專利名稱：：免疫耐受誘導(dǎo)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫耐受誘導(dǎo)劑，尤其涉及含有粘膜結(jié)合分子的誘導(dǎo)劑，該試劑與特異性的耐受原相連接。本發(fā)明還涉及在抗特異性抗原(包括半抗原)的個(gè)體中誘導(dǎo)免疫耐受的方法。本發(fā)明背景以及對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的討論通過給脊椎動(dòng)物生物體注射引入下文中稱作抗原(Ag)(包括半抗原)的外源物質(zhì)可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，其特征在于產(chǎn)生了能與所說Ag相互作用的特異性抗體(B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)物)和/或生成了效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，并在與所述Ag相遇的位點(diǎn)產(chǎn)生了被稱作淋巴因子的可溶性介體?？贵w和T淋巴細(xì)胞在抗敵對(duì)Ag的保護(hù)方面確實(shí)起著重要作用，但它們也參與導(dǎo)致宿主組織被破壞的有害過程。此為自身免疫疾病的情況，其中抗體和/或T淋巴細(xì)胞與病人自身組織Ag反應(yīng)并損傷之。這也是變態(tài)反應(yīng)的情況，此反應(yīng)的特征在于對(duì)某一環(huán)境因素的超常免疫反應(yīng)，它可導(dǎo)致破壞組織的炎癥反應(yīng)。另外，這在慢性炎癥反應(yīng)中的情況也是如此，此反應(yīng)是由于在某些感染(如結(jié)核病、血吸蟲病)中或隨后引入外源顆粒(如石棉)時(shí)不能有效排除外源物質(zhì)而產(chǎn)生的。在免疫增殖反應(yīng)中情況也是如此，此反應(yīng)在體內(nèi)引入同種異體移植物之后發(fā)生并可導(dǎo)致排異現(xiàn)象。開發(fā)有效治療由不希望的或組織損傷性免疫反應(yīng)(如同種異體移植排異、自身免疫疾病、對(duì)有害衍生物或外界抗原的組織損傷必變態(tài)反應(yīng))所引起疾病之方法的主要目的之一是將有害免疫過程的強(qiáng)度特異性地抑制或降低至可接受的水平而不影響免疫系統(tǒng)其余部分。免疫耐受的主題涉及確保不存在對(duì)人體自身組分(“自身抗原”)或?qū)θ魏嗡o外源物質(zhì)的損傷性免疫反應(yīng)的所有機(jī)制。誘導(dǎo)免疫耐受的長期確認(rèn)方法是口服抗原，這是由Wells以雞蛋白質(zhì)最先的闡明的(Wells，H.1911.StudiesontheChemistryofanaphylaxisIII.Experimentswithisolatedproteins，especiallythoseofhen′segg.J.Infect.Dis.9147)。這種常稱作“口服耐受”的現(xiàn)象(因?yàn)樽畛跏怯煽诜嗀g的作用證明的)的特征在于喂給或吸入抗原的動(dòng)物當(dāng)重新暴露于由全身途徑(如注射)引入的所說抗原時(shí)會(huì)變成不應(yīng)性的或降低了產(chǎn)生全身免疫反應(yīng)的能力。概況地說，抗原結(jié)合劑粘膜或粘膜組織(如腸、肺、口腔、生殖道、鼻或眼)內(nèi)可誘導(dǎo)全身免疫耐受現(xiàn)象。與此相反，將抗原引入非粘膜組織(即例如皮膚或血液，指的是全身免疫接種)經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致具有上述特征的免疫反應(yīng)，即全身免疫反應(yīng)。這種現(xiàn)象對(duì)于由粘膜途徑引入的Ag是高度特異性的，在這種意義上，低反應(yīng)性只能在注射過所說喂給或吸入Ag之后才能被證明，而在注射過結(jié)構(gòu)不相關(guān)的Ag之后不能被證明(假如后者以前未在粘膜位點(diǎn)被遇到的話)。據(jù)信吸入的抗原在腸相關(guān)的淋巴樣組織中由包括腸上皮細(xì)胞和Peyer氏patchM細(xì)胞的專門化細(xì)胞吸收和加工(Owen.R.L.，andP.Nemanic.1978.AntigenprocessingstructuresofthemammalianintestinaltractanSEMstudyoflymphoepithelialorgans.ScanningElectronMicrosc.2367-378)。據(jù)信吸入的抗原由氣管上皮中類似的細(xì)胞攝入(RichardsonJ.BouchardRandFergusonCC.1976.Uptakeandtransportofexogenousproteinsbyrespiratoryepithelium.Lab.Invest35307-314)。當(dāng)抗原與腸和肺粘膜局部微環(huán)境中的輔佐細(xì)胞、同種T輔助細(xì)胞和/或B淋巴細(xì)胞相互作用之后，會(huì)發(fā)生免疫反應(yīng)，其特征在于可受幾個(gè)因素影響，包括抗原的特性、所涉及輔佐細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的類型以及宿主的遺傳背景。然而，吸入抗原也會(huì)導(dǎo)致免疫耐受狀態(tài)的產(chǎn)生，此種情況的特征在于即使通過非粘膜途徑(如非腸道注射)將起初在消化道粘膜或呼吸道粘膜中遇到的抗原再次引入生物體也不會(huì)在非粘膜組織產(chǎn)生免疫反應(yīng)。由于這種現(xiàn)象對(duì)最初攝入或吸入的抗原而言特異性很強(qiáng)，因此不會(huì)影響抗其它抗原的全身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，其用途已成為越來越有吸引力的策略。以預(yù)防并可能治療與抗非粘膜組織中遇到的特異抗原而產(chǎn)生的不適當(dāng)?shù)暮?或超常免疫反應(yīng)相關(guān)的由之引起的疾病。粘膜誘導(dǎo)的全身耐受現(xiàn)象可涉及所有類型的免疫反應(yīng)，已知全身引入Ag可誘導(dǎo)這些免疫反應(yīng)，如抗體的產(chǎn)生，抗所述Ag的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。因此建議使用粘膜誘導(dǎo)的免疫耐受策略以防止或降低對(duì)化學(xué)藥物的變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)度(Chase，MW.1946.Inhibitionofexperimentaldrugallergybypriorfeedingofthesensitizingagent.Proc.Soc.Exp.Boil.61257-259)。它也可能防止或降低對(duì)全身引入的可溶性蛋白質(zhì)抗原以及顆?？乖?如通過口服紅細(xì)胞引入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的紅細(xì)胞)之免疫反應(yīng)的強(qiáng)度(ThomasHCandParrotDMV1974.Theinductionoftolerancetosolubleproteinantigensbyoraladministration.Immunology27631-639；Mattingly，J.andWaksmanB.1978.Immunologicalsuppressionafteroraladministrationofantigen.SpecificsuppressorcellsfoundinratPryer′spatchesafteroraladministrationofsheeperythrocytesandtheirsystemicmigration.J.Immunol.1211878；Bierme.S.J.，Blanc，M.，Abbal，M.，F(xiàn)ournie，A.1979.OralRhtreatmentforseverelyimmunizedmothers.Lancet，1605-606)。使用粘膜誘導(dǎo)的全身耐受現(xiàn)象可降低或抑制抗外源抗原以及自身抗原的免疫反應(yīng)，自身抗原也即宿主組織所衍生的組分。因此通過將自身抗原粘膜沉積于腸(經(jīng)喂給)或呼吸道(經(jīng)抗原霧化或鼻內(nèi)滴注)粘膜即可降低多種動(dòng)物系統(tǒng)中實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的自身免疫疾病強(qiáng)度。因此已證明口服II型膠原(在關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)的占優(yōu)勢(shì)的膠原類型)可抑制或降低實(shí)驗(yàn)性自身免疫關(guān)節(jié)炎的強(qiáng)度，在嚙齒類動(dòng)物的某些品系中通過注射II型膠原以及Freund氏完全佐劑或僅注射結(jié)核分枝桿菌(前者佐劑的成分)可誘導(dǎo)此病(Thompson，HSGandStaines，NA，1986，GastricadministrationoftypeIIcollagendelaystheonsetandseverityofcollagen-inducedarthritisinrats.Clin.Exp.Immunol.64581；Nagler-Anderson.C.，BoberLA，Robinson，ME.SiskindGW，ThorbeckeGJ.1986.SuppressionoftypeIIcollagen-inducedarthritisbyintragastricadministrationofsolubletypeIIcollagen.Proc.Natl.Acad.Sci.USA837443；Zhang，JZ，Lee，CSY，Lider，O.andWeinerHL.1990.SuppressionofadjuvantarthritisinLewisratsbyoraladministrationoftypeIIcollagen.J.Immunol.1452489-2493)。