專(zhuān)利名稱(chēng)：低hdl血癥改善劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到以半胱氨酸蛋白酶抑制劑為有效成分的低HDL血癥改善劑和由該低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑。
背景技術(shù)：
HDL(high-density lipoprotein；高密度脂蛋白)主要在肝臟和小腸上皮細(xì)胞合成、分泌的。剛分泌的HDL是以脫輔蛋白A-I(也稱(chēng)之為apoAI)和磷脂為主要成分的圓盤(pán)狀粒子，也稱(chēng)之為原始HDL。該HDL在血中接受來(lái)自末梢細(xì)胞的細(xì)胞膜的、或其他脂蛋白水解過(guò)程中生成的游離膽固醇，通過(guò)LCAT(lecithin cholesterol acyltransferase，卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶)的作用，一邊以膽固醇酯保持在疏水性中心部，一邊向球狀HDL成熟。
在于血液中獲取來(lái)自末梢組織的多余的膽固醇，將它轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟的稱(chēng)為“膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)”的脂代謝中，HDL對(duì)極其重要的生理功能也起著主要的作用，人們認(rèn)為這樣的膽固醇逆轉(zhuǎn)輸送系統(tǒng)對(duì)動(dòng)脈硬化有預(yù)防作用。
除了上述生物化學(xué)知識(shí)外，有關(guān)血液中膽固醇濃度和動(dòng)脈硬化的關(guān)系從到目前為止多次實(shí)施的免疫學(xué)調(diào)查中，確認(rèn)HDL膽固醇濃度越低，動(dòng)脈硬化的發(fā)病頻率越高，可以說(shuō)改善低HDL血癥從動(dòng)脈硬化的預(yù)防和治療方面看是非常重要的。
現(xiàn)在，血中HDL量是以臨床上可容易測(cè)定的HDL組分的膽固醇(以下表示為HDL膽固醇)的濃度作為指標(biāo)測(cè)定的。就日本人來(lái)說(shuō)，通常當(dāng)血中HDL膽固醇值低于40mg/dl時(shí)，診斷為“低HDL血癥”。
低HDL血癥在以動(dòng)脈硬化為主，以及高脂血癥、腦梗塞、肥胖、糖尿病等多種疾病中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)外，在以丹吉爾(Tangier)病為首的各種各樣的遺傳疾病中也可看到。
到目前為止，遺傳病出現(xiàn)的低HDL血癥治療困難多，而就在動(dòng)脈硬化、高脂血癥、腦梗塞、肥胖、糖尿病等疾病中出現(xiàn)的低HDL血癥來(lái)說(shuō)，針對(duì)HDL本身的有用的低HDL血癥改善劑也沒(méi)有看到，期待著它的出現(xiàn)。
另外就有關(guān)與在上述肝臟和小腸上皮細(xì)胞合成、分泌的HDL不同的脫輔脂蛋白為成分的HDL來(lái)說(shuō)也獲得了有興趣的知識(shí)。
即，在腦的星狀細(xì)胞中合成、分泌的HDL以脫輔脂蛋白質(zhì)E(也稱(chēng)之為apoE)和磷脂為主要成分，確認(rèn)apoE參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)，在apoE存在下，通過(guò)腦星狀細(xì)胞損傷修復(fù)作用，可以使阿耳茨海默病等、與神經(jīng)障礙有關(guān)的疾病的發(fā)展推遲[Schiefermeier等，Stroke，31(9)，2068-2073(2000)]。因此，使在腦的星狀細(xì)胞中合成、分泌的apoE-HDL增加在有關(guān)神經(jīng)障礙或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷的疾病的預(yù)防和治療上非常重要。
另外，最近，Bodzioch等[Nat.Genet.，22，347-351(1999)]、Brooks-wilson等人[Nat.Genet.，22，336-345(1999)]以及Rust等人[Nat、Genet.，22，347-351(1999)]鑒定ABCA1(ATP-binding cassettetransport 1)為表現(xiàn)出HDL顯著低值的丹吉爾病的原因基因，低HDL血癥和ABCA1基因的關(guān)系引起了人們的注目。
ABCA1是主要存在于以肝臟、小腸、胎盤(pán)、腎上腺為首的各種臟器的細(xì)胞的細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)，到目前為止人們一直認(rèn)為它參與氨基酸、維生素、糖等物質(zhì)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)[Annu.Rev.Cell，Biol，8，67-113(1992)]。
按照上述最近的見(jiàn)解，有報(bào)道說(shuō)在丹吉爾病患者中由于在ABCA1基因存在變異，所以看不到脂代謝需要的ABCA1的表達(dá)，膽固醇向細(xì)胞外排泄被阻礙，HDL消失。
