專利名稱：血根堿制備腫瘤放射治療增敏藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于放療增敏藥物領(lǐng)域，涉及血根堿的一種新用途，具體涉及血根堿制備 腫瘤放射治療增敏藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
宮頸癌是全球婦女惡性腫瘤中僅次于乳腺癌的第二位常見(jiàn)腫瘤。目前全球?qū)m頸癌 每年新增病例49萬(wàn)人，死亡病例27萬(wàn)人，其中80%來(lái)自于發(fā)展中國(guó)家，中國(guó)就占到三分之 一。宮頸癌是我國(guó)高發(fā)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在許多城市宮頸癌發(fā)病率在腫瘤中排在 第一位，雖總體發(fā)病率比20年前有所下降，但卻呈現(xiàn)出十分明顯的低齡化趨勢(shì)。現(xiàn)在臨床 上的宮頸癌患者中，40至50歲人群占了約60%。其次就是30至40歲人群，所占比例超過(guò) 30%。宮頸癌治療原則是既要提高患者的生存率，又要改善其生存質(zhì)量。治療的趨勢(shì)是 采用多種手段的綜合治療。目前，用于宮頸癌治療的主要手段包括手術(shù)、放射治療(放療)、 化學(xué)藥物治療(化療)、生物治療、內(nèi)分泌治療、中醫(yī)中藥治療、熱療和射頻消融治療等。而 宮頸癌的放療目前是宮頸癌的基本治療方法之一。放療包括外照射及腔內(nèi)照射兩部分，各 期宮頸癌均可放療，但I(xiàn)期及II a期以手術(shù)治療為主。II b期及以后各期則以放療為主。早 期病例以腔內(nèi)放療為主，體外放療為輔；中期病例內(nèi)外各半；晚期病例則以體外放療為主， 腔內(nèi)放療為輔。腔內(nèi)放療的目的是控制局部病灶；體外放療則用以治療盆腔淋巴結(jié)及宮頸 旁組織等處的病灶。由于高分化鱗癌、腺癌、粘液腺癌等宮頸腺癌對(duì)放療不敏感，尋找新的 抗宮頸癌藥物以及增加宮頸癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性的放療增敏藥研究是當(dāng)今宮頸癌化療和 放療的熱門課題和主要的研究方向。IfiI 卞艮 M (sanguinarine, SAN, 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide)來(lái)源于罌粟科植物博落回的果實(shí)，早期的研究發(fā)現(xiàn)血 根堿具有抗炎、抗菌、抗氧化并對(duì)中樞神經(jīng)有麻醉作用，最近的研究表明血根堿在人類上皮 癌(A431)，前列腺癌(LNCaP)，人黑色素瘤(M4Beu)，結(jié)腸腺癌(DLD-I)，肺癌非小細(xì)胞癌 (A549)等細(xì)胞株中均有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和引起細(xì)胞周期阻滯等作 用，但同等劑量對(duì)正常的人上皮細(xì)胞(NEEKs)則未見(jiàn)任何影響，表明血根堿可能具有選擇 性抗腫瘤的功效。目前，國(guó)外缺乏對(duì)血根堿在宮頸癌中作用的系統(tǒng)研究，國(guó)內(nèi)此項(xiàng)工作尚未開(kāi)展，并 且國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)關(guān)于血根堿放療增敏方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供血根堿的一種新用途，即血根堿制備腫瘤放射治療增敏藥物的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是血根堿在制備腫瘤放射治療增敏藥 物中的應(yīng)用。
本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)一種放療增敏藥物，所述放療增敏藥物的活性成分包括血根 堿。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用血根堿增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感性的方法，放療前用血 根堿處理腫瘤細(xì)胞，然后進(jìn)行放療。上述技術(shù)方案中，用血根堿處理腫瘤細(xì)胞具體地用低劑量0. 5 1. 5 μ mol/L的血 根堿處理腫瘤細(xì)胞4 48h。上述技術(shù)方案中，所述放射治療增敏藥物可通過(guò)注射、噴射、滲透、吸收、物理或化 學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后 導(dǎo)入機(jī)體。以血根堿為活性成分的放射治療增敏藥物，需要的時(shí)候，所述放射治療增敏藥物 還包括一種以上(包括一種)藥學(xué)上可接受的添加劑，所述添加劑包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀 釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑寸。所述放射治療增敏藥物可以制備成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏 劑、霜?jiǎng)┑刃问健Ｉ鲜龈鞣N劑型的藥物均可按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。