同樣，口服S-抗原(一種視網(wǎng)膜自身抗原，當(dāng)注射給動(dòng)物時(shí)可誘導(dǎo)一種形式的眼色素層視網(wǎng)膜炎)也可以抑制實(shí)驗(yàn)形式的自身免疫眼色素層視網(wǎng)膜炎(Nussenblatt，RB，Caspi，RR，MahdiR.Chan，CC，Roberge，R.，Lider，O.，Weiner，HL.1990，InhibitionofS-antigeninducedexperimentalautoimmuneuveoretinitisbyoralinductionoftolerancewithS-antigen.J.Immunol，1441689-1695)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦炎是慢性復(fù)發(fā)性脫髓鞘疾病，在嚙齒動(dòng)物的某些品系中通過注射純化的髓鞘堿性蛋白質(zhì)或粗制的脊髓組織勻漿以及佐劑可誘導(dǎo)此病，如果通過口服(喂給)或呼吸道(煙霧劑)途徑給予動(dòng)物MBP或MBP片段即可部分或完全抑制此病(BitarDMandWhitacreCC.1988.Suppressionofautoimmuneencephalomyelitisbytheoraladministrationofmyelinbasicprotein.CellImmunol.112364；HigginsPJandWeinerHL.1988.Suppressionofexperimentalautoimmuneencephalitisbyoraladministrationofmyelinbasicproteinanditsfragments.J.Immunol.140440-445；WeinerHL.Al-SabbaghAandSobelR.1990.Antigendrivenperipheralimmunetolerancesuppressionofexperimentalautoimmuneencephalomyelitis(EAE)byaerosoladministrationofmyelinbasicprotein.FASEBJ(Abstr.)4(7)2102)。另外據(jù)報(bào)道口服胰島素可抑制小鼠自身免疫糖尿病(ZhangZJ.DavidsonL.EisenbarthGandWeinerHL.1991，Suppressionofdiabetesinnonobesediabeticmicebyoraladministrationofporcineinsulin.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)8810252-10256)。最近發(fā)現(xiàn)口服乙酰膽堿受體之后可達(dá)到抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫重癥肌無力的目的(WankZY.QiaoJandLinkH.1993，Suppressionofexperimentalautoimmunemyastheniagravisbyoraladministrationofacetylcholinereceptor.J.Neuroimmunol.44209-214)。還證明了小鼠經(jīng)腸施用血吸蟲卵可防止肝和腸肉芽腫反應(yīng)的產(chǎn)生或降低其強(qiáng)度，此反應(yīng)是T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥免疫反應(yīng)，在寄生蟲血吸蟲侵染的過程中，血吸蟲卵周圍會(huì)產(chǎn)生此反應(yīng)(WeinstockJV.BlumAMandKassabJT.1985.Inductionofgranulomamodulationinmurineschistosomiasismansonibyentericexposuretoschistosomeeggs.J.Immunol.135560-563)。同樣，已建議口服抗原以防止和/或治療對(duì)普通變應(yīng)原(如居室灰塵成分或存在于禾本科植物花粉中的物質(zhì))的變態(tài)反應(yīng)(RebienW.PuttonenE.MaaschHJ.StixEandWahnU.1982.Clinicalandimmunologicalresponsetooralandsubcutaneousimmunotherapywithgrasspollenextracts.Aprospectivestudy.Eur.J.Pediatry138341-344；WortmannF.1977.OralhyposensitizationofChildrenwithpollinosisorhousedustasthma.AllergoletImmunopathol.515-26)。盡管上述例子表明粘膜服用外源以及自身抗原可提供一便利的方法從誘導(dǎo)特異性的免疫耐受，但實(shí)踐中的困難始終局限了大規(guī)模治療人的方法以及獸醫(yī)藥的實(shí)用性。實(shí)際上，如果粘膜誘導(dǎo)的免疫耐受在臨床上有廣泛的實(shí)用性，那么它對(duì)疾病過程自身已確定的病人和/或可能已存在組織破壞性免疫細(xì)胞的病人必須也是有效的。當(dāng)考慮到在遭受或傾向于自身免疫疾病，變態(tài)狀態(tài)或?qū)Τ掷m(xù)存在衍生物的慢性炎癥反應(yīng)的病人中誘導(dǎo)耐受的策略時(shí)，這一點(diǎn)尤其重要。粘膜誘導(dǎo)耐受的最新方法在抑制確定狀態(tài)的全身免疫敏感作用表達(dá)的方面取得了有限的成功(HanssonDG，VazNM.RawlingsLAandLynchJM.1979.Inhibitionofspecificimmuneresponsesbyfeedingproteinantigens，II.Effectsofpriorpassiveandactiveimmunization，J.Immunol.12222612266)。最重要地，由于目的在于誘導(dǎo)抗有害病原體之免疫應(yīng)答的粘膜疫苗的相似性，通過粘膜使用大多數(shù)抗原以誘導(dǎo)全身免疫耐受需要相當(dāng)量的耐受原/抗原，除非耐受原/抗原在長時(shí)間內(nèi)重復(fù)施用，否則免疫耐受的期限相對(duì)較短。可能的解釋是大多數(shù)抗原在進(jìn)入粘膜組織前被廣泛降解和/或以不充足的量被吸收。因此可大膽地假定只有具備已知的粘膜結(jié)合特性的分子(粘膜結(jié)合分子的例子列于下表I，也可見于文獻(xiàn)中，如MirelmanD.1986.Microbiallectinsandagglutinins，Propertiesandbiologicalactivity.pp.84-110，Wiley，NewYork)通過粘膜途徑，如口服途徑被施用時(shí)可誘導(dǎo)局部和全身免疫反應(yīng)，而不會(huì)誘導(dǎo)全身免疫耐受(deAizpuruaHJandRussell-JonesGJ.1988.Oralvaccination.IdentificationofClassesofproteinsthatprovokeanimmuneresponseuponoralfeeding.J.Exp.Med.167440-451)。一個(gè)值得注意的例子是霍亂毒素。它是目前已知的最強(qiáng)的粘膜免疫原之一(ElsonCOandEaldingW.1984.Generalizedsystemicandmucosalimmunityinmiceaftermucosalstimulationwithcholeratoxin.J.Immunol.1322736)，當(dāng)通過口服途徑將其與一非相關(guān)抗原同時(shí)施用時(shí)也可防止誘導(dǎo)對(duì)所述抗原的全身免疫耐受(ElsonCOandEaldingW.1984.Choleratoxindidnotinduceoraltoleranceinmiceand.abrogatedoraltolerancetoanunrelatedantigen.J.Immunol.1332892)。根據(jù)這些研究成果，建議粘膜施用與粘膜結(jié)合分子，如霍亂毒素或其粘膜結(jié)合片段霍亂毒素B區(qū)單位連接的抗原以誘導(dǎo)局部和全身免疫反應(yīng)而不是全身耐受(MckenzieSJandHalseyJF.1984.CholeratoxinBsubunitasacarrierproteintostimulateamucosalimmuneresponse.J.Immunol.1331818-1824；NedrudJG.LiangX，HagueNandLammME.1987，Combinedoral/nasalimmunizationprotectsmicefromSendaiVirusinfection.J.Immunol.1393484-3492；CzerkinskyC.RussellMW.LyckeN.LindbladMandHolmgrenJ.1989，OraladministrationofastreptococcalantigencoupledtocholeratoxinBsubunitevokesstrongantibodyresponsesinsalivaryglandsandextramucosaltissues.Infect.Immun.571072-1077；deAizpuruaHJandRussell-JonesGJ.1988.OralVaccinationIdentificationofclassesofproteinsthatprovokeanimmuneresponseuponoralfeeding.J.Exp.Med.167440-451；LehnerT.BergmeyerLA.PanagiotidiC.TaoL.BrookesR.KlavinskisLS.WalkerP.Walker.J.WardRGetal.1992.Inductionofmucosalandsystemicimmunitytoarecombinantsimianimmunodeficiencyviralprotein.Science258(5036)1365-1369)。