除了上述見(jiàn)解外，Richard等人[J.Clin.Invest.，104，R25-R31(1999)]和Von Bckardstein等人[The FASBB J.，15，1555-1561(2001)]發(fā)現(xiàn)ABCA1基因的導(dǎo)入促進(jìn)HDL的新生反應(yīng)，現(xiàn)正在進(jìn)行用基因工程技術(shù)使體內(nèi)的ABCA1的表達(dá)量增加，提高或調(diào)節(jié)HDL膽固醇的濃度的嘗試。
例如在WO00/78971和WO00/78972中公開(kāi)了通過(guò)直接將ABCA1多肽導(dǎo)入宿主細(xì)胞，提高ABCA1的表達(dá)量和活性，用于謀求膽固醇流出和HDL濃度上升的技術(shù)。
如上所述，改善低HDL血癥從動(dòng)脈硬化的預(yù)防和治療方面看是非常重要的，期待著針對(duì)HDL的有用的低HDL血癥改善劑的出現(xiàn)，根據(jù)最近得到的有關(guān)丹吉爾病的資料，進(jìn)行了使ABCA1的表達(dá)量增加，提高或調(diào)節(jié)HDL膽固醇濃度的嘗試。然而，這些嘗試無(wú)論哪一種都是使用基因工程技術(shù)的產(chǎn)物，即使是對(duì)遺傳疾病的治療是有效的，但對(duì)于與該遺傳疾病相比占絕大多數(shù)的動(dòng)脈硬化、高脂血癥、腦梗塞、肥胖、糖尿病等疾病中出現(xiàn)的低HDL血癥還不能成為有用的改善劑。
由于這樣的狀況，人們期待著不需要基因工程技術(shù)，而能針對(duì)HDL的有用的低HDL血癥改善劑的出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明人等為了發(fā)現(xiàn)不需要基因工程技術(shù)、而且能針對(duì)HDL的有用的低HDL血癥改善劑，使用以ABCA1的表達(dá)量上升為指標(biāo)的試驗(yàn)體系，就各種各樣物質(zhì)進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶抑制劑可以使ABCA1的表達(dá)量大幅度而且持續(xù)上升，進(jìn)一步深入研究完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供1)一種以半胱氨酸蛋白酶抑制劑為有效成分的低HDL血癥改善劑。
2)根據(jù)1)所述的低HDL血癥改善劑，半胱氨酸蛋白酶抑制劑來(lái)自天然物或非天然物。
3)根據(jù)上述2)所述的低HDL血癥改善劑，來(lái)自天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑源于微生物、植物或動(dòng)物。
4)根據(jù)上述3)所述的低HDL血癥改善劑，源于微生物、植物或動(dòng)物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是從亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶以及E-64中選出來(lái)的。
5)根據(jù)上述2)所述的低HDL血癥改善劑，來(lái)自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑不是來(lái)源于微生物、植物或動(dòng)物中的任一種，而是合成的物質(zhì)。
6)根據(jù)上述5)所述的低HDL血癥改善劑，來(lái)自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是ALLN或N-乙?；鵯eu-leu-蛋氨醛(methioninal)。
7)一種由上述1)～6)的任一項(xiàng)所述的低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑；以及8)使用THP-1細(xì)胞，以ABCA1的表達(dá)為指標(biāo)篩選具有促進(jìn)HDL新生反應(yīng)作用的物質(zhì)的方法。
另一方面，本發(fā)明還提供9)該病癥或疾病的預(yù)防和/或治療法，其特征是將有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑投給有低HDL血癥或動(dòng)脈硬化癥危險(xiǎn)因素的動(dòng)物，以及10)半胱氨酸蛋白酶抑制劑的用途，將有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑與醫(yī)藥上容許的載體配合后用于制造低HDL血癥改善劑或由低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑。