血根堿聯(lián)合放射治療的結(jié)果表明血根堿通過(guò)抑制宮頸癌細(xì)胞周期進(jìn)程，從而增 加腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性；同時(shí)，現(xiàn)已知腫瘤細(xì)胞主要是由于細(xì)胞周期破壞而導(dǎo)致 了細(xì)胞的失控性生長(zhǎng)，因此，本發(fā)明所述血根堿以及所述包括血根堿的放射治療增敏藥物 在包括宮頸癌在內(nèi)的不同腫瘤放射治療前給藥可以提高腫瘤放射治療增敏性，從而提高放 射治療的治療效果。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所述血根堿以及包括血根堿的所述放射治療增敏劑具有抑制癌細(xì)胞周期 進(jìn)程，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性的作用，因此，可以降低腫瘤病人的放射治療所需 的輻射照射劑量，降低放射治療所帶來(lái)的毒副作用，從而提高病人的生存質(zhì)量。


圖1為實(shí)施例二中血根堿處理后對(duì)受到照射的Hela細(xì)胞周期的影響曲線圖，其 中，G0/G1期與對(duì)照組相比，*p 0. 05 ；**ρ0· 01 ;#ρ 0. 05，##ρ0. 01 ；G2/M期與對(duì)照組相比 aP 0. 05 ;aap0. 01 ；與 3Gy、6Gy 和 9Gy 相比，b ρ 0. 05，bb ρ0· 01 ；S 期與對(duì)照組相比 +ρ0· 05 ； ++p0. 01 ；與 3Gy、6Gy 和 9Gy 相比，、0. 05，一p0. 01 ；Sub-Gl 與對(duì)照組相比 ep0. 05 ;ccp0. 01 ； 與 3Gy、6Gy 和 9Gy 相比，d ρ 0. 05，dd ρ0· 01 ；圖2為實(shí)施例三中血根堿對(duì)宮頸癌C33A細(xì)胞放射治療的影響曲線圖；圖3為實(shí)施例三中血根堿對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞放射治療的影響曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述材料人類宮頸癌細(xì)胞株HeLa、C33A購(gòu)于美國(guó)細(xì)胞收藏中心(ATCC)，并由本實(shí) 驗(yàn)室保存和培養(yǎng)；D-MEM培養(yǎng)基干粉，小牛血清，胰酶粉末購(gòu)自Gibco公司。HEPES購(gòu)自 Sigma(美國(guó))；各種規(guī)格培養(yǎng)皿、96孔板、6孔板、各種規(guī)格離心管購(gòu)自Fisher公司。噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMS0)、瓊脂糖、溴乙錠、溴酚蘭、吐溫-20(Tween-20)均為上海生物 技術(shù)科技有限公司。實(shí)施例一(1)細(xì)胞培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100萬(wàn)U/L青 霉素和鏈霉素的D-EME培養(yǎng)基。細(xì)胞置于5% C02，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2-3天傳代1次， 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。(2)用0. 25%的胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，將5 X104/ml的 HeLa細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種200 μ 1。在37°C、含5% CO2和飽和濕度條件培養(yǎng) 24小時(shí)后，加入濃度分別為0、0. 5、1、24Π3μπι01/1的血根堿，每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。然后 在細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48和60小時(shí)后，加入20 μ L濃度為5mg/ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時(shí)后輕輕吸掉培養(yǎng)基。加入150 μ L的DMSO振蕩溶解10分鐘。在酶標(biāo)儀上選取570nm 主波長(zhǎng)和630nm參考波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，對(duì)照組細(xì)胞存活率設(shè)為100%，其余各組細(xì)胞存活率 =(各濃度組吸光值/對(duì)照組吸光值)X 100%。結(jié)果如表1所示MTT比色法顯示宮頸癌HeLa細(xì)胞經(jīng)血根堿處理24小時(shí)后細(xì)胞 生長(zhǎng)出現(xiàn)明顯抑制，并顯現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性。表1.血根堿處理后的宮頸癌HeLa細(xì)胞的存活率呈濃度和劑量依賴 實(shí)施例二 按照實(shí)施例一中的方法培養(yǎng)細(xì)胞，然后將宮頸癌HeLa細(xì)胞接種于IOOmm培養(yǎng)瓶， 待貼壁后(待細(xì)胞長(zhǎng)至60-70%左右)分別加入濃度為lymol/L血根堿處理24小時(shí)后，照 射細(xì)胞，所照劑量為3、6、9Gy收集各組細(xì)胞，采用1，800g離心速度離心5分鐘。