本發(fā)明的描述已確定的看法是粘膜施用與粘膜結(jié)合分子連接的抗原可誘導(dǎo)局部和全身免疫反應(yīng)，與此相反，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過各種粘膜(口腔、鼻內(nèi)、陰道、直腸)途徑施用的抗原，當(dāng)與粘膜結(jié)合分子連接時(shí)，可增強(qiáng)對(duì)所說抗原全身免疫耐受的誘導(dǎo)。因此本發(fā)明涉及免疫耐受誘導(dǎo)劑，它包含與特異性耐受原連接的粘膜結(jié)合分子。術(shù)語“免疫耐受”此處定義為宿主對(duì)特異性耐受抗原免疫反應(yīng)性的降低。在本發(fā)明書和權(quán)利要求書中將這種耐受抗原稱作耐受原，這與確立的專有名詞是一致的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述粘膜結(jié)合分子選自衍生于細(xì)菌毒素，細(xì)菌菌毛、病毒粘附蛋白和植物凝血素的粘膜結(jié)合結(jié)構(gòu)的粘膜結(jié)合分子。所說細(xì)菌毒素的粘膜結(jié)合結(jié)構(gòu)優(yōu)選自含有霍亂毒素和大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素的組中，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述粘膜結(jié)合結(jié)構(gòu)是毒素的結(jié)合片段，尤其是霍亂毒素或大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素的B亞單位?？捎糜诒景l(fā)明的免疫耐受誘導(dǎo)劑的粘膜結(jié)合分子，其類與型的例子列于表I。表I粘膜結(jié)合分子類與型的例子A.細(xì)菌毒素及其結(jié)合亞單位或片段例如霍亂毒素、霍亂B亞單位；大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素(LT)、LTB亞單位；百日咳桿菌毒素、亞單位S2、S3、S4和/或S5；百喉毒素、DTB片段志賀毒素、志賀樣毒素及B亞單位B.細(xì)菌菌毛例如大腸桿菌；K88、K99、987P、F41、CFA/I、CFA/II；(CS1、CS2和/或CS2)、CFA/IV(CS4、CS5和/或CS6)、P菌毛等；霍亂弧菌毒素-共調(diào)節(jié)毛(TCP)、甘露糖敏感型血細(xì)胞凝集素(MSHA)、黑角藻糖敏感型血細(xì)胞凝集素(FSHA)等百日咳桿菌絲狀血細(xì)胞凝集素；C.病毒吸附蛋白質(zhì)例如流感和仙臺(tái)病毒血細(xì)胞凝集素HIVgp120D.動(dòng)物凝血素和凝血素樣分子例如免疫球蛋白鈣-依賴型(C-型)凝血素；可溶性乳糖結(jié)合(S-型)凝血素；選擇蛋白；收集蛋白；螺旋pomatia血細(xì)胞凝集素E.植物凝血素例如伴刀豆球蛋白A小麥胚凝集素植物血細(xì)胞凝集素相思豆毒蛋白蓖麻毒蛋白在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明免疫耐受誘導(dǎo)劑中與粘膜結(jié)合分子連接的特異耐受原選自包括半抗原的特異抗原，此抗原在個(gè)體中可導(dǎo)致不希望的免疫反應(yīng)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說抗原選自含有蛋白質(zhì)、肽類、糖類、脂類和核酸的組中。所指的不希望的免疫反應(yīng)與全身性抗體的產(chǎn)生和/或延遲型超敏感性相關(guān)，經(jīng)常還與自身免疫疾病，變態(tài)反應(yīng)性疾病，組織或細(xì)胞移植物排異事件和/或急性或慢性炎癥反應(yīng)或疾病相關(guān)。在根據(jù)本發(fā)明的免疫耐受誘導(dǎo)劑中，特異的耐受原和粘膜結(jié)合分子直接或間接相互連接。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述耐受原和所述粘膜結(jié)合分子在下組成員之一的協(xié)助下間接地相互連接，該組包含間隔分子、含有所述耐受原/抗原(包括半抗原)的保護(hù)性載體或所說間隔分子與所述耐受原/抗原(包括半抗原)的雜合分子，該雜合分子可以經(jīng)表達(dá)融合基因或核苷酸序列得到。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述間隔分子選自對(duì)所說耐受原或含有耐受原的載體以及所述粘膜結(jié)合分子中任一者或兩者具有結(jié)合親和力的分子。這種間隔分子的特殊例子是抗體。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，間隔分子是GM1的神經(jīng)節(jié)苷脂、半乳糖基-N-乙?；?氨基半乳糖基-(唾液酸)-半乳糖基葡糖神經(jīng)酰胺的霍亂毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)或衍生于這些結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的免疫耐受誘導(dǎo)劑中，只要所述耐受原和所述分子可行使它們各自的功能，特異的耐受原與粘膜結(jié)合分子連接的方式就不重要。因此，用簡(jiǎn)單的化學(xué)方法即可將它們直接相互連接。將諸如霍亂毒素B亞單位(CTB)或大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B亞單位(LTB)的蛋白質(zhì)連接到脂類、半抗原、糖類、核酸以及包括抗體和合成肽類的其它蛋白質(zhì)上的化學(xué)方法是本技術(shù)已知的(例見CarlssonJetal1978.Biochem.J.173723-737；CumberJAetal.1985.MethodsinEnzymology112207-224，WaldenPetal.1986.J.Mol.CellImmunol.2191-197；GordonRDetal.1987.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84308-312；AvrameasSandTernynckT.1969.Immunochemistry653；JosephKC.KimSU.StieberA.GonatasNK.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA752815-2819；MiddlebrookJLandKohnLD(eds).1981.Receptor-mediatedbindingandinternalizationoftoxinsandhormones.AcademicPress.NewYork.pp311-350)。耐受原基因也可與CTB(或LTB)基因融合(SanchezJ.SvennerholmA-MandHolmgrenJ.1988.Geneticfusionofanon-toxicheat-stableenterotoxin-relateddeca-peptideantigentocholeratoxinBsubunit.FEBSLetters241110-114)，然后可在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)，如細(xì)菌、酵母或病毒中表達(dá)所得的嵌合基因。另外，耐受誘導(dǎo)劑可含有編碼耐受原的核酸序列(DNA或RNA)或合成多聚核苷酸的片段，利用宿主粘膜組織細(xì)胞確保將相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯成成熟蛋白質(zhì)的能力?？蓪⒌玫降哪褪茉c粘膜結(jié)合分子化學(xué)連接(RohrbaughMLandMcGowanJJ.1993.Gene-transferfortherapyandprophylaxisofHIV-1infection.Ann.N.Y.Acad.Sci.Vol685.pp697-712；NabelGJandFelgnerPL.1993.Directgene-transferforimmunotherapyandimmunization.TrendsinBiotechnologyVol11No.5.pp211-215；RobinsonHL.HuntLA.WebsterRG.1993.Protectionagainstalethalinfluenza-viruschallengebyimmunizationwithahemagglutinin-expressingplasmidDNA.Vaccine11957-960；MartinonF.KrishnanS.LenzenG.MagneR.GomardE.GruilletJG.LevyJPandMeulienP.1993.Eur.J.Immunol.231719-1722)。另一種可選擇的呈遞形式為將耐受原或其核酸前體摻入保護(hù)性載體(如脂質(zhì)體或等量的可生物降解的載體)中。粘膜結(jié)合物質(zhì)已經(jīng)或?qū)⒁降捷d體上以使含有耐受原的載體有效結(jié)合到粘膜表面以改善耐受原的效力。以這種呈遞形式，耐受原可以是游離的或與其它分子相連接。本發(fā)明還涉及在抗特異性抗原(包括半抗原)的個(gè)體中誘導(dǎo)免疫耐受的方法，所述抗原在所述個(gè)體中可引起不希望的免疫反應(yīng)，該方法包括經(jīng)粘膜途徑給所述個(gè)體施用免疫有效量的根據(jù)本發(fā)明的免疫耐受誘導(dǎo)劑?？