專利名稱：組織工程支架用多孔材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學材料領(lǐng)域，特別涉及一種適用于組織工程支架的多孔材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前已開發(fā)應(yīng)用于組織工程的生物可降解多孔材料，主要有聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)和膠原蛋白等。但合成材料(PLA、PGA等)在生物相容性、理化性能、降解速率的控制及緩釋性等方面尚有許多問題未得到解決，且合成工藝較復(fù)雜。天然材料中的膠原蛋白雖然自身就包含著許多生物信息，能夠使細胞維持或產(chǎn)生許多功能，但特定種類的膠原蛋白提純工作較煩瑣，質(zhì)量控制較困難，且能否完全避免抗原的影響和疾病的傳播尚待觀察。
研究表明，蠶絲中含有約75％的絲素和25％的絲膠，它們是蠶在絹絲腺內(nèi)分泌出的天然蛋白質(zhì)，由18種氨基酸殘基所組成，各項試驗結(jié)果顯示，蠶絲蛋白無毒性、無刺激性，具有良好的生物相容性，是制造生物醫(yī)用材料的較理想原料。在本發(fā)明作出之前，中國專利CN1260363A“一種多孔絲素膜及其制備方法”公開了一種以家蠶絲素蛋白為原料，采用冷凍干燥法制備多孔絲素膜的技術(shù)。該方法是先將家蠶絲經(jīng)脫膠、溶解、透析、提純后得到純絲素蛋白溶液；在上述溶液中加入添加劑，其中含10～60％的CH2CH(OH)CH2OH等、10～60％的CH3CH2(OH)CH(NH2)COOH等，其余為環(huán)氧化物等作為交聯(lián)劑，制成制備用混合溶液，將其注入到模具內(nèi)，在-4～-85℃的溫度下冷凍10min～24h，再進行真空干燥，真空干燥的前5～24h溫度設(shè)定在-4～-40℃范圍內(nèi)，其后的真空干燥過程中，每小時升溫1～10℃至室溫，即可得到該發(fā)明所述的絲素蛋白多孔膜。從結(jié)構(gòu)上來看，由于絲素為纖維狀蛋白，因此，用絲素制備的多孔膜在作為組織工程支架材料使用時，其生物降解的速度較慢。當組織再生速度較快時，要求支架材料較快地被降解吸收，否則可能影響新生組織的形態(tài)和功能，而當組織再生速度較慢時，支架材料應(yīng)該具有積極引導、促進細胞生長成規(guī)范組織的能力，從而加快組織修復(fù)速度，此時，支架材料被降解吸收的速度也需同時加快，以便與組織再生速度相適應(yīng)，因此，單純用絲素制備的多孔材料，其生物降解速度就很難適應(yīng)組織再生速度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對已有技術(shù)的不足，提供一種可控制生物降解速度、并能促進細胞粘附和生長的組織工程支架用多孔材料及其制備方法。
本發(fā)明所述的組織工程支架用多孔材料，是含有家蠶絲素蛋白的塊狀或膜狀物，內(nèi)部平均孔密度為1～3000個/mm2，平均孔徑為1～500μm，其特征在于它還含有家蠶絲膠蛋白、柞蠶絲素蛋白；孔內(nèi)含有以絲膠蛋白為壁材的細胞生長因子緩釋微膠囊。
制備本發(fā)明所述的組織工程支架用多孔材料的方法，將家蠶絲脫膠、溶解、提純后得到家蠶絲素水溶液，在濃縮的絲素溶液中加入添加劑后成為制備用混合原液，將該原液冷凍干燥，其特征在于還包括如下步驟(1)制備家蠶絲膠蛋白、柞蠶絲素蛋白加入到制備用混合原液中，在30～90℃溫度條件下以大于500轉(zhuǎn)/分的速度攪拌均勻后，立即在-15～-85℃溫度條件下冷凍，再經(jīng)冷凍干燥后制成蠶絲蛋白多孔體；(2)制備以絲膠蛋白為壁材的細胞生長因子緩釋微膠囊，注入上述多孔體的孔內(nèi)制成組織工程支架用蠶絲蛋白多孔材料。
