mg/kg)梔子提取物(梔子總苷含量50％)200、100；組合A組(mg/kg)二咖啡酰奎寧酸∶梔子提取物(梔子苷含量60％)＝1∶5200、100、50；組合B組(mg/kg)單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔铩脳d子苷＝5∶1100、50、30；組合C組(mg/kg)二咖啡?？鼘幩帷脳d子苷＝1∶1100、50、30；結(jié)果表1對鏈佐菌素所致大鼠糖尿病血糖及血清胰島素影響(X±s)


*與空白組對比，前后差值P＜0.5；**與空白組對比，前后差值P＜0.01實驗表明二甲雙胍組可以有效降低本模型大鼠血糖，差異有顯著性，但不提高大鼠血清胰島素水平。梔子大劑量組對血清胰島素升高有顯著性影響，但無明顯降糖作用。二咖啡酰奎寧酸組對血糖及血清胰島素均無顯著性影響。
本發(fā)明組合物各劑量組均可降低大鼠血糖，其作用優(yōu)于二甲雙胍或與之相當(dāng)，各大劑量組可以提高血清胰島素。
二.心腦血管方面的藥理作用1.對大鼠試驗性腦缺血的保護作用對腦水含量的影響將體重160-180g大鼠隨機分組，試驗前9天及術(shù)前1hr每天口服給藥一次。結(jié)扎雙側(cè)頸動脈造成急性實驗性不完全缺血模型。
組合物A綠原酸+梔子提取物(梔子總苷含量80％)1∶2組合物B單咖啡?？鼘幩?含綠原酸及異綠原酸)+梔子總苷1∶1表2對實驗性腦缺血大鼠腦水含量的影響(X±S)(n＝10)

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01由上表可知，本發(fā)明各組及依達(dá)拉奉組對不完全性腦缺血引起的腦水腫均顯示出保護作用，但是與腦缺血模型組比較，組合物組中劑量以上組使腦含水量減少更加顯著(P＜0.01)，表明其對不完全性腦缺血引起的腦水腫有顯著的保護作用。而單獨施用的綠原酸及梔子提取物沒有保護作用。
2.對缺血性腦損傷的影響對大鼠腦梗塞組織重量的影響取SD大鼠，雌雄各半，隨機分組假手術(shù)組、生理鹽水組(NS)、本發(fā)明組合物A(單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔?2∶1)+梔子苷1∶5)3個劑量組、本發(fā)明組合物B(燈盞細(xì)辛提取物+梔子提取物(梔子苷含量65％)3∶1)3個劑量組、陽性藥組(單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔锝M(2∶1)、梔子總苷組)，每組10只。按照已知藥理學(xué)方法做成大鼠大腦中動脈結(jié)扎(MCAO)模型。結(jié)果見下表。
表3對MCAO所致大鼠腦梗塞組織重量的影響(n＝10)

與NS比較，*P＜0.05，**P＜0.01結(jié)果表明，大鼠MCAO后明顯有腦梗塞發(fā)生，本發(fā)明組合各組各劑量(iv)組可明顯降低腦梗塞組織重量百分比(P＜0.01，P＜0.05)，而單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔?、梔子苷組也有較明顯的降低效果(P＜0.05)，但是與組合物大、中劑量相比，陽性對照組效果明顯不如本發(fā)明組合。
同樣，在采用與上表相同的藥物及其劑量，對MCAO所致大鼠缺血損傷行為學(xué)指標(biāo)的影響的實驗中，結(jié)果顯示了并可以得出與上述相類似的結(jié)論，即組合物、單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔锖蜅d子苷組均顯示了相關(guān)的作用，但以本發(fā)明組合大、中劑量組的效果最好，明顯優(yōu)于單純的單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔锖蜅d子總苷組。