稍趥€(gè)體中引起不希望的免疫反應(yīng)并在本發(fā)明的免疫耐受誘導(dǎo)劑中可形成特異耐受原的特異抗原的例子是胰島素或其片段，包括合成肽類或相應(yīng)的核酸遺傳信息?？赏ㄟ^粘膜途徑施用本發(fā)明的免疫耐受誘導(dǎo)劑以防止或抑制對(duì)胰島素的免疫反應(yīng)，因此可防止或治療自身免疫糖尿??；髓鞘堿性蛋白質(zhì)或其片段，包括合成肽類或相應(yīng)的核酸遺傳信息，本發(fā)明的試劑可用于防止或抑制對(duì)髓鞘堿性蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，因此可防止或治療多發(fā)性硬化癥。單鏈或雙鏈DNA施用本發(fā)明的試劑可抑制對(duì)自身DNA的免疫反應(yīng)以防止和/或治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡，此病的免疫學(xué)特點(diǎn)是產(chǎn)生了抗自身DNA的自身抗體；抗體或其片段，包括合成肽類或相應(yīng)的核酸遺傳信息。本發(fā)明的試劑可用于防止對(duì)所述抗體的免疫反應(yīng)；抗體可以是IgG分子或其片段，然后經(jīng)由粘膜途徑施用含完整IgG或其片段作為耐受原的免疫耐受誘導(dǎo)劑以防止或降低對(duì)IgG分子的免疫反應(yīng)，患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和相關(guān)疾病的病人情況即為如此，這些疾病的特征在于存在與自身IgG分子反應(yīng)的稱為類風(fēng)濕因子的自身抗體。γ球蛋白或其片段，包括合成的肽類或相應(yīng)的核酸遺傳信息，經(jīng)由粘膜途徑施用本發(fā)明的試劑可防止或降低對(duì)所述γ球蛋白的免疫反應(yīng)，情況同靜脈注射γ球蛋白之前一樣有利；移植抗原或其片段，包括合成的肽類或相應(yīng)的核酸遺傳信息，或表達(dá)所述移植抗原的細(xì)胞，如紅血細(xì)胞、血小板或淋巴細(xì)胞，經(jīng)由粘膜途徑施用本發(fā)明的試劑可防止或降低對(duì)所述移植抗原的免疫反應(yīng)，因此可防止排異和/或延長同種異體移植體的存活期；如豚草花粉的變態(tài)反應(yīng)性物質(zhì)，經(jīng)由粘膜途徑施用本發(fā)明的試劑可防止和/或降低對(duì)所述變應(yīng)性物質(zhì)的免疫反應(yīng)，因此可預(yù)防或治療變態(tài)反應(yīng)，細(xì)菌毒素或其片段，包括合成肽類或相應(yīng)的核酸遺傳信息，經(jīng)由粘膜途徑施用本發(fā)明的試劑可防止對(duì)所述毒素的免疫反應(yīng)，該毒素是在導(dǎo)致炎癥和組織損傷的全身位點(diǎn)處遇到的；這種情況的例子是由全身施用內(nèi)毒素(由革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的一組脂多糖)和某些外毒素(如葡萄球菌腸毒素)而誘導(dǎo)的敗血癥樣中毒性休克綜合癥。在這種情況下，粘膜施用本發(fā)明試劑中與粘膜結(jié)合分子相連接的所說毒素或其片段可以避免組織損傷性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)本發(fā)明通過使用CTB和LTB作為粘膜結(jié)合分子，使用綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)和人γ-球蛋白(HGG)作為抗原/耐受原來舉例說明。而本發(fā)明不以任何方式限于抗SRBC或HGG的耐受誘導(dǎo)，這些抗原分別被選作顆粒和可溶性抗原的模型，因?yàn)樗鼈兪顷P(guān)于抗體形成和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面鑒定得最好的口服耐受的，典型的延遲型超敏(DTH)反應(yīng)使后一反應(yīng)成為代表。在自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)性反應(yīng)，移植物排異和其它炎癥疾病的產(chǎn)生中已涉及到這些類型的免疫反應(yīng)。使用髓鞘堿性蛋白質(zhì)和同種異體鼠胸腺細(xì)胞可進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，當(dāng)前者與CTB連接并經(jīng)口服時(shí)可抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦炎，后者與CTB連接并經(jīng)口服時(shí)可延長同種異體移植體的存活期。提供下列實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖顷U明本發(fā)明，而不會(huì)以任何方式限制本發(fā)明范圍。材料和方法小鼠近交的Balb/c雌性小鼠，得自瑞典。Gteborg大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及免疫學(xué)系的動(dòng)物管理所，所使用的小鼠為6-8周齡。粘膜結(jié)合分子CTB和LTB的純化在缺失霍亂毒素基因并經(jīng)編碼CTB亞單位的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的霍亂弧菌突變體菌株中生產(chǎn)重組霍亂毒素B亞單位(CTB)(SanchezJ.andHolmgrenJ.1989.RecombinantsystemforoverexpressionofcholeratoxinBsubunitinVibriocholeraeasabasisforvaccinedevelopment.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86481-485)。類似地，在缺失霍亂毒素基因并經(jīng)編碼大腸桿菌LTB的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的霍亂弧菌突變體菌株中生產(chǎn)大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素(LTB)的重組B亞單位(HirstT.R.SanchezJ.KaperJ.B.，HardyS.J.S.andHolmgrenJ.1984.MechanismoftoxinsecretionbyVibriocholeraeihvestigatedinstrainsharbouringplasmidsthatencodeheat-labileenterotoxinsofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA817752-7756)。在這些表達(dá)系統(tǒng)中，CTB和LTB以分泌蛋白質(zhì)的形式從細(xì)菌培養(yǎng)基中被回收。以每分鐘8000rev的轉(zhuǎn)速離心細(xì)菌培養(yǎng)物20分鐘，收集上清液，用稀HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5。在23℃用六偏磷酸鹽(終濃度為2.5g/l)沉淀2小時(shí)后以每分鐘8000rev的轉(zhuǎn)速離心，用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH8.0)溶解沉淀物，并對(duì)0.01M磷酸緩沖鹽水(pH7.2)透析。然后以每分鐘15000rev的轉(zhuǎn)速離心透析液以除去殘留的不溶性物質(zhì)，經(jīng)由0.22μm濾網(wǎng)(Millipore，Bedford，MA)過濾進(jìn)一步澄清上清液，最后通過SephadexG-100柱(Pharmacia，Sweden)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的凝膠過濾層析純化CTB和LTB。人γ球蛋白(HGG)的純化用(NH4)2SO4溶液(終濃度40％體積∶體積)經(jīng)順序沉淀從人血清庫中純化HGG，然后在預(yù)先經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽水(0.2M磷酸鈉，NaCl0.1M、pH8.5)平衡的SephacrylS-300HR柱(Pharmacia，Sweden)上進(jìn)行凝膠過濾層析，將所得HGG制品稀釋至15mg/ml。與CTB連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC-CTB)的制備將綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)貯存于4℃下的Alsevier氏溶液中直至使用，使用前，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(0.01M磷酸鈉、0.15MNaCl、pH7.4)以每分鐘3000rev的轉(zhuǎn)速離心10分鐘將SRBC洗滌3次，然后重新懸浮于PBS中以使細(xì)胞濃度為5×109SRBC/ml。為了便于CTB與SRBC的連接，先將SRBC與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂連接。按1∶2(體積/體積)的比例在收集的SRBC中加入含有300nmol/mlGM1神經(jīng)節(jié)苷脂(SigmaChemicalCo.，StLouis，MO)的PBS溶液，37℃下在振蕩水浴中保溫2小時(shí)。用PBS洗滌3次以除去過量GM1后，將包裹有GM1的紅細(xì)胞重新懸浮于PBS中以使細(xì)胞濃度為5×109SRBC/ml并與重組CTB(SanchezJ.andHolmgrenJ.1989RecombinantSystemforoverexpressionofcholeratoxinBsubunitinVibriocholeraeasabasisforvaccinedevelopment.