本發(fā)明的其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)以及具有的觀點(diǎn)通過(guò)以下所述對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員都會(huì)明白的。但是，包括以下所述以及具體的實(shí)施例等敘述在內(nèi)的本說(shuō)明書(shū)的記載給出了本發(fā)明的優(yōu)選方式，但希望理解為只是為了說(shuō)明給出的例子。在本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的本發(fā)明的意圖和范圍內(nèi)，做出各種的變化和/或改變(或修飾)通過(guò)以下所述以及本說(shuō)明書(shū)的其他部分的知識(shí)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易明白。在本說(shuō)明書(shū)中引用的所有專(zhuān)利文獻(xiàn)以及參考文獻(xiàn)應(yīng)當(dāng)理解為是為了說(shuō)明的目的而引用的，這些文獻(xiàn)作為本說(shuō)明書(shū)的一部分，其內(nèi)容也應(yīng)該解釋為包括在本說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容中。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是表示試驗(yàn)例1結(jié)果的圖。
圖2是表示試驗(yàn)例2結(jié)果的圖。
圖3是表示試驗(yàn)例3結(jié)果的圖。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中提供以半胱氨酸蛋白酶抑制劑為有效成分的低HDL血癥改善劑和由該低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑，以及該疾病的預(yù)防和治療方法。
本說(shuō)明書(shū)中，所謂“半胱氨酸蛋白酶抑制劑”是對(duì)SH基為活性中心存在的蛋白酶半胱氨酸蛋白酶[生物化學(xué)詞典、第3版、(株)東京化學(xué)同人、637(1998)]表現(xiàn)出抑制作用的物質(zhì)，無(wú)論是來(lái)自天然物還是來(lái)自非天然物都可以。
所謂來(lái)自天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是源于微生物、植物或動(dòng)物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，可以說(shuō)是在微生物、植物或動(dòng)物的組織生成、分離出的物質(zhì)。上述源于微生物、植物或動(dòng)物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑包括亮抑蛋白酶肽[生物化學(xué)詞典、第3版、(株)東京化學(xué)同人、1531(1998)]、抗蛋白酶[生物化學(xué)詞典、第3版、(株)東京化學(xué)同人、110(1998)]以及E-64[L-反-環(huán)氧琥珀酰-亮氨酰酰氨-(4-胍基)丁烷；生物化學(xué)詞典、第3版、(株)東京化學(xué)同人、150(1998)]等，另外還包括特開(kāi)平10-77276號(hào)公開(kāi)的源于微生物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑和特開(kāi)平7-48340號(hào)引用的源于微生物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑等。其中優(yōu)選亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶以及E-64。
上述所謂來(lái)自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑不是源于微生物、植物及動(dòng)物的任一種，而是合成的物質(zhì)。上述源于非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑包括例如ALLN[N-乙酰基leu-leu-norleucinal；J.EnzymeInhibition，3，195(1990)]和N-乙酰基leu-leu-蛋氨醛[J.EnzymeInhibition，3，195(1990)]等，此外還包括以下給出的文獻(xiàn)和專(zhuān)利公報(bào)公開(kāi)的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。其中，優(yōu)選ALLN和N-乙酰基leu-leu-蛋氨醛。
Biochemical Biophysical Research Communications，取157，1117(1988)，J.Enzyme Inhibition，3，195(1990)、特開(kāi)平7-48340號(hào)、特開(kāi)平8-151355號(hào)、特開(kāi)平8-325282號(hào)、特開(kāi)平9-165360號(hào)、特開(kāi)平9-169752號(hào)、特開(kāi)平9-295996號(hào)、特開(kāi)平10-147564號(hào)、特開(kāi)平10-147566號(hào)、特開(kāi)平11-1491號(hào)、特開(kāi)平11-171881號(hào)、特開(kāi)2001-139534號(hào)、特開(kāi)2001-233847號(hào)、特表平11-507912號(hào)、特表2000-510447號(hào)、特表2001-505889號(hào)、特表2001-506596號(hào)、特表2001-506614號(hào)、WO96/25408、WO97/03060、WO98/47887、WO98/01133、WO98/04539。