3對腫瘤壞死因子損傷大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子的影響材料本發(fā)明組合物A梔子苷+總咖啡酸酯(含有綠原酸、異綠原酸、二咖啡酰奎寧酸及咖啡酸共85％)1∶12，(25、50、100μg/ml)；本發(fā)明組合物B梔子總苷(含量85％)+總咖啡酸酯(含有綠原酸、異綠原酸、二咖啡酰奎寧酸及咖啡酸共85％)10∶1，(25、50、100μg/ml)；對照藥梔子總苷(含量85％)(50μg/ml、100μg/ml)；總咖啡酸酯(含有綠原酸、異綠原酸、二咖啡?？鼘幩峒翱Х人峁?5％)(50μg/ml、100μg/ml)；方法通過CMEC體外培養(yǎng)技術(shù)，建立TNF-α損傷的細(xì)胞模型，以細(xì)胞活力(MTT)、乳酸脫氫酶(LDH)為評價指標(biāo)，觀察藥物對損傷的CMEC的保護作用。以雙抗體夾心ELISA法檢測損傷CMEC上清液中白介素6(IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、白介素8(IL-8)的含量；以實時定量PCR方法檢測損傷CMEC IL-6、MCP-1、IL-8mRNA的表達(dá)為評價指標(biāo)，觀察藥物在不同濃度對損傷的CMEC合成釋放炎癥介質(zhì)的影響。
結(jié)果及結(jié)論顯示本發(fā)明組合物各組25～100μg/ml均可提高TNF-α損傷CMEC的細(xì)胞活力，降低LDH的釋放，以50μg/ml效果最佳。梔子總苷組無此作用，總咖啡酸酯100μg/ml有微弱作用，與本發(fā)明組合物A、B組中的25μg/ml相當(dāng)。
本發(fā)明組合物各組在25～100μg/ml范圍內(nèi)能夠濃度依賴性的抑制TNF-α損傷CMEC IL-6的釋放及mRNA的表達(dá)。梔子總苷無此作用，總咖啡酸酯100μg/ml有微弱作用，但稍弱于本發(fā)明組合物A、B組中的25μg/ml。
本發(fā)明組合物各組對TNF-α損傷CMEC作用3～12h內(nèi)均可減少IL-6的釋放，其中在9h時作用最為明顯。在25～100μg/ml范圍內(nèi)能夠濃度依賴性的抑制TNF-α損傷CMEC的MCP-1釋放，且作用隨時間的增長抑制作用逐漸減弱。25～50μg/ml的本發(fā)明組合物有降低損傷CMEC的MCP-1mRNA表達(dá)的趨勢，100μg/ml的本發(fā)明組合物降低MCP-1的表達(dá)。本發(fā)明組合物對TNF-α損傷CMEC釋放IL-8有降低的趨勢。梔子苷無此作用，總咖啡酸酯100μg/ml有微弱作用，但稍弱于本發(fā)明組合物25μg/ml。本試驗表明，本發(fā)明組合物能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)CMEC分泌IL-6、MCP-1的作用，降低其mRNA表達(dá)，阻抑炎癥級聯(lián)反應(yīng)，減輕炎性因子對CMEC的損傷。單獨給予的梔子總苷無此作用，總咖啡酸酯高濃度(大劑量)有微弱作用。可以得出梔子苷和總咖啡酸酯合用具有協(xié)同抗炎作用的結(jié)論。
4腦細(xì)胞保護作用材料和方法實驗動物健康Wistar大鼠72只，體重260±15g；藥物本發(fā)明組合物A梔子提取物(梔子苷含量75％)+總咖啡酸酯(含有單、二、三咖啡酰奎寧酸及咖啡酸)7∶1，20mg/kg；本發(fā)明組合物B梔子提取物(梔子苷含量75％)+總咖啡酸酯(含有單、二、三咖啡酰奎寧酸及咖啡酸)1∶7，20mg/kg；陽性對照藥(注射)梔子苷，20mg/kg；總咖啡酸酯(含有單、二、三咖啡酰奎寧酸及咖啡酸)，20mg/kg；依達(dá)拉奉注射液，10mg/kg；實驗方法大鼠隨機分為6組，每組12只。正常對照組給0.9％氯化鈉液3ml/kg；模型組參照Kaizumis栓線法建立腦缺血再灌注動物模型。