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86481-485)(終濃度為50μg/ml)混合。37℃下在振蕩水浴中保溫2小時(shí)以使CTB與GM1包裹的SRBC結(jié)合，然后用PBS將紅細(xì)胞懸液洗滌兩次以除去未與細(xì)胞結(jié)合的CTB，并重新懸浮以使每mlPBS中含1×1010個(gè)細(xì)胞。為了確定CTB分子已與GM1-連接的SRBC結(jié)合并仍可以結(jié)合另外的GM1分子，可以使用固相血細(xì)胞吸附試驗(yàn)，該試驗(yàn)使用了固定于塑料孔上的GM1。用含有0.1％(重量/體積)牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的PBS將紅細(xì)胞懸液的等分試樣稀釋至終濃度為1％(收集的體積/體積)，并在塑料微量滴定析(Costar)被GM1包被的U形孔中加入該等分試樣。室溫(22℃)下保溫之后，檢測(cè)孔中血細(xì)胞吸附的出現(xiàn)。未被GM1包被的對(duì)照孔中無血細(xì)胞吸附現(xiàn)象，在與紅血細(xì)胞保溫的過程中，在被GM1包被的孔中加入無細(xì)胞CTB則可以劑量依賴的方式阻止血細(xì)胞吸附現(xiàn)象，借此可確定測(cè)定法的特異性。與LTB連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC-LTB)的制備按上述SRBC與CTB連接的方法將被GM1包被的SRBC(5×109GM1-SRBC/ml)與重組LTB(50μg/ml)連接。與CTB連接的人γ-球蛋白(HGG-CTB)的制備分別以1∶5和1∶10摩爾比將CTB和HGG與N-琥珀酰亞胺基(3-(2-吡啶基-二硫代)丙酸酯(SPDP)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)Carlsson，J.，H.Drewin，andR.Axen.1978.Proteinthiolationandreversibleprotein-proteinconjugation，N-succinimidyl3-(2-pyridyl-dithio)propionateanewheterobifunctionalreagent.Biochem.J.173723-737.1)在HGG中加入SPDP，23℃下將混合物攪拌保溫30分鐘，在經(jīng)用醋酸鹽緩沖液(0.1M醋酸鈉、0.1MNaCl、pH4.5)平衡的SephadexG-25柱上(Pharmacia，Sweden)凝膠過濾以除去過量的SPDP。23℃下用二硫蘇糖醇(DTT)(終濃度為50mM)將SPDP衍生化的HGG還原20分鐘，使所得制品流過經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽水(0.2M磷酸鈉、NaCl0.1M、pH8.5)平衡的SephadexG-25柱以除去過量的DTT以及在還原SPDP-衍生化的HGG過程中釋放的吡啶-2-硫酮。用磷酸鹽緩沖鹽水(0.2M磷酸鈉、NaCl0.1M、pH8.5)將CTB稀釋至2mg/ml，用HGG按上述但以5∶1(SPDP∶CTB)的摩爾比制備SPDP衍生化的CTB。將所得制品流過經(jīng)相同緩沖液預(yù)平衡的SephadexG-25柱以除去過量的未反應(yīng)的SPDP。以等摩爾比混合SPDP衍生化的HGG和CTB，于23℃保溫16小時(shí)。用SephacrylS-300柱凝膠過濾除去游離的CTB和/或HGG以純化所得的CTB-HGG連接物。使用ELISA顯示出所得連接物具有GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合能力并同時(shí)保留了CTB和HGG的血清學(xué)反應(yīng)性，所述ELISA使用Gm1(SigmaStLouis.MO)作為固相捕捉系統(tǒng)(Svennerholm，A.-M.andJ.Holmgren.1978.IdentificationofEscherichiacoliheat-labileenterotoxinbymeansofagangliosideimmunosorbentassay(GM1-ELISA)procedure.Curr.Microbiol.119-23。使用CTB和HGG的單克隆和多克隆抗體作為檢測(cè)試劑(見下文)。在預(yù)先被GM1神經(jīng)苷脂包被的聚苯乙烯孔以及經(jīng)抗HGG的兔多克隆IgG抗體包被的孔中將連接物與純化的CTB-和HGG-SPDP衍生物的系列兩倍稀釋物保溫，然后，依次使用與辣根過氧化物酶(HRP)連接的兔抗-HGG或鼠單克隆抗-CTB抗體(大致稀釋于含0.05％吐溫20的PBS中)以及酶底物以檢測(cè)結(jié)合于固相的HGG和CTB。參照用已知量的SPDP衍生化抗原校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線以測(cè)定游離和結(jié)合的HGG和CTB的量。一般說來，上述SPDP連接步驟和純化方法生產(chǎn)出的制品所含的游離HGG量可忽略不計(jì)，游離CTB的量低于10％。免疫方法用SRBC免疫接種首次全身免疫接種用含107SRBC的40μl無致熱原的鹽水注射小鼠的左右足墊。二次全身免疫接種首次免疫接種五天后，用含108SRBC的40μl無致熱原的鹽水注射小鼠的右后足墊以攻擊小鼠。用HGG免疫接種接種前，于63℃加熱30分鐘以聚集HGG。首次全身免疫接種將0.2ml乳化于Freund氏完全佐劑(Difco，StLouis.MO)中的聚集HGG(500μg)皮下注射到小鼠肋間以施用給小鼠。二次全身免疫接種首次免疫接種五天后，用含1mgHGG的40μl無致熱原的鹽水注射小鼠的左右足墊以攻擊小鼠?？诜褪苷T導(dǎo)方法在用SRBC首次全身免疫接種之前或之后的不同時(shí)間，將單一劑量或每天連續(xù)劑量的SRBC或SRBC-CTB施用給小鼠。每種劑量含有于0.5mlPBS中的2.5×109個(gè)SRBC或SRBC-CTB，這些劑量是通過使用嬰兒導(dǎo)管喂養(yǎng)管的胃內(nèi)途徑施用的。對(duì)照動(dòng)物僅施用0.5mlPBS。為誘導(dǎo)對(duì)HGG的耐受，可在用HGG首次全身免疫接種前一周，經(jīng)胃內(nèi)導(dǎo)管將單一口服劑量的未連接的HGG或與CTB連接的HGG施用給小鼠，所試驗(yàn)的未連接的HGG劑量為1mg和5mg，與CTB連接的HGG劑量為60μg。對(duì)延遲型超敏(DTH)反應(yīng)的評(píng)價(jià)對(duì)SRBC的DTH在用SRBC二次全身免疫接種前以及2、4、24和48h之后立即用刻度厚度測(cè)量器(Oditest.H.C.Kplin.Schluchtern.Essen.Germany)測(cè)量右足墊的厚度。通過從攻擊后不同時(shí)間所得值中減去攻擊前所得值可測(cè)定各個(gè)動(dòng)物的DTH反應(yīng)強(qiáng)度。對(duì)HGG的DTH按上述對(duì)SRBC的方式評(píng)價(jià)對(duì)注射于右足墊的HGG的DTH反應(yīng)強(qiáng)度。血清抗體反應(yīng)的評(píng)價(jià)血清抗-SRBC抗體反應(yīng)經(jīng)施用于左足墊的SRBC首次全身免疫接種之前和二次全身免疫接種1-2周后，立即從各個(gè)小鼠的尾靜脈中收集血樣并于室溫下凝集60分鐘，于56℃下加熱血清45分鐘以使補(bǔ)體失活，然后通過直接和間接血凝測(cè)定法檢測(cè)抗SRBC的抗體水平。對(duì)于直接血凝測(cè)定法，可在微量滴定板的U形底孔中用含有0.1％(重量體積)牛血清白蛋白的PBS(PBS-BSA)制備血清樣品的系列2倍稀釋液。在所有孔中加入50μl0.5％(收集體積/體積)SRBC于PBS-BSA中的懸液，將培養(yǎng)板于室溫下保溫1小時(shí)，再于4℃下保溫過夜，然后檢查孔中的血細(xì)胞凝集現(xiàn)象。為了檢測(cè)已與SRBC結(jié)合但未血凝的抗體，可在對(duì)應(yīng)于直接血凝測(cè)定法中血清稀釋液陰性的孔中加入25μl含有熱失活(56℃，45分鐘)的兔抗小鼠IgG和小鼠IgA的抗血清(最終稀釋度1∶50)混合物的PBS。然后振蕩培養(yǎng)板以使SRBC重新懸浮，并在4℃下靜止保溫2小時(shí)。再檢查孔中的血細(xì)胞凝集現(xiàn)象。測(cè)定直接導(dǎo)致或加入抗小鼠抗血清(在間接血凝測(cè)定法中)之后導(dǎo)致血凝現(xiàn)象的任何所給小鼠血清的相互最高稀釋度并將之定義為所述小鼠血清的抗-SRBC抗體的效價(jià)。血清抗-HGG抗體反應(yīng)通過標(biāo)準(zhǔn)固相ELISA測(cè)定抗HGG的血清IgM和IgG抗體水平，該ELISA使用被HGG包被的聚苯乙烯微乳作為固相捕捉系統(tǒng)，使用與HRP連接的經(jīng)親和純化的山羊抗小鼠IgG和小鼠IgM的抗體(SouthernBiotechnologyAssociates，Birmingham，AL)作為檢測(cè)試劑。用含0.05％吐溫20的PBS制備小鼠血清的系列5倍稀釋液，于23℃在被HGG包被的孔中保溫2小時(shí)，用含0.05％吐溫20的PBS洗滌5次后，加入大致稀釋的抗小鼠IgM或IgG的HRP-抗體。兩小時(shí)后，用PBS沖洗培養(yǎng)板，通過加入發(fā)色團(tuán)底物即可顯示出固相結(jié)合酶的活性，該底物含有ABTS藥片(SouthernBiotechnologyAssociates)，此藥片溶解于檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中(pH5.0并含有H2O2)。