上述半胱氨酸蛋白酶抑制劑無(wú)論哪一種都是已知物質(zhì)，可以使用按照上述文獻(xiàn)和專(zhuān)利公報(bào)中公開(kāi)的方法等分離、合成的物質(zhì)或市售品，優(yōu)選使用作為醫(yī)藥品具有可耐受品質(zhì)和穩(wěn)定性級(jí)別的物質(zhì)。
作為該半胱氨酸蛋白酶抑制劑包括含有亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶、ALLN和N-乙?；鵯eu-leu-蛋氨醛等，可以舉出例如含有BiochemicalBiophysical Research Communications，157，1117(1988)、J.EnzymeInhibition，3，195(1990)等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的肽基醛衍生物，例如含有特開(kāi)平7-48340號(hào)、特開(kāi)平10-147564號(hào)、特開(kāi)平10-147566號(hào)、特開(kāi)2001-233847號(hào)等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的磺酰胺化肽基醛衍生物，例如含有E-64、特開(kāi)平8-325282號(hào)、特開(kāi)平10-77276號(hào)、特開(kāi)平10-147566號(hào)、WO97/03060、WO98/47887等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的環(huán)氧琥珀酰胺衍生物，例如含有特開(kāi)平9-169752號(hào)、特開(kāi)平11-171881號(hào)、WO96/25408、WO98/04539等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的至少含有一個(gè)肽鍵的含氧雜環(huán)衍生物，含有特開(kāi)平9-165360號(hào)、特開(kāi)平11-1491號(hào)、特開(kāi)平9-295996號(hào)等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的肽類(lèi)，例如含有特開(kāi)平8-151355號(hào)等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的?；被┭苌铮绾刑亻_(kāi)2001-139534號(hào)等給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的纈氨酸衍生物，例如含有特表平11-507912號(hào)等中給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的α-(1，3-二羰基烯醇基醚)甲基酮衍生物，例如含有特表2000-510447號(hào)等中給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的4-氧雜-1-氮雜雙環(huán)[3，2，0]庚烷衍生物，例如含有特表2001-505889號(hào)、特表2001-5065967號(hào)等中給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的苯(甲)酰胺醛衍生物，例如含有特表2001-506614號(hào)等中給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的酮苯(甲)酰胺衍生物，例如含有WO98/01133等中給出的化學(xué)結(jié)構(gòu)骨架的脯氨酸衍生物等，或它們的改變體和修飾體等。
上述所謂低HDL血癥改善劑是對(duì)于基于臨床上診斷基準(zhǔn)的低HDL血癥使血中HDL膽固醇濃度上升，改善低HDL血癥的藥劑。通常當(dāng)日本人血中HDL膽固醇值低于40mg/dl時(shí)，稱(chēng)之為低HDL血癥，但也包括變更該診斷基準(zhǔn)時(shí)，基于變更的診斷基準(zhǔn)的低HDL血癥。
低HDL血癥在丹吉爾病等遺傳病和動(dòng)脈硬化、高脂血癥、腦梗塞、肥胖、糖尿病、甲狀腺功能異常、肝硬變、骨髓瘤、慢性腎衰竭、慢性炎性腸道疾病(例如，克羅恩氏病(節(jié)段性回腸炎)、潰瘍性大腸炎)等疾病中可看到，本發(fā)明的低HDL血癥改善劑除了可以在丹吉爾病等ABCA1在生物體內(nèi)不能正常合成的遺傳病使用外，也可以在上述疾病中的任一種場(chǎng)合的低HDL血癥中使用。
另外，本發(fā)明的低HDL血癥改善劑就象后面試驗(yàn)例表明的那樣，可以表現(xiàn)出很好的促進(jìn)HDL新生反應(yīng)作用，使血中HDL增加。血中HDL在如上所述對(duì)動(dòng)脈硬化起到預(yù)防作用的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)體系中起到主要的作用，具有增加血中HDL作用的本發(fā)明的低HDL血癥改善劑也可以用作動(dòng)脈硬化的預(yù)防和治療劑。