以上所述的柞蠶絲素蛋白制備方法是用濃度為5～12M的硫氰化鋰，浴比為1∶5～1∶500，在20～100℃的溫度條件下溶解柞蠶絲素纖維，經(jīng)透析后制得分子量為0.35～1.50萬的柞蠶絲素蛋白水溶液。
以上所述的制備以絲膠蛋白為壁材的細胞生長因子緩釋微膠囊的方法是(1)將濃度為0.01～0.20g/ml的絲膠水溶液預(yù)熱至40～80℃，逐滴滴入已預(yù)熱至40～80℃的植物油中，邊滴邊以200～2000轉(zhuǎn)/分的速度攪拌，冷卻后以100～1500轉(zhuǎn)/分的速度攪拌待絲膠凝膠；再在上述溶液中加入有機溶劑，經(jīng)離心分離、交聯(lián)、干燥后得到絲膠蛋白微球；(2)將細胞生長因子溶液滴入干燥的絲膠蛋白微球，制得以絲膠蛋白為壁材的細胞生長因子緩釋微膠囊。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的組織工程用多孔材料具有以下顯著優(yōu)點
(1)柞蠶絲素蛋白的一級結(jié)構(gòu)中含Arg-Gly-Asp序列等生物信息，與細胞有特異相互作用，故在多孔材料中加入了柞蠶絲素蛋白后能促進細胞的粘附；(2)多孔材料內(nèi)注入了細胞生長因子緩釋微膠囊，所以，能引導、促進細胞沿支架增殖、生長；(3)絲膠蛋白為球狀結(jié)構(gòu)，較易被生物降解，因而，可通過調(diào)節(jié)材料內(nèi)絲膠與絲素蛋白的質(zhì)量比，來實現(xiàn)控制其降解速度與新生組織的再生速度相適應(yīng)的目的。
(4)由于采用了對制備用混合原液快速攪拌、快速冷凍的方法，使溶液中無規(guī)線團結(jié)構(gòu)的絲素、絲膠大分子充分伸展，混合均勻，并將此狀態(tài)快速固定，解決了蠶絲蛋白多孔材料內(nèi)絲素相與絲膠相分離的問題，使材料的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和性能均勻化。
具體實施例方式
實施例一1.家蠶繭經(jīng)剝繭、切剖、去蛹得到繭層，將1公斤清潔的家蠶繭層用自來水充分洗滌后，再用去離子水洗滌3次，放入20升去離子水中，于98～100℃處理40分鐘使絲膠溶解，過濾后得到濃度為1.5％絲膠水溶液，并取部分絲膠水溶液冷凍干燥后得到固體絲膠。
2.將1公斤家蠶絲放入10升濃度為0.025％的碳酸鈉水溶液中，煮沸0.5小時，重復(fù)處理三次，脫盡蠶絲外圍的絲膠，得到純絲素纖維；將晾干后的絲素纖維，用10升摩爾比為1∶8∶2的氯化鈣、水、乙醇溶液，在78±2℃下加熱溶解成絲素蛋白混合溶液；用纖維素膜為透析材料，將所得的絲素蛋白混合溶液用水進行透析，以去除氯化鈣，乙醇等雜質(zhì)，再用多層脫脂紗布過濾，得到純的絲素蛋白溶液；純絲素溶液維持在35℃下，邊攪拌邊使其蒸發(fā)濃縮。
3.向鋁合金模具內(nèi)注入濃度為3％的添加劑，在-16℃下預(yù)凍2小時。
4.將絲膠水溶液、絲素水溶液按80∶20的比例混合，加入添加劑后制成制備用混合原液，將該混合原液在75±2℃的溫度條件下以1700轉(zhuǎn)/分的速度攪拌均勻后，立即注入上述鋁合金模具內(nèi)，厚度為10mm，于-16℃溫度下快速冷凍2小時。
5.將上述冷凍體連同模具，置于冷凍干燥機內(nèi)減壓干燥，干燥過程的前24小時，溫度恒定于-16℃，其后每小時升溫2℃直至室溫，干燥完成后從鋁合金模具內(nèi)取出即為塊狀的家蠶絲蛋白多孔體。