腦水腫及腦鈣含量的測定取右前腦50～100mg，烘干至恒重，即為干重。
腦含水量測定用公式(濕重-干重)/濕重，計算腦含水量。
結(jié)果(1)大鼠腦組織梗塞區(qū)觀察光鏡下模型組神經(jīng)元輪廓模糊，胞體著色變深，胞質(zhì)分界不清。細(xì)胞周圍亮區(qū)變寬與正常對照組有顯著差異(P＜0.01)。本發(fā)明組合物各組及依達(dá)拉奉組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)尚清晰，胞核與胞質(zhì)界限尚能分清，細(xì)胞周圍亮區(qū)較寬，與模型組相比雖有縮小，但無顯著性差異。梔子苷組和總咖啡酸酯組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)欠清晰，胞核與胞質(zhì)界限能分清，細(xì)胞周圍亮區(qū)較寬，與模型組相比未見明顯縮小。
電鏡下模型組神經(jīng)元變形，明暗神經(jīng)元不易區(qū)分，胞核變形，核內(nèi)異染色質(zhì)增多、核膜及核周隙模糊不清、核質(zhì)分界不清、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失、細(xì)胞器減少或變形、結(jié)構(gòu)不清。線粒體呈氣球樣腫脹、質(zhì)膜結(jié)構(gòu)不清或消失斷裂、細(xì)胞周圍有大量水腫液呈低電子密度亮區(qū)。本發(fā)明組合物各組及依達(dá)拉奉組神經(jīng)元核周核膜清晰、核內(nèi)異染色質(zhì)稍增多、核周間隙較狹窄、胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較明顯、但線粒體均有水腫樣改變、細(xì)胞周圍有少量水腫液。梔子苷組和總咖啡酸酯組神經(jīng)元核周核膜欠清晰、核內(nèi)異染色質(zhì)稍明顯增多、核周間隙較狹窄、胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器不明顯、線粒體有水腫樣改變。模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫、胞質(zhì)電子密度降低、細(xì)胞器減少、局部細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不清。本發(fā)明組合物組及依達(dá)拉奉組星形膠質(zhì)細(xì)胞的水腫表現(xiàn)較模型組輕，細(xì)胞器與模型組相比明顯較多。梔子苷組和總咖啡酸酯組星形膠質(zhì)細(xì)胞則與模型組基本相似。
(2)腦組織鈣、丙二醛、超氧化物歧化酶、腦水分含量的實驗結(jié)果模型組腦組織丙二醛含量、鈣含量、腦水分均較正常對照組明顯升高(P＜0.01)，而SOD活性則明顯低于正常對照組(P＜0.01)；本發(fā)明組合物各組能抑制灌注后腦組織丙二醛含量的升高和升高SOD活性(P＜0.01)，改善腦水含量(P＜0.01)，效果與依達(dá)拉奉相當(dāng)，明顯優(yōu)于總咖啡酸酯和梔子苷組。
結(jié)論本發(fā)明組合物能顯著抑制腦缺血再灌注大鼠腦組織MDA含量的升高和提高SOD活性，改善腦水含量，并從超微結(jié)構(gòu)上證實對膜性結(jié)構(gòu)尚有一定保護作用。本發(fā)明組合物主要通過提高SOD活性，清除氧自由基，從而對腦細(xì)胞起保護作用，其作用與依達(dá)拉奉相當(dāng)，明顯優(yōu)于單獨施用的梔子苷和總咖啡酸酯。
三.老年癡呆方面的藥理作用對缺血再灌注制備的VD模型的作用大鼠分為假手術(shù)組、模型組、單咖啡?？鼘幩峤M(含有綠原酸、異綠原酸)、梔子苷組和本發(fā)明組合物A組單咖啡?？鼘幩?含有綠原酸、異綠原酸)+梔子苷8∶1，注射用藥和本發(fā)明組合物B組單咖啡酰奎寧酸(含有綠原酸、異綠原酸)+梔子苷1∶8，口服給藥，在制備模型前連續(xù)給藥，然后用反復(fù)缺血再灌注制備VD大鼠模型，測定海馬組織中MDA的含量。