就是說(shuō)，出現(xiàn)低HDL血癥時(shí)，由于HDL的減少，膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)體系不能充分發(fā)揮功能，蓄積在血管壁的膽固醇難于轉(zhuǎn)運(yùn)到血管外，所以促進(jìn)動(dòng)脈硬化。本發(fā)明的低HDL血癥改善劑可以改善這樣的狀態(tài)，可用于動(dòng)脈硬化的預(yù)防和治療。
另外，本發(fā)明的低HDL血癥改善劑即使在腦中，通過(guò)使apoE-HDL濃度上升，促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)作用，也可以用作與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)的疾病(例如，阿耳茨海默病)的預(yù)防和治療劑。
本發(fā)明也提供使用THP-1細(xì)胞以ABCA1的表達(dá)為指標(biāo)篩選具有促進(jìn)HDL新生反應(yīng)作用的物質(zhì)的方法。
就是說(shuō)，通過(guò)向?qū)HP-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和分化得到的巨噬細(xì)胞中添加篩選對(duì)象物質(zhì)，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的ABCA1的量，可以發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)HDL新生反應(yīng)作用的物質(zhì)。篩選對(duì)象物質(zhì)沒(méi)有特別限定，無(wú)論來(lái)自天然物的還是來(lái)自非天然物的都可以。另外ABCA1表達(dá)量的測(cè)定方法可以是一般的基因工程手法，例如可以采用下面敘述的實(shí)驗(yàn)例1或2給出的手法。
本發(fā)明的低HDL血癥改善劑以及動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑可以單獨(dú)給藥，優(yōu)選是以加入了藥劑學(xué)上容許的添加物后的制劑形式給藥。作為給藥途徑，可以采用口服和注射途徑。在上述制劑中，無(wú)論通過(guò)哪一種途徑給藥，都可以適當(dāng)使用從眾所周知的制劑添加物中選出來(lái)的成分(以下也稱(chēng)為“制劑成分”)。具體的眾所周知的制劑添加物如可以從(1)醫(yī)藥品添加物手冊(cè)、丸善(株)、(1989)，(2)醫(yī)藥品添加物事典、第1版、(株)藥事日?qǐng)?bào)社(1984)，(3)醫(yī)藥品添加物事典追補(bǔ)、第1版、(株)藥事日?qǐng)?bào)社(1995)，和(4)藥劑學(xué)、改訂第5版、(株)南江堂(1997)記載的成分中按照給藥途徑和制劑用途適宜選擇。
例如，當(dāng)口服給藥時(shí)，作為上述添加物只要是作為可以構(gòu)成口服劑的制劑成分能夠達(dá)到本發(fā)明的目的的添加物無(wú)論什么樣的都可以，通?？梢赃x擇賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、包衣劑等眾所周知的制劑成分。作為具體的口服劑，如片劑、膠囊、顆粒劑、細(xì)粒劑、散劑、糖漿劑等。在該口服劑中也包括使用眾所周知的制劑成分，對(duì)作為有效成分的半胱氨酸蛋白酶抑制劑在體內(nèi)的釋放進(jìn)行控制的制劑(例如速釋性制劑、緩釋性制劑)。
另外當(dāng)注射給藥時(shí)，作為添加物可以使用可以構(gòu)成水性注射劑或非水性注射劑的制劑成分，通?？梢允褂萌芙鈩?、溶解助劑、混懸劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、保存劑等眾所周知的制劑成分，也可以是構(gòu)成用于給藥時(shí)溶解或混懸后使用的粉末注射劑的眾所周知的制劑成分。作為水性注射劑的制劑成分；如注射用蒸餾水、等滲的滅菌水的鹽溶液(含有磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等，或含有這樣鹽的混合物)等。
本發(fā)明的低HDL血癥改善劑以及動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑的給藥量由于給藥的患者的年齡、體重、低HDL血癥或動(dòng)脈硬化的癥狀、有無(wú)合并癥等而有所不同，可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，通常口服給藥時(shí)，為1mg～3,000mg/日左右，或在注射給藥時(shí)，為0.1mg～1,000mg/日左右。
鑒于上述情況，也可理解為本發(fā)明提供該病癥或疾病的預(yù)防和/或治療法，其特征是將有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑投給有低HDL血癥或動(dòng)脈硬化癥危險(xiǎn)因素的動(dòng)物，另外還提供將有效量的半胱氨酸蛋白酶抑制劑與醫(yī)藥上容許的載體配合后用于制造低HDL血癥改善劑或由低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑的半胱氨酸蛋白酶抑制劑的用途。而且，這些方法和用途可以根據(jù)上面敘述實(shí)施各個(gè)具體的方式。