30分鐘后用自動(dòng)分光光度計(jì)(Titerscan，F(xiàn)lowLaboratories)監(jiān)測(cè)吸光值，將給出的吸光值至少兩倍于對(duì)照孔值(只暴露于緩沖液中而無血清)的相互最高稀釋度定義為鼠血清的抗-HGG抗體效價(jià)。體外淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)將得自二次全身免疫接種后1-2周的淋巴細(xì)胞于Iscove氏培養(yǎng)基(GibcoEurope.U.K.)中切碎并壓過無菌尼龍篩-目屏以產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞洗滌兩次并以2×106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮于Iscove氏培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中補(bǔ)加了5％熱滅活的胎牛血清(FBS)，L-谷氨酰胺(1％)、丙酮酸鈉(1％)、非必需氨基酸(1％)、2-疏基乙醇(5×10-5M)和慶大霉素(20μg/ml)。在含有預(yù)先滴定量SRBC(總體積為200ml)的平底微量滴定(Nunc，Denmark)孔中加入淋巴結(jié)細(xì)胞，然后于37℃在5％CO2的空氣中將培養(yǎng)板保溫3天，在最后16小時(shí)的過程中用3H胸苷(2.0mCi/mM，Amersham，Stockholm)脈沖培養(yǎng)物，使用96孔自動(dòng)細(xì)胞收集器(Inotech，Basel，Switzerland)收集各個(gè)孔中的細(xì)胞，用氬-激活的閃爍計(jì)數(shù)器(Inotech)測(cè)量放射性核苷酸的摻入。3H-胸苷摻入的水平計(jì)算為受激指數(shù)(S.I.)＝淋巴結(jié)細(xì)胞的CPM+僅僅淋巴結(jié)細(xì)胞的SRBC/CPN。實(shí)施例1口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)以預(yù)防早期和晚期延遲型超敏(DTH)反應(yīng)在給小鼠左后足墊注射SRBC的首次全身免疫接種前1至8周給小鼠喂單一劑量的SRBC-CTB、僅喂SRBC或鹽水。注射后5天，攻擊小鼠右后足墊以產(chǎn)生DTH反應(yīng)。只喂給SRBC的小鼠產(chǎn)生的DTH反應(yīng)的強(qiáng)度與只喂給鹽水的對(duì)照小鼠記錄到的強(qiáng)度差不多(表2)，相反，在所有記錄時(shí)間處，喂給與粘膜結(jié)合分子CTB連接的SRBC之小鼠記錄到的DTH反應(yīng)有相當(dāng)程度的降低，因此，用SRBC攻擊后2小時(shí)，即對(duì)應(yīng)子對(duì)照(只喂給鹽水)動(dòng)物中所見DTH反應(yīng)早期峰出現(xiàn)的時(shí)間，在預(yù)先喂給單一劑量SRBC-CTB的小鼠中未發(fā)現(xiàn)足墊腫脹。另外，與喂給鹽水的對(duì)照動(dòng)物以及僅喂給SRBC的動(dòng)物相比，攻擊后24小時(shí)的小鼠之晚期DTH反應(yīng)峰顯著降低。在第二套實(shí)驗(yàn)中，給小鼠喂單一劑量或每天連續(xù)劑量的SRBC-CTB或SRBC，最后一次口服后一周，如上所述在小鼠左足墊全身注射SRBC，5天后再在左足墊注射以致敏和攻擊動(dòng)物，已發(fā)現(xiàn)需要每天口服SRBC達(dá)3-4周才能使抑制24小時(shí)DTH反應(yīng)的水平同一服用一劑與CTB連接的SRBC所達(dá)到的水平相當(dāng)(表3)。然而應(yīng)指出在4周的期間內(nèi)用SRBC連續(xù)喂給達(dá)20次之久對(duì)DTH反應(yīng)早期(2-4小時(shí))的產(chǎn)生并無影響，這與喂給單一劑量與CTB連接的SRBC而不會(huì)產(chǎn)生早期DTH反應(yīng)的動(dòng)物中所看到的情況相反。實(shí)施例2在免疫小鼠中通過口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)以抑制早期和晚期DTH反應(yīng)為了測(cè)定粘膜施用與CTB連接的抗原是否可抑制預(yù)先被所述抗原全身致敏之動(dòng)物的DTH反應(yīng)，首先用SRBC注射小鼠的左后足墊以誘導(dǎo)首次全身免疫狀態(tài)，四天后，喂給小鼠單一口服劑量的與CTB相連接的SRBC，只喂給SRBC或鹽水。后一次喂給后兩天，第二次用SRBC注射小鼠的右足墊以產(chǎn)主DTH反應(yīng)。在再次全身免疫接種后的不同時(shí)間監(jiān)測(cè)后期的DTH反應(yīng)。僅喂給SRBC的小鼠所產(chǎn)生的DTH反應(yīng)與僅喂給鹽水的對(duì)照動(dòng)物中所見的DTH反應(yīng)沒有區(qū)別，而喂給了與CTB連接之SRBC的小鼠對(duì)SRBC的早期和晚期DTH反應(yīng)顯著降低。因此，這表明口服與CTB連接之SRBC甚至可在預(yù)先被SRBC全身致敏的動(dòng)物中誘導(dǎo)對(duì)全身注射SRBC所致的早期和晚期DTH反應(yīng)的抑制。實(shí)施例3口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)以抑制淋巴細(xì)胞增殖為了測(cè)定口服與CTB連接的抗原是否可導(dǎo)致淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)所述抗原的增殖反應(yīng)有所降低，給小鼠喂單一劑量與CTB連接的SRBC，然后用SRBC注射左足墊(首次全身體內(nèi)免疫接種)。一周后，檢查小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞體外暴露于同種抗原(SRBC)之后的增殖能力。與僅喂給鹽水的對(duì)照動(dòng)物和僅喂給單一劑量SRBC的動(dòng)物相比，得自喂給與CTB連接之SRBC的動(dòng)物的淋巴結(jié)細(xì)胞當(dāng)與SRBC一起培養(yǎng)時(shí)，增殖反應(yīng)降低(表4)。這種降低對(duì)服用的抗原而言是特異性的，因?yàn)樵谖菇oSRBC-CTB、僅喂給SRBC或鹽水的動(dòng)物中，淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)促細(xì)胞分裂劑伴刀豆球蛋白A的增殖反應(yīng)差不多(表4)。實(shí)施例4口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)以抑制血清抗體反應(yīng)為了測(cè)定口服與CTB連接的抗原是否可導(dǎo)致對(duì)全身服用抗原的抗體反應(yīng)有所降低，在用SRBC注射左后足墊以進(jìn)行首次全身免疫接種前1至8周，給小鼠喂單一劑量的SRBC-CTB、只喂SRBC或鹽水。注射后5天，攻擊小鼠的右后足墊，一周后從尾靜脈收集血液，內(nèi)直接和間接血細(xì)胞凝集試驗(yàn)測(cè)定抗SRBC的血清抗體水平。如表5所示，與僅喂給鹽水或單一劑量SRBC的動(dòng)物相比，喂給了單一劑量SRBC-CTB的動(dòng)物抗SRBC的血清抗體反應(yīng)有所降低。必需每天口服SRBC達(dá)3周才能使其抑制對(duì)全身服用SRBC的血清抗體反應(yīng)的水平同只服用與CTB連接之SRBC所能達(dá)到的水平差不多(表5)。實(shí)施例5口服與大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B亞單位(LTB)連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)以抑制早期和晚期DTH反應(yīng)為了測(cè)定粘膜服用與其它粘膜結(jié)合分子，即大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B亞單位(LTB)連接的SRBC是否也可抑制對(duì)全身服用的SRBC的DTH反應(yīng)，在用SRBC首次足墊注射前一周，給小鼠喂單一劑量的SRBC-LTB或鹽水。為進(jìn)行對(duì)比，給另一組小鼠喂SRBC-CTB，首次注射后5天，用SRBC攻擊所有小鼠的對(duì)側(cè)足墊以產(chǎn)生DTH反應(yīng)。攻擊后24小時(shí)，喂給了SRBC-LTB的小鼠與喂給鹽水的對(duì)照小鼠相比，記錄下的DTH反應(yīng)顯著降低(表6)。然而，喂給了SRBC-LTB的小鼠的早期(2-4小時(shí))DTH反應(yīng)并未降低，這與喂給了SRBC-CTB的小鼠在攻擊后2-4小時(shí)無DTH反應(yīng)而在24-48小時(shí)DTH反應(yīng)顯著降低的情況相反(表6)。這些研究成果表明口服與LTB連接的SRBC可誘導(dǎo)對(duì)全身注射的SRBC之晚期DTH反應(yīng)的抑制，但不會(huì)影響這種反應(yīng)的早期成分。實(shí)施例6口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的HGG以抑制對(duì)人γ球蛋白(HGG)的早期和晚期延遲型超敏(DTH)反應(yīng)為了測(cè)定經(jīng)粘膜施用與CTB連接的抗原是否可抑制對(duì)可溶性蛋白質(zhì)抗原的DTH反應(yīng)，在使用于Freund氏完全佐劑中的HGG皮下注射以進(jìn)行首次全身免疫接種前一周，給各組小鼠喂單一劑量與CTB連接的HGG，僅喂HGG或鹽水。此次注射后5天，用HGG攻擊小鼠右后足墊以產(chǎn)生DTH反應(yīng)。攻擊后的檢查的所有時(shí)間處，僅喂給1mgHGG的小鼠所產(chǎn)生DTH反應(yīng)的強(qiáng)度與僅喂給鹽水的對(duì)照小鼠差不多(表7)。喂給小鼠5mgHGG可在24-48小時(shí)處導(dǎo)致DTH反應(yīng)降低但不會(huì)影響這些反應(yīng)早期(2-4小時(shí))相的強(qiáng)度。