棄去上清， 用Ix PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次，1，SOOg離心5分鐘，并收集細(xì)胞沉淀。細(xì)胞放置在冰上預(yù) 冷的70%乙醇固定4小時(shí)，離心后，以Ix PBS洗滌細(xì)胞兩次。離心后，懸浮細(xì)胞于500 μ L 含 300 μ g/mLRNase A 和 10 μ g/mL proteinase K(美國(guó) Sigma Aldrich 公司)的 PI 溶液 中(10 μ g/mL)，30分鐘后，經(jīng)孔徑為53 μ m的尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，F(xiàn)ACS-Calibur流式細(xì)胞儀上 檢測(cè)分析。結(jié)果如圖1所示，血根堿處理誘導(dǎo)了劑量依賴性的G2/M期細(xì)胞周期阻滯，降低了 S 期細(xì)胞比例。但對(duì)G2/M期比例并沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明血根堿可以誘導(dǎo) 宮頸癌細(xì)胞周期阻滯。隨著照射劑量的增加，宮頸癌HeLa細(xì)胞G0/G和S期比例下降，同時(shí) 出現(xiàn)明顯的G2/M期細(xì)胞阻滯。現(xiàn)已知腫瘤細(xì)胞主要是由于細(xì)胞周期破壞而導(dǎo)致了細(xì)胞的 失控性生長(zhǎng)，細(xì)胞周期阻滯是宮頸癌許多化療藥物和放射治療的重要作用機(jī)理之一。
實(shí)施例三按照實(shí)施例一中的方法培養(yǎng)細(xì)胞C33A，然后用0. 5 μ M血根堿處理24小時(shí)的細(xì)胞 接受不同劑量(0 IOGy)的χ-輻射照射，然后接種到IOOmm培養(yǎng)皿。連續(xù)培養(yǎng)三周后， 采用甲醇固定，加姬姆薩液染色30分鐘，流水洗凈，最后觀察和記錄含有> 50細(xì)胞的克隆 個(gè)數(shù)。采用克隆形成率(PE)=(對(duì)照組克隆數(shù)/實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù))X 100%公式計(jì)算克隆形 成率，采用存活分?jǐn)?shù)=實(shí)驗(yàn)組克隆形成率/對(duì)照組克隆形成率公式計(jì)算存活分?jǐn)?shù)；其中，照射條件細(xì)胞置于直線加速器下，射線性質(zhì)為高能6兆伏X-線，照射野為 IOcmX 10cm，源皮距為100cm，劑量率為200cGy/min。照射時(shí)培養(yǎng)皿面上覆蓋1. 5cm厚等效 蠟板以調(diào)整照射劑量。圖2結(jié)果所示，與沒(méi)有血根堿24小時(shí)預(yù)處理細(xì)胞相比，不同的X _射線輻照在 0. 5 μ M血根堿(該濃度細(xì)胞存活率在90%以上，即為無(wú)毒性劑量)24小時(shí)預(yù)處理的C33A 細(xì)胞中導(dǎo)致更多的細(xì)胞死亡，IC5tl(殺死50%細(xì)胞的劑量)和IC9tl(殺死90%細(xì)胞的劑量) 在單獨(dú)χ -射線照射的C33A細(xì)胞分別為1. 2Gy和4. 2Gy，而IC50和IC90在血根堿24小時(shí) 預(yù)處理加χ -射線照射的C33A細(xì)胞則為0. 6Gy和2. OGy,即顯現(xiàn)兩倍以上的差異。按照上述方法，在另外一宮頸癌細(xì)胞HeLa，使用血根堿和發(fā)射治療聯(lián)合處理宮頸 癌細(xì)胞HeLa，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血根堿的放射治療增敏效果更加明顯(圖3)，IC50和IC9tl在單獨(dú) X-射線照射的細(xì)胞分別為1. IGy和5. 6Gy，而IC5tl和IC9tl在血根堿24小時(shí)預(yù)處理加χ-射 線照射的HeLa細(xì)胞則為0. 4Gy和2. 4Gy，即顯現(xiàn)2. 5倍以上的差異。這些試驗(yàn)結(jié)果表明血 根堿可增加宮頸癌細(xì)胞對(duì)χ-線輻射照射的放射敏感性。
權(quán)利要求
血根堿在制備腫瘤放射治療增敏藥物中的應(yīng)用。
2.一種放療增敏藥物，其特征在于，所述放療增敏藥物的活性成分包括血根堿。
全文摘要
本發(fā)明屬于放療增敏藥物領(lǐng)域，涉及血根堿的一種新用途，具體涉及血根堿制備腫瘤放射治療增敏藥物的應(yīng)用，本發(fā)明所述血根堿以及包括血根堿的所述放射治療增敏劑具有抑制癌細(xì)胞周期進(jìn)程，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性的作用，因此，可以降低腫瘤病人的放射治療所需的輻射照射劑量，降低放射治療所帶來(lái)的毒副作用，從而提高病人的生存質(zhì)量。
文檔編號(hào)A61K31/4741GK101904849SQ20101025689
公開(kāi)日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月19日
發(fā)明者徐加英, 樊賽軍 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)