實(shí)施例等以下，敘述實(shí)驗(yàn)例和制劑例，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不限定于這些例子。所有的例子等除了另外詳細(xì)敘述以外，都是使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)實(shí)施的，或可以實(shí)施的例子，這些對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的慣例。
試驗(yàn)例1 ALLN引起的增加ABCA1表達(dá)的作用<試驗(yàn)法>將THP-1細(xì)胞(人白血病細(xì)胞；American Type CultureCollection)在PMA(phorbol myristate acetate(佛波醇肉豆蔻酸酯醋酸酯)；和光純藥工業(yè)(株)制)存在下使用10％FBS-RPMI1640培養(yǎng)基(巖城硝子(株)制)72小時(shí)培養(yǎng)分化為巨噬細(xì)胞。將培養(yǎng)基換成添加了50μM ALLN(Sigma公司制)的0.2％BSA-RPMI1640(巖城硝子(株)制)，按照下述方法，隨時(shí)解析細(xì)胞內(nèi)ABCA1的表達(dá)量。
ALLN處理細(xì)胞和在沒(méi)有添加ALLN的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞于5mM的Tris-HCl(pH8.5)中進(jìn)行低滲破碎后，經(jīng)離心(650g、5分鐘)，使核成分沉淀。對(duì)上清于105,000g離心30分鐘，回收全部膜成分。將全部膜成分溶解于0.9M尿素、0.2％triton X-100(和光純藥工業(yè)(株)制)、0.1％二硫代蘇糖醇溶液(和光純藥工業(yè)(株)制)后，加入4/1量的10％十二烷基硫酸鋰溶液(和光純藥工業(yè)(株)制)，使用10％SDS-7％聚丙烯酰胺凝膠(和光純藥工業(yè)(株)制)進(jìn)行電泳分離。將分離的蛋白固定和轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Bio-Rad公司制)上后，用使用了抗人ABCA1兔抗體(利用通常的手法自己純化)的免疫印記技術(shù)對(duì)ABCA1蛋白的表達(dá)量進(jìn)行解析，對(duì)得到的該表達(dá)量的帶的濃度和大小用Scion Image(圖像解析軟件Scion公司制)讀出進(jìn)行數(shù)值化。
<結(jié)果>在添加了ALLN的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，可以確認(rèn)細(xì)胞內(nèi)的ABCA1的表達(dá)明顯增加。即，在圖1中給出了一直到添加ALLN后4小時(shí)的ABCA1表達(dá)增加作用，該增加作用從添加ALLN 15分鐘后就可看到，其強(qiáng)度將對(duì)照細(xì)胞(添加ALLN后的時(shí)間為0時(shí)間的細(xì)胞)ABCA1表達(dá)量作為100時(shí)，可以達(dá)到168～191。另外ABCA1表達(dá)增加作用即使在添加ALLN后24小時(shí)也可看到。
試驗(yàn)例2亮抑蛋白酶肽引起的ABCA1表達(dá)上升的作用用與試驗(yàn)例1同樣的方法，將THP-1細(xì)胞于代替ALLN而添加亮抑蛋白酶肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，與沒(méi)有經(jīng)亮抑蛋白酶肽處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果，亮抑蛋白酶肽處理細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，可以確認(rèn)細(xì)胞內(nèi)的ABCA1的表達(dá)明顯增加。圖2中給出了對(duì)照細(xì)胞(添加亮抑蛋白酶肽后的時(shí)間為0時(shí)間的細(xì)胞)和添加亮抑蛋白酶肽后7小時(shí)的ABCA1表達(dá)相對(duì)量。該亮抑蛋白酶肽引起的ABCA1增加作用即使在向培養(yǎng)基添加亮抑蛋白酶肽后24小時(shí)也可看到。
試驗(yàn)例3 ALLN引起的HDL新生反應(yīng)促進(jìn)作用<試驗(yàn)法>利用與Arakawa等人方法[J.Lipod Res.，41，1952-1962(2000)同樣的方法，使用THP-1細(xì)胞對(duì)基于依賴(lài)于apoA1的HDL新生反應(yīng)而轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中的膽固醇和磷脂量進(jìn)行解析，對(duì)添加了ALLN的細(xì)胞和沒(méi)有添加的細(xì)胞進(jìn)行比較。
<結(jié)果>添加了apoA1和ALLN的細(xì)胞中，與沒(méi)有添加apoA1和ALLN的細(xì)胞(對(duì)照組)和只添加apoA1的細(xì)胞(添加apoA1組)相比，確認(rèn)依賴(lài)于apoA1的膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)出的量增加，即可看到HDL新生反應(yīng)促進(jìn)作用。圖3給出了該結(jié)果。