表4.對再灌注制備的VD大鼠海馬組織中MDA含量的影響比較(n＝10)

與假手術(shù)組比較，*P＜0.1，**P＜0.05，***P＜0.01上表顯示，本發(fā)明組合物各組均可降低大鼠海馬MDA含量，有抗氧化作用，但以本發(fā)明組合物(中、高劑量的A組和B組)的作用最顯著，梔子苷組也降低了MDA含量，而單組分的單咖啡酰奎寧酸組則較弱。
四.抗氧化及降血脂方面的藥理作用對高血脂癥大鼠的抗氧化作用材料本發(fā)明藥物組合物A梔子苷+杜仲提取物1∶10，80mg/kg、40mg/kg灌胃；本發(fā)明藥物組合物A梔子苷+金銀花提取物8∶1，80mg/kg、40mg/kg灌胃正常對照組生理鹽水；高血脂組生理鹽水；陽性對照藥杜仲提取物(50mg/kg)；金銀花提取物(50mg/kg)；梔子提取物(50mg/kg)；羅格列酮組3mg/kg；灌胃。
實驗方法模型的建立SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分組，每組8只。正常組喂基礎(chǔ)飼料，飲用清潔的自來水。其余大鼠喂高脂、高糖飼料(基礎(chǔ)飼料42％、豬油23％、蔗糖24％、食鹽5％)，并飲用1％的食鹽水。每日一次，藥物灌胃，連續(xù)4周后取血測定觀察指標(biāo)。
結(jié)果抗氧化作用實驗表明，單獨施用的杜仲提取物及金銀花提取物存在一定的抗氧化活性(對血清和肝臟LPO和SOD的影響，P＜0.05)，梔子組則沒有抗氧化活性。本發(fā)明組合物各組的低、高劑量組均有抗氧化活性，尤其是高劑量組的活性更顯著(p＜0.01)，明顯優(yōu)于單獨施用的杜仲提取物及金銀花提取物和羅格列酮對照藥。
調(diào)血脂作用表5對高脂血癥大鼠血脂的影響

與高血脂組比較*p＜0.05**p＜0.01；與正常組比較△△p＜0.01
結(jié)論上述實驗表明，單獨施用的杜仲提取物及金銀花提取物可以降低TC，但對血脂其他指標(biāo)沒有影響，而梔子則對所有血脂指標(biāo)都沒有作用。本發(fā)明組合物各組均具有顯著的降低血脂TC、TG和LDL-C的作用，效果優(yōu)于所有對照藥。
本實驗表明，梔子的加入，顯著增強了杜仲提取物及金銀花提取物的抗氧化及調(diào)節(jié)血脂作用，這種協(xié)同作用很大可能性上來源于梔子和咖啡酸酯的協(xié)同，具有良好的藥用前景。
五.抗動脈粥樣硬化的藥理作用對兔實驗性動脈粥樣硬化(AS)血管重構(gòu)的影響材料本發(fā)明藥物組合物A梔子苷+單/二咖啡?？鼘幩?∶8，50mg/kg灌胃；本發(fā)明藥物組合物B梔子總苷+單/二咖啡?？鼘幩?∶1，50mg/kg灌胃；正常對照組生理鹽水；模型組生理鹽水；陽性對照藥單/二咖啡酰奎寧酸(50mg/kg)、梔子總苷(50mg/kg)、普羅布考(25mg/kg)。
實驗方法將純種雄性新西蘭兔，隨機分組，飼養(yǎng)1周后，采用球囊損傷內(nèi)皮繼喂食高脂飼料的方法復(fù)制家兔實驗性AS模型。觀察12周。
測定項目及結(jié)果組織病理學(xué)光學(xué)顯微鏡下，正常對照組內(nèi)皮細(xì)胞完整未見異常改變；模型組動脈內(nèi)皮細(xì)胞缺損，內(nèi)膜增生，6周時內(nèi)膜增生嚴(yán)重，管腔明顯狹窄而且大小不規(guī)則，細(xì)胞胞質(zhì)嗜酸性不明顯，出現(xiàn)大量大小不規(guī)則的泡沫細(xì)胞，有的可見脂肪壞死中心，內(nèi)膜下層可見大量梭形增生細(xì)胞；各給藥組內(nèi)皮缺損面減少，增厚明顯減輕，泡沫細(xì)胞減少，尤其以本發(fā)明組合物各組及普羅布考為最優(yōu)。