與此相反，在僅喂給15μg與CTB連接之HGG(比HGG的量低300多倍)的小鼠中監(jiān)測(cè)到的DTH反應(yīng)具有類似的效果，它在24小時(shí)處而不是在早期時(shí)間(2和4小時(shí))處比對(duì)照(喂給鹽水)動(dòng)物的相應(yīng)反應(yīng)低很多。然而，給小鼠喂66μg與CTB連接的HGG可在所有記錄時(shí)間處導(dǎo)致顯著降低的DTH反應(yīng)，因此，在喂給了66μg與CTB連接的HGG的小鼠中有效抑制了早期(2-4小時(shí))和晚期(24-48小時(shí))DTH反應(yīng)。這些研究成果表明口服少量與粘膜結(jié)合分子CTB連接的可溶性蛋白質(zhì)抗原可誘導(dǎo)對(duì)隨后用所述蛋白質(zhì)抗原全身注射所產(chǎn)生的早期和晚期DTH反應(yīng)的抑制。實(shí)施例7口服與CTB連接的髓鞘堿性蛋白質(zhì)以抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦炎(EAE)。髓鞘堿性蛋白質(zhì)(MBP)的純化如Deibler等人所述(DeiblerGE.MartensonRE.KiesMW.1972，Largescalepreparationofmyelinbasicproteinfromcentralnervoustissueofseveralmammalianspecies，Prep.Biochem.2139-165)由豚鼠的脊髓和腦制得MBP。通過在約20kD處顯現(xiàn)單一的標(biāo)準(zhǔn)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定MBP的純度，在類似于已描述的HGG與CTB連接的條件下，使用SPDP法將MBP與CTB連接。通過GM1-ELISA確證連接物中MBP的存在，該ELISA使用的血清來自被FCA中的MBP免疫的大鼠。使用標(biāo)準(zhǔn)固相夾心ELISA(對(duì)于MBP)和GM1-ELISA(對(duì)于CTB)將所試驗(yàn)的CTB和MBP純化制品一一進(jìn)行比較即可測(cè)定連接物中MBP和CTB的相對(duì)比例，這兩種EISA分別使用抗-MBP和GM1作為固相捕捉試劑，分別使用與HRP連接的大鼠抗-MBP抗血清和小鼠抗-CTB單克隆抗體以檢測(cè)捕捉到的MBP和CTB。實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦炎(EAE)的誘導(dǎo)為誘導(dǎo)EAE(KiesMW.MurphyJB.AlvordEC.1960，F(xiàn)ractonationofguineapigproteinswithencephalitogenicactivity.Fed.Proc.19207)，可在乙醚麻醉下，用總量為100微克且乳化于Freund氏完全佐劑(FCA)(Difco，Detroit，MI.USA)(1∶1.體積∶體積)中的豚鼠MBP注射8-10同齡(體重為170-240g)的雌性路易斯大鼠(ZentralInstitutfürVersuchstierzucht，Hannover，Germany)的兩只后足墊(大約有50微克MBP經(jīng)過足墊)。此次注射后，每天對(duì)動(dòng)物如此注射達(dá)30天。每隔兩天，檢查動(dòng)物臨床癥狀的出現(xiàn)及其測(cè)定的體重。使用標(biāo)準(zhǔn)臨床分級(jí)系統(tǒng)測(cè)定疾病的強(qiáng)度(MillerA.Lider0.AlsabbaghA.WeinerHL.1992，Suppressionofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisbyoraladministrationofmyelinbasicprotein.V.Hierarchyofsuppressionbymyelinbasicproteinfromdifferentspecies，J.Neuroimmunol.39243-250)0級(jí)無疾病1級(jí)尾部無力2級(jí)輕微的后肢麻痹3級(jí)嚴(yán)重的后肢麻痹伴有四肢外張4級(jí)影響到全部四只足墊的完全后肢麻痹5級(jí)死亡口服耐受方法在足墊注射MBP以誘導(dǎo)EAE之前，給各組動(dòng)物施予下列試劑組1在足墊注射MBP(指的是第0天)前的第-7天給動(dòng)物施用0.5mlMBP-CTB連接物，其相當(dāng)于溶于0.6M碳酸氫鹽緩沖液中的20微克MBP和100微克CTB；組2在足墊注射MBP前的5個(gè)連續(xù)的時(shí)間，即第-11天、第-9天、第-7天、第-5天，第-3天，給動(dòng)物施用0.5ml含有5mgMBP和10mg大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)的0.6M碳酸氫鹽緩沖液以使對(duì)MBP的蛋白酶裂解降解的程度最低(WhitacreCC.GienapIE.OroszCG，BitarD.1991，Oraltoleranceinexperimentalautoimmuneencephalitis，III.Evidenceforclonalanergy.J.Immunol.1472155-63)組3按照組2限定的時(shí)間表，在5個(gè)連續(xù)的時(shí)間給動(dòng)物施用0.5ml鹽水(對(duì)照)；組4按照組2限定的時(shí)間表，在5個(gè)連續(xù)的時(shí)間給動(dòng)物施用0.5ml只含有10mg大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)的0.6M碳酸氫鹽緩沖液(對(duì)照)?？诜cCTB連接的MBP以抑制EAE用乳化于FCA的MBP或僅用FCA注射動(dòng)物組的后足墊，這些組各包括5只成年雌性路易斯大鼠。在足墊注射MBP＋FCA前11、9、7、5和3天，預(yù)先用大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)喂養(yǎng)的對(duì)照動(dòng)物(組4)，注射后12至14天所出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀最嚴(yán)重，所有動(dòng)物都出現(xiàn)嚴(yán)重的麻痹現(xiàn)象(表8)。以單一劑量喂給少量20微克與CTB相連接之MBP的動(dòng)物(組1)不出現(xiàn)(5只大鼠中的4只)或僅出現(xiàn)輕微的癥狀(在另一只大鼠中出現(xiàn)的與右后足墊輕癱相關(guān)的短暫尾部輕癱)(表8)。在5個(gè)連續(xù)時(shí)間喂給5mgMBP與STI的動(dòng)物(MBP的總量為25mg，比組1動(dòng)物MBP的劑量高1250倍)也不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的EAE病(組2)(表8)。因此，口服少量與CTB連接的MBP可抑制EAE。實(shí)施例8口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的同種異體胸腺細(xì)胞以延長鼠同種異體移植的存活期鼠胸腺細(xì)胞與CTB的連接為增強(qiáng)CTB與鼠淋巴細(xì)胞的結(jié)合，首先于37℃下將5×107個(gè)胸腺細(xì)胞與10nmolGM1神經(jīng)節(jié)苷脂在總體積為0.5ml的Iscove氏最低必需培養(yǎng)基(IMEM)中混合2小時(shí)，從而使C57BL/6小鼠(主要組織相容性復(fù)合體(MHC)單倍體型H-2b)的胸腺細(xì)胞與GM1神經(jīng)節(jié)苷脂衍生化。然后用無致熱原的無菌鹽水將細(xì)胞洗滌3次以除去未結(jié)合的GM1，37℃下以0.5ml的總體積與25微克CTB一起再保溫2小時(shí)。最后用鹽水洗滌細(xì)胞以除去未結(jié)合的過量CTB，保存于冰上直至使用。通過對(duì)與不同量GM1衍生化并暴露于不同濃度經(jīng)四甲基若丹明-標(biāo)記的CTB(ListBiologicalLaboratoriesInc.，Campbell，CA.USA)中的鼠胸腺細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，測(cè)定出所需GM1和CTB的濃度應(yīng)能使胸腺細(xì)胞達(dá)到最大飽和量。異位鼠心臟移植從新生(出生后不超過36小時(shí))C57BL/6小鼠中收集供體心臟并沿著室間隔切開，將心臟的各一半插入6至8周齡Balb/c小鼠(MHC單元型H-2d)的一只耳或兩只耳背側(cè)部分的皮下囊處。為了進(jìn)行比較，各組Balb/c受體小鼠接受同系Balb/c新生小鼠的心臟。每天用Tektronix心臟鏡測(cè)量移植物的電活性以評(píng)價(jià)移植體功能。排異時(shí)間被定義為心肌收縮完全停止已發(fā)生的那一天?？诜褪艿姆椒ㄍN異體移植植入之前和/或之后的不同時(shí)間，用嬰兒導(dǎo)管式喂養(yǎng)管給成年Balb/c受體小鼠喂體積為0.5ml的無致熱原鹽水，它可含有——在移植前3天和移植后1和4天，施予新生C57BL/6小鼠的未連接的胸腺細(xì)胞；——在移植前7、4和1天施予新生C57BL/6小鼠的未連接的胸腺細(xì)胞；——在移植前7、4和1天施予新生C57BL/6小鼠的與CTB連接的胸腺細(xì)胞；——在移植前片刻(30-60分鐘)施予新生C57BL/6小鼠的與CTB連接的胸腺細(xì)胞；——或僅施予鹽水?？诜c霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的同種異體胸腺細(xì)胞以延長鼠異位心臟同種異體移植的存活期在H-2位點(diǎn)處接受了組織不相容的新生C57BL/6供體小鼠之異位心臟移植的Balb/c小鼠平均在8天內(nèi)即對(duì)它們的移植物排異(表9)，與此相反，接受了H-2組織相容性心臟移植的小鼠可將有功能的移植物保持2個(gè)多月。