6.制備濃度為0.025g/ml的絲膠水溶液，預(yù)熱至70℃后，逐滴滴入2000ml已預(yù)熱至70℃的橄欖油中，邊滴邊以1000轉(zhuǎn)/分的速度攪拌15分鐘，溫度維持在70℃，得到油包水乳液。將乳液冷卻至30℃，以300轉(zhuǎn)/分的速度攪拌60分鐘，使絲膠凝膠化。在上述溶液中加入700ml丙酮，繼續(xù)以300轉(zhuǎn)/分的速度攪拌60分鐘，離心分離，用異丙醇洗滌，在濃度為1％的戊二醛溶液中浸漬1小時使其交聯(lián)，冷凍干燥后得到絲膠蛋白微球。將堿性成纖維細胞生長因子bFGF溶液滴入干燥的絲膠蛋白微球，室溫放置60分鐘，使bFGF滲入微球內(nèi)，制得以絲膠蛋白為壁材的bFGF緩釋微膠囊。
7.適量的生理鹽水使bFGF緩釋微膠囊膨潤后，注入家蠶絲蛋白多孔體內(nèi)，制得含bFGF緩釋微膠囊的家蠶絲蛋白多孔材料。
在本實施例的制備用混合原液中，也可加入適量的柞蠶絲素蛋白溶液(柞蠶絲素蛋白溶液的制備方法參見實施例二步驟1、2)。柞蠶絲素、家蠶絲膠、家蠶絲素三者可以任意比例混合后制成制備用混合原液，其比例可根據(jù)該多孔材料用于組織工程支架時所要求的對細胞的粘附性、降解速度及物理性能來決定。柞蠶絲素蛋白的比例越高，材料對細胞的粘附性越好；絲膠蛋白的比例越高，生物降解速度越快；家蠶絲素蛋白的比例越高，材料的形態(tài)穩(wěn)定性等物理性能越好。因此，改變多孔材料內(nèi)絲膠、柞蠶絲素、家蠶絲素的比例，可達到控制其生物降解速度、對細胞的粘附性及材料的物理性能的目的，使其適應(yīng)于不同組織再生的需要。按本實施例方法制備的蠶絲蛋白多孔材料，其主要結(jié)構(gòu)、性能見表一。
實施例二1.將0.5公斤中國柞蠶絲放入10升濃度為0.5％的碳酸鈉水溶液中，煮沸0.5小時，重復(fù)處理三次，脫盡柞蠶絲外圍的絲膠，得到柞蠶絲素纖維。
2.用濃度為9M的硫氰化鋰，于溫度40℃，浴比1∶20溶解柞蠶絲得到混合溶液；將上述溶液對水透析4晝夜，透析材料為截留分子量為1.10萬的纖維素膜，得到純柞蠶絲素蛋白水溶液；將上述純柞蠶絲素溶液維持在40℃下，邊攪拌邊進行蒸發(fā)濃縮，使溶液含固率達到10.0％。
3.0.5公斤清潔的繭層用水充分洗滌后，放入12升去離子水中，于98～100℃溫度條件下處理60分鐘，使絲膠溶解，過濾后得到濃度為絲膠水溶液。
4.向不銹鋼模具內(nèi)注入濃度為1.5％的添加劑，在-40℃下預(yù)凍6小時。
5.將濃縮的柞蠶絲素溶液與絲膠水溶液按50∶50的比例混合，加入添加劑后制成制備用混合原液，使混合溶液的溫度維持在40±2℃的同時，以1000轉(zhuǎn)/分的速度快速攪拌溶液60分鐘，隨后注入上述不銹鋼模具內(nèi)，厚度為0.5mm，于-40℃溫度下快速冷凍6小時。
6.將上述冷凍體連同不銹鋼模具，置于冷凍干燥機內(nèi)真空干燥，干燥過程的前18小時，溫度恒定于-20℃，其后每小時升溫2℃，直至室溫，取出即為膜狀的蠶絲蛋白多孔體。
7.制備濃度為0.05g/ml的絲膠水溶液，將其預(yù)熱至60℃后，逐滴滴入已預(yù)熱至60℃的橄欖油中，邊滴邊以400轉(zhuǎn)/分的速度攪拌15分鐘，溫度維持在60℃，得到油包水乳液。將該水乳液冷卻至20℃，以250轉(zhuǎn)/分的速度攪拌60分鐘，使絲膠凝膠化。在上述溶液中加入500ml丙酮，繼續(xù)以250轉(zhuǎn)/分的速度攪拌60分鐘，離心分離，用異丙醇洗滌8次，在濃度為75％的乙醇溶液中浸漬1小時使其交聯(lián)，冷凍干燥后得到絲膠蛋白微球。將堿性成纖維細胞生長因子bFGF溶液滴入干燥的絲膠蛋白微球，室溫放置60分鐘，使bFGF滲入微球內(nèi)，制得以絲膠蛋白為壁材的bFGF緩釋微膠囊。