組織形態(tài)學(xué)最大內(nèi)膜厚度(MIT)、最小管腔直徑(MLD)、管腔面積(LA)、內(nèi)彈力膜圍繞面積(IELa)、外彈力膜圍繞面積(EELa)，并得出內(nèi)膜面積(IA)、中膜面積(MA)、管腔狹窄百分比(LS)，其中，IA＝IELa-LA；MA＝EELa-IELa；LS＝IA/IELa。
內(nèi)膜厚度已經(jīng)被證實可以作為早期動脈硬化的有用指征，在減小MIT、IA和LS、增加LA方面，各給藥組表現(xiàn)出不同程度作用。在抑制內(nèi)膜增殖方面，以本發(fā)明組合物和普羅布考組作用尤為明顯(P＜0.01)，顯著優(yōu)于梔子和單/二咖啡?？鼘幩峤M(P＜0.05)。
討論已知梔子和咖啡?？鼘幩釋S都有一定治療作用，但其抗AS的機理并不清楚。由于植物藥多組分的特性使得其藥理作用往往也是呈現(xiàn)出“多靶點”的特性，當(dāng)然，也正是由于這種特性，使得詳細(xì)研究其藥理機制顯得較為困難。同樣的原因，本發(fā)明人目前尚無法準(zhǔn)確認(rèn)定本發(fā)明組合協(xié)同作用的機理，只能以藥效學(xué)資料作為結(jié)論，而暫時忽略其具體機制。
梔子苷與咖啡?？鼘幩崴苄远己芎?，二者的合用，配伍相對穩(wěn)定，也不會產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)而減損藥效，相反，可能由于治療機理的側(cè)重方向不同，可產(chǎn)生更顯著的協(xié)同作用，這也是臨床醫(yī)學(xué)實踐中對藥物特性極為需要的——單藥多靶點藥理特性。
實施例實施例1膠囊劑取梔子5g，粉碎成粗粉，加75％乙醇回流提取三次，第一、二次各2小時，第三次1小時，合并提取液，減壓濃縮至約400ml，用正丁醇提取三次，每次300ml，合并正丁醇提取液，減壓濃縮至無正丁醇味，加水200ml，加熱溶解，濾過，濾液噴霧干燥，得提取物I備用；取提取物I一份、取金銀花提取物(綠原酸含量不低于50％)1g，加入淀粉、硬脂酸鎂，混勻，裝入硬膠囊中。經(jīng)檢測，每膠囊中含有綠原酸500mg、和梔子苷100mg。
實施例2片劑取咖啡豆5kg，用95％的乙醇提取，提取物溶于水后分別以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分。乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析和MCI柱層析分別得二咖啡酰氧基奎寧酸8g和奎寧酸4g。然后把二咖啡酰氧基-奎寧酸100mg，溶于1000ml水中制成0.1％濃度的水溶液加熱溶解，混合均勻后，裝入藥瓶中密封，消毒制成產(chǎn)品，得提取物II備用。
取實施例1的提取物I兩份、提取物II一份，加入低取代羥丙基纖維素、硬脂酸鎂、淀粉、微晶纖維素，按照標(biāo)準(zhǔn)制粒和壓片工藝制粒。經(jīng)檢測，含有二咖啡?？鼘幩?00mg/片、梔子苷200mg/片。
實施例3軟膠囊劑取實施例1的提取物I半份、提取物II五份，加入淀粉、硬脂酸鎂，混勻，按照標(biāo)準(zhǔn)工藝制成軟膠囊。經(jīng)檢測，每膠囊中含有含有二咖啡?？鼘幩?00mg、梔子苷50mg。
實施例4水針劑取燈盞細(xì)辛全植物30kg，用95％的乙醇提取，提取物溶于水后分別以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分。乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱層析和MCI柱層析得提取物III。
另取梔子總苷5g，加注射用水及氯化鈉適量，溶解后再加入上述提取物III，加注射用水至2000ml，濾過，灌封(10ml/支)，滅菌，即得。經(jīng)檢測，含有總咖啡酸脂150mg/支、和梔子總苷25mg/支。