在植入同種異體移植心臟前(-7、-4和-1天)和/或后(-3、+1和+4)口服作為供體小鼠的同種新生H-2組織不相容性小鼠的胸腺細(xì)胞不會(huì)延長，在某些情況下甚至?xí)档虰alb/c小鼠受體的移植存活期(表9)。與此相反，在同種異體植入前(-7、-4和-1天)口服3劑量與CTB連接的胸腺細(xì)胞，則基本上可提高(平均為56％)心臟移植的存活率(表9)。而且，在移植前立即施用單一口服劑量的與CTB連接的C57BL/6胸腺細(xì)胞可在同種異體必臟移植的受體小鼠中延長(平均為39％)移植物存活期(表9)。總之，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明口服與CTB連接的組織不相容性淋巴細(xì)胞可延長同種異體移植的存活期。表2.口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)以防止早期和晚期延遲型超敏反應(yīng)星號(hào)表示試驗(yàn)組(每組6只動(dòng)物)和包括僅喂給鹽水的動(dòng)物(7只小鼠)的對(duì)照組所測(cè)定的值之間有顯著差異*p＜0.05，**p＜0.01(Student′t檢驗(yàn))表3.在免疫小鼠中通過口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)以抑制早期和晚期DTH反應(yīng)<p>星號(hào)表示試驗(yàn)組(每組6只動(dòng)物)和包括攻擊前用SRBC致敏但僅喂給鹽水的動(dòng)物對(duì)照組(6只小鼠)所測(cè)定的值之間有顯著差異*p＜0.05，**p＜0.01(Student′t試驗(yàn))表4.口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)以抑制抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖<*表示給SRBC-CTB的試驗(yàn)動(dòng)物和僅喂給SRBC或僅喂給鹽水的動(dòng)物之間有顯著的差異(p＜0.01；Student′t試驗(yàn))表5.口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的SRBC之后可抑制對(duì)SRBC的血清抗體反應(yīng)<*表示給SRBC-CTB的試驗(yàn)動(dòng)物(n＝6只小鼠)和僅喂給SRBC(n＝6只小鼠)或鹽水(n＝5只小鼠)的動(dòng)物之間有顯著的差異(p＜0.001；Student′t試驗(yàn))表6.口服與大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素B亞單位(LTB)連接的綿羊紅血細(xì)胞(SRBC)以防止晚期延遲型超敏反應(yīng)<>星號(hào)表示試驗(yàn)組(每組7只小鼠)和僅喂給鹽水的對(duì)照動(dòng)物(n＝6只小鼠)之間有顯著的差異*p＜0.05，**p＜0.01(Student′t試驗(yàn))表7.口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的人γ-球蛋白(HGG)以防止早期和晚期延遲型超敏反應(yīng)ξ皮下注射0.5mg于Freund氏完全佐劑中的熱一聚集HGG以使動(dòng)物致敏，用1mg于鹽水中的HGG注射右足墊以攻擊動(dòng)物。星號(hào)表示試驗(yàn)組(組I-IV，n＝每組6只小鼠)和僅喂給鹽水的對(duì)照動(dòng)物(組V，n＝6只小鼠)之間有顯著的差異*p＜0.05，**p＜0.01(Student′t試驗(yàn))表8.口服與CTB連接的髓鞘堿性蛋白質(zhì)以抑制路易斯大鼠的實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦炎(EAE)a)臨床級(jí)別≥2表9.口服與霍亂毒素B亞單位(CTB)連接的同種異體胸腺細(xì)胞以延長鼠異位心臟同種異體移植的存活期a在標(biāo)明的時(shí)間給成年Balb/c小鼠受體喂5×107個(gè)新生胸腺細(xì)胞或與CTB連接的胸腺細(xì)胞(每只小鼠25μg)，在第0天使小鼠接受心臟移植。b按下列方法計(jì)算移植存活期的相對(duì)增長(喂給了胸腺細(xì)胞之小鼠的平均排異時(shí)間減去喂給了鹽水之對(duì)照小鼠的平均排異時(shí)間，其差值除以喂給了鹽水之對(duì)照小鼠的平均排異時(shí)間)×100。從上述實(shí)施例可明顯看出本發(fā)明的免疫耐受誘導(dǎo)劑可有效抑制對(duì)全身免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)并可防止其表達(dá)。另外，該試劑還可使口服誘導(dǎo)耐受化的已報(bào)道方法所必需的抗原/耐受原的絕對(duì)量和/或劑量的數(shù)目降至最低。從上述實(shí)施例可推斷出，使用本發(fā)明的免疫耐受誘導(dǎo)劑可預(yù)防或延遲與延遲型超敏反應(yīng)的早期和晚期相相關(guān)的炎癥免疫反應(yīng)、自身免疫疾病(實(shí)施例8)和同種異體移植排異(實(shí)施例9)的產(chǎn)生。權(quán)利要求1.免疫耐受誘導(dǎo)劑，它包含與特異耐受原相連接的粘膜結(jié)合分子。2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，其中所述粘膜結(jié)合分子選自衍生于細(xì)菌毒素的粘膜結(jié)合結(jié)構(gòu)、細(xì)菌菌毛、病毒粘附蛋白質(zhì)和植物凝集素的粘膜結(jié)合分子。3.根據(jù)權(quán)利要求2的試劑，其中所述細(xì)菌毒素的粘膜結(jié)合結(jié)構(gòu)選自包含霍亂毒素和大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素的組中。4.權(quán)利要求3的試劑，其中所述粘膜結(jié)合結(jié)構(gòu)是毒素的結(jié)合片段。5.根據(jù)權(quán)利要求4的試劑，其中所述毒素的結(jié)合片段是霍亂毒素或大腸桿菌熱不穩(wěn)定性腸毒素的B亞單位。6.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，其中所述特異耐受原選自特異抗原，包括半抗原，它可導(dǎo)致個(gè)體中不希望的免疫反應(yīng)。7.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑，其中所述不希望的免疫反應(yīng)與全身抗體的產(chǎn)生相關(guān)。8.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑，其中所述不希望的免疫反應(yīng)與延遲型超敏反應(yīng)相關(guān)。9.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑，其中所述不希望的免疫反應(yīng)與自身免疫疾病、變應(yīng)性疾病、組織或細(xì)胞移植排異事件和/或急性或慢性炎癥反應(yīng)或疾病相關(guān)。10.根據(jù)權(quán)利要求6的試劑，其中所述抗原選自包含蛋白質(zhì)、肽類、糖類、脂類和核酸的組中。11.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑，其中所述耐受原和所述粘膜結(jié)合分子直接或間接相互連接。12.根據(jù)權(quán)利要求11的試劑，其中所述耐受原和所述粘膜結(jié)合分子在下組成員之一的幫助下間接地相互連接，該組包含間隔分子，含有所述耐受原/抗原(包括半抗原)的保護(hù)性載體或所述間隔分子與所述耐受原/抗原(包括半抗原)的雜合分子，該雜合分子可以經(jīng)表達(dá)融合基因或核苷酸序列得到。13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑，其中所述間隔分子選自對(duì)所述耐受原或含有耐受原的載體以及所述粘膜結(jié)合分子中任一者或兩者具有結(jié)合親和力的分子。14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑，其中所述間隔分子是抗體。15.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑，其中所述間隔分子是或衍生于GM1神經(jīng)節(jié)苷脂、半乳糖基-N-乙?；?氨基半乳糖基-(唾液酸)-半乳糖基葡糖神經(jīng)酰胺的霍亂毒素結(jié)合結(jié)構(gòu)。16.在抗特異性抗原，包括半抗原的個(gè)體中誘導(dǎo)免疫耐受的方法，所述抗原在所述個(gè)體中可引起不希望的免疫反應(yīng)，該方法包括經(jīng)粘膜途徑給所述個(gè)體用免疫有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的試劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種免疫耐受誘導(dǎo)劑，它包含與特異性耐受原相連接的粘膜結(jié)合分子，另外，本發(fā)明還描述了在抗特異性抗原(包括半抗原)的個(gè)體中誘導(dǎo)免疫耐受的方法，該抗原在所述個(gè)體中可導(dǎo)致不希望的免疫反應(yīng)，該方法包括通過粘膜途徑給所述個(gè)體施用免疫有效量的本發(fā)明的免疫耐受誘導(dǎo)劑。文檔編號(hào)A61K39/385GK1135182SQ94194189公開日1996年11月6日申請(qǐng)日期1994年10月7日優(yōu)先權(quán)日1993年10月8日發(fā)明者J·霍姆格倫,C·切爾金斯基申請(qǐng)人:多托爾公司