如上所述，通過(guò)上述試驗(yàn)確認(rèn)本發(fā)明的低HDL血癥改善劑不利用基因工程技術(shù)而表現(xiàn)出ABCA1表達(dá)增加作用，促進(jìn)HDL新生反應(yīng)。
上述本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑引起的ABCA1表達(dá)增加作用在將半胱氨酸蛋白酶抑制劑添加到細(xì)胞培養(yǎng)基后，很快就可以看到，表明這并不是由于使用上述以往技術(shù)中的基因工程技術(shù)時(shí)那樣的ABCA1在細(xì)胞內(nèi)合成的亢進(jìn)得到的結(jié)果，暗示了是由于ABCA1的代謝抑制這一全新的機(jī)理造成的結(jié)果。
制劑例1本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑100mg、乳糖100mg、玉米淀粉28mg、硬脂酸鎂2mg有關(guān)上述處方根據(jù)日本藥局方XIII的制劑總則記載的眾所周知方法可以得到膠囊劑。
制劑例2 將本發(fā)明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑50mg溶解于由含有適量氯化鈉的注射用蒸餾水10ml配制的等滲水溶液，充填到安瓿瓶，密封后，滅菌，得到注射劑。
如上所述，以半胱氨酸蛋白酶抑制劑為有效成分的本發(fā)明的藥劑不用上述以往技術(shù)所見(jiàn)到的基因工程技術(shù)，通過(guò)與以往技術(shù)完全不同的機(jī)理可以使ABCA1的表達(dá)量增加，使血中HDL量增加，可以用作動(dòng)脈硬化等多種疾病中出現(xiàn)頻率高的低HDL血癥的改善劑。另外本發(fā)明的低HDL血癥改善劑由于其低HDL血癥改善作用，也可以用作動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑。另外通過(guò)將半胱氨酸蛋白酶抑制劑給予具有患有低HDL血癥或患有動(dòng)脈硬化的危險(xiǎn)因素的動(dòng)物等，可以進(jìn)行疾病的預(yù)防和治療。
本發(fā)明除了上述的說(shuō)明和實(shí)施例中特別記述以外的可以實(shí)行是很清楚的。鑒于上述示范，本發(fā)明的很多的改變和變形是可能的，因此，這些也是本申請(qǐng)附加的權(quán)利范圍內(nèi)的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.以半胱氨酸蛋白酶抑制劑為有效成分的低HDL血癥改善劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低HDL血癥改善劑，其中，半胱氨酸蛋白酶抑制劑來(lái)自天然物或非天然物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低HDL血癥改善劑，其中，來(lái)自天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是微生物、植物或動(dòng)物來(lái)源的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的低HDL血癥改善劑，其中，來(lái)源于微生物、植物或動(dòng)物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是從亮抑蛋白酶肽、抗蛋白酶以及E-64中選出來(lái)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的低HDL血癥改善劑，來(lái)自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑不是來(lái)源于微生物、植物或動(dòng)物中的任一種，而是合成的物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的低HDL血癥改善劑，其中，來(lái)自非天然物的半胱氨酸蛋白酶抑制劑是ALLN或N-乙酰leu-leu-蛋氨醛。
7.由權(quán)利要求1～6的任一項(xiàng)所述的低HDL血癥改善劑構(gòu)成的動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑。
8.具有促進(jìn)HDL新生反應(yīng)作用的物質(zhì)的篩選方法，使用THP-1細(xì)胞、以ABCA1的表達(dá)為指標(biāo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及低HDL血癥改善劑。提供不需要基因工程技術(shù)、能針對(duì)HDL有用的低HDL血癥改善劑以及動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑，和該病癥的預(yù)防和治療法。提供通過(guò)將半胱氨酸蛋白酶抑制劑作為有效成分，不用基因工程技術(shù)而使ABCA1的表達(dá)量增加，使血中HDL增加，可在臨床上利用的低HDL血癥改善劑以及動(dòng)脈硬化預(yù)防和治療劑。
文檔編號(hào)A61K38/56GK1568199SQ02820238
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月12日
發(fā)明者橫山信治, 荒川禮二郎 申請(qǐng)人:格勒蘭制藥株式會(huì)社