實施例5凍干針劑無菌條件下取單/二咖啡?？鼘幩峄旌衔?5g、適量藥用堿，加注射用水約至900ml，攪拌使溶解，調(diào)節(jié)pH值至6.5-7.5，加入梔子苷75g至溶解，混合均勻、微孔濾膜過濾，加注射用水至1000ml。然后，加配制量的0.02％活性炭攪拌5-10min，用無菌抽濾漏斗過濾，再用滅菌垂熔漏斗精濾或超濾，濾液檢驗合格后分裝于1000支5ml安瓿中，低溫冷凍干燥，無菌熔封即得。經(jīng)檢測，含有單咖啡酰奎寧酸8mg/支、二咖啡酰奎寧酸15mg/支、和梔子苷75mg/支。
實施例6功能性保健食品取蜂膠提取物100g(含咖啡酸、單咖啡酰奎寧酸不低于70％)、梔子提取物(梔子苷含量不低于65％)100g、維生素E 50g、甜味添加劑適量，加入淀粉等輔料至總質(zhì)量300g，混勻，按標(biāo)準(zhǔn)工藝壓片成1000片，即得功能性保健食品片劑。
實施例7功能性保健食品取咖啡豆提取物(總咖啡酸酯含量不低于50％，不含咖啡因)400g、梔子苷5g、甜味添加劑、淀粉適量，按標(biāo)準(zhǔn)工藝制備成顆粒劑。
權(quán)利要求
1.一種藥用或功能性保健品用組合物，包括以下活性組分a.含有單和/或二咖啡?？鼘幩岬闹参锘蛘咧参锊课惶崛∥?，或單和/或二咖啡酰奎寧酸單體；和b.含有梔子總苷的梔子提取物，或梔子總苷，或梔子苷單體；其中組分a中單或二咖啡酰奎寧酸與組分b中梔子苷的重量比例為0.1-10∶1。
2.如權(quán)利要求1的組合物，所述二咖啡酰奎寧酸選自1，5-二-O-咖啡?？鼘幩?、1，3-二-O-咖啡?？鼘幩?、1，4-二-O-咖啡?？鼘幩?、3，5-二-O-咖啡酰奎寧酸、3，4-二-O-咖啡?？鼘幩?、4，5-二-O-咖啡?？鼘幩?，或者它們的混合物。
3.如權(quán)利要求1的組合物，所述單咖啡?？鼘幩徇x自3-咖啡?？鼘幩?、5-咖啡?？鼘幩幔蛘咚鼈兊幕旌衔?。
4.如權(quán)利要求1的組合物，所述植物或者植物部位選自蒼耳子、向日葵、艾葉、茼蒿、燈盞細(xì)辛、茵陳、旋覆花、紫菀、菜薊、山萵苣、林蔭千里光，蜂膠、杜仲、金銀花、繼木、咖啡、可可樹、北劉寄奴、狹葉紫錐花、苦丁茶、甘薯葉、甘薯、梔子、土豆、常春藤屬植物、或魚眼草屬植物。
5.如權(quán)利要求1的組合物，所述組分a為含有單和/或二咖啡酰奎寧酸的咖啡提取物。
6.如權(quán)利要求5的組合物，所述咖啡提取物中還含有咖啡酸。
7.如權(quán)利要求5或6的組合物，所述咖啡提取物不含咖啡因。
8.如權(quán)利要求1的組合物，所述活性組分a為含有單和/或二咖啡?？鼘幩岬慕疸y花提取物。
9.如權(quán)利要求1的組合物，所述活性組分a為含有單和/或二咖啡?？鼘幩岬臒舯K細(xì)辛提取物。
10.如權(quán)利要求1的組合物，所述活性組分a為含有單和/或二咖啡?？鼘幩岬亩胖偬崛∥?。
11.如權(quán)利要求1-10之一的組合物，是經(jīng)口服或非腸道施用的產(chǎn)品。
12.權(quán)利要求1-11之一的藥物組合物在制備用于治療和/或預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥、心腦血管疾病、老年癡呆癥、高脂血癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥用或保健品用組合物、制備方法及其應(yīng)用，所述組合物含有天然植物提取物或單體為活性成分。本發(fā)明藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防糖尿病及心腦血管疾病。
文檔編號A61K36/185GK101057674SQ20071011088
公開日2007年10月24日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者林谷風(fēng), 潘錫平 申請人:深圳市生物谷科技有限公司