8.適量的生理鹽水使bFGF緩釋微膠囊膨潤后，注入蠶絲蛋白多孔膜內(nèi)，制得含bFGF緩釋微膠囊的蠶絲蛋白多孔材料。
在本實施例的制備用混合原液中，也可根據(jù)需要按比例加入如實施例一的方法制備的家蠶絲素蛋白。按本實施例方法制備的蠶絲蛋白多孔膜的主要結(jié)構(gòu)、性能見表二。
表一 家蠶絲蛋白多孔材料的主要結(jié)構(gòu)、性能

表二柞蠶絲蛋白多孔材料的主要結(jié)構(gòu)、性能

權(quán)利要求
1.一種組織工程支架用多孔材料，是含有家蠶絲素蛋白的塊狀或膜狀物，內(nèi)部平均孔密度為1～3000個/mm2，平均孔徑為1～500μm，其特征在于它還含有家蠶絲膠蛋白、柞蠶絲素蛋白；孔內(nèi)含有以絲膠蛋白為壁材的細胞生長因子緩釋微膠囊。
2.一種制備組織工程支架用多孔材料的方法，將家蠶絲脫膠、溶解、提純后得到家蠶絲素水溶液，在濃縮的絲素溶液中加入添加劑后成為制備用混合原液，將該原液冷凍干燥，其特征在于還包括如下步驟(1)制備家蠶絲膠蛋白、柞蠶絲素蛋白加入到制備用混合原液中，在30～90℃溫度條件下以大于500轉(zhuǎn)/分的速度攪拌均勻后，立即在-15～-85℃溫度條件下冷凍，再經(jīng)冷凍干燥后制成蠶絲蛋白多孔體；(2)制備以絲膠蛋白為壁材的細胞生長因子緩釋微膠囊，注入上述多孔體的孔內(nèi)，制成組織工程支架用蠶絲蛋白多孔材料。
3.如權(quán)利要求2所述的一種制備組織工程支架用多孔材料的方法，其特征在于所述的柞蠶絲素蛋白制備方法是用濃度為5～12M的硫氰化鋰，浴比為1∶5～1∶500，在20～100℃的溫度條件下溶解柞蠶絲素纖維，經(jīng)透析后制得分子量為0.35～1.50萬的柞蠶絲素蛋白水溶液。
4.如權(quán)利要求2所述的一種制備組織工程支架用多孔材料的方法，其特征在于所述的制備以絲膠蛋白為壁材的細胞生長因子緩釋微膠囊的方法是(1)將濃度為0.01～0.20g/ml的絲膠水溶液預(yù)熱至40～80℃，逐滴滴入已預(yù)熱至40～80℃的植物油中，邊滴邊以200～2000轉(zhuǎn)/分的速度攪拌，冷卻后以100～1500轉(zhuǎn)/分的速度攪拌待絲膠凝膠；再在上述溶液中加入有機溶劑，經(jīng)離心分離、交聯(lián)、干燥后得到絲膠蛋白微球；(2)將細胞生長因子溶液滴入干燥的絲膠蛋白微球，制得以絲膠蛋白為壁材的細胞生長因子緩釋微膠囊。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學材料領(lǐng)域，特別涉及一種組織工程支架用多孔材料及其制備方法。它以從家蠶絲、柞蠶絲中分別溶解、提純得到的絲膠和絲素為主要原料，按適當比例混合、在一定溫度下快速攪拌、冷凍后，采用冷凍干燥法加工成塊狀或膜狀多孔體，并在其孔內(nèi)注入細胞生長因子緩釋微膠囊。它不僅具備良好的生物相容性，還能引導、促進細胞的粘附和生長，可調(diào)節(jié)生物降解速度，適用于細胞培養(yǎng)基質(zhì)及皮膚、硬腦膜、軟骨等組織修復(fù)材料。
文檔編號A61L27/22GK1397354SQ02138129
公開日2003年2月19日 申請日期2002年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月14日
發(fā)明者李明忠, 吳徵宇 申請人:蘇州大學