專利名稱：子宮內(nèi)裝置、其生產(chǎn)方法以及將活性因子置于子宮腔內(nèi)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性涉及子宮內(nèi)裝置(intrauterine device)且特別是出于治療目的將因子(element)置于子宮腔內(nèi)的方法。子宮腔是一個(gè)解剖學(xué)位置，不容易直接進(jìn)入其中，而且至今子宮內(nèi)裝置僅用于避孕方法領(lǐng)域中。然而，子宮腔借助于合適的子宮內(nèi)裝置可用于一些其它目的，特別用于直接治療子宮壁(子宮內(nèi)膜和/或子宮肌膜)病變、暫時(shí)性體內(nèi)胚胎/卵培育及作為合適的施用途徑以到達(dá)全身血液系統(tǒng)。本發(fā)明提供了這方面的方法。
本發(fā)明涉及一種可取式子宮(子宮腔或輸卵管)內(nèi)裝置，特別用于將配子或胚胎移植入子宮(或輸卵管)，使得可在輔助生殖技術(shù)(ART)中進(jìn)行體內(nèi)及子宮內(nèi)(或輸卵管內(nèi))受精和/或植入前發(fā)育。
本發(fā)明還涉及一種相似的子宮內(nèi)裝置以將通過基因轉(zhuǎn)染而遺傳學(xué)修飾的細(xì)胞系植入子宮內(nèi)，以將分子輸送于子宮內(nèi)膜附近而無全身作用并允許在ART或自然受精后在胚胎移植之前更特異性改變及預(yù)處理子宮內(nèi)膜，或者相反地作為標(biāo)準(zhǔn)宮內(nèi)節(jié)育器(IUD)以避免任何妊娠(避孕)。
本發(fā)明還涉及一種相似的子宮內(nèi)裝置，使得可以將各種活性因子輸送于子宮腔內(nèi)。
特別地，所述活性因子可以是配子/胚胎及用于分泌生物活性因子的通過基因轉(zhuǎn)染而遺傳學(xué)修飾的細(xì)胞系，后者的目的是為改善體內(nèi)培育配子/胚胎(胚胎可得自克隆或任何其它技術(shù))的子宮內(nèi)環(huán)境。
本發(fā)明可應(yīng)用于任何哺乳動物物種。
根據(jù)第一方面，本發(fā)明涉及生殖醫(yī)學(xué)，特別是在輔助生殖技術(shù)中體外受精(IVF)及使用與細(xì)胞包囊技術(shù)(cell encapsulation technology)相關(guān)的子宮內(nèi)裝置經(jīng)由子宮輸送藥物。
自1978年開始，IVF已經(jīng)成為處理大多數(shù)不孕癥患者致病原因的優(yōu)選方法。作為IVF方法的一部分，生殖細(xì)胞(卵母細(xì)胞和精子)及所得受精的卵母細(xì)胞(受精卵，胚胎)根據(jù)特異方法使用適于該方法中每個(gè)特異步驟的體外培養(yǎng)基處理。
標(biāo)準(zhǔn)體外受精(IVF)包括以下步驟-成熟(卵母細(xì)胞募集)為保證一個(gè)以上的卵母細(xì)胞成熟，將婦女在實(shí)際受精之前用激素處理。通常地，將婦女用破壞腦(下丘腦和垂體)與卵巢之間正常激素控制信號的一種因子(GnRH激動劑)處理14-21天。之后根據(jù)卵巢應(yīng)答情況施用10-20天相對大劑量的卵泡刺激素(FSH)。FSH刺激許多卵泡成熟，每個(gè)卵泡均含有一個(gè)卵母細(xì)胞。
當(dāng)卵母細(xì)胞準(zhǔn)備排卵時(shí)，施用人絨毛膜促性腺激素(hCG)以完成卵母細(xì)胞成熟。
-抽吸卵母細(xì)胞在體內(nèi)成熟后，使用超聲導(dǎo)向卵泡穿刺(ultrasound guided follicularpuncture)從婦女卵巢中收集卵母細(xì)胞。
-受精及胚胎培養(yǎng)體外受精通過向卵母細(xì)胞中加入精子(體外受精I(xiàn)VF)或者通過微注射在每個(gè)成熟的卵母細(xì)胞中注入一個(gè)精子(胞質(zhì)內(nèi)精子注射，ICSI)而獲得。受精的卵母細(xì)胞在生殖道外的IVF培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-5天。
-胚胎移植在體外培養(yǎng)胚胎2-5天后，選擇幾個(gè)胚胎并用一個(gè)細(xì)管將其移植至婦女的子宮內(nèi)。
體外受精和胚胎培養(yǎng)的最終目標(biāo)是提供高質(zhì)量的胚胎，其能持續(xù)正常發(fā)育并分娩存活。
-針對植入前胚胎發(fā)育進(jìn)行體外培養(yǎng)近20年來盡管用IVF及最近用胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)治療患者，但移植的每個(gè)胚胎的植入率還較低，平均為大約20％。
世界上大多數(shù)IVF中心在第2或第3天進(jìn)行胚胎移植，即在生理學(xué)植入期之前3或2天進(jìn)行移植。胚胎生理學(xué)和新陳代謝領(lǐng)域的新近進(jìn)展導(dǎo)致新的貫序無血清培養(yǎng)基形成，其設(shè)計(jì)為模擬胚胎沿著生殖道行進(jìn)的動態(tài)環(huán)境(Gardner等，1996)。貫序培養(yǎng)系統(tǒng)(G1.2/G2.2)具有最高比率的胚泡形成，但仍低達(dá)50％(Gardner等，1998)。
將胚胎培養(yǎng)至胚泡階段的基本原理是這使得可以進(jìn)行選擇以移植具有經(jīng)證實(shí)的發(fā)育能力的胚胎。另外，將胚泡轉(zhuǎn)移至子宮內(nèi)與轉(zhuǎn)移一個(gè)早期分裂的胚胎相比在生理學(xué)上更接近體內(nèi)情況，其正常存在于輸卵管中且沒有從子宮內(nèi)逐出的危險(xiǎn)，因?yàn)樵谂咛ブ踩胫暗臅r(shí)間減少。
最近的論文揭示將受精卵與人子宮內(nèi)膜上皮(Simon等，1999)和/或基質(zhì)細(xì)胞(Barmat等，1998)在體外共同培養(yǎng)對每個(gè)前胚胎的卵裂球數(shù)，發(fā)育為桑椹胚-卵裂球期的比率，自然培育的比率及胞質(zhì)片段的百分率，及植入比率具有有益作用，如近來Spandorfer等，2002所述。
在1994年美國和加拿大的輔助生殖技術(shù)活動的報(bào)道中，配子輸卵管內(nèi)轉(zhuǎn)移(GIFT)及合子輸卵管內(nèi)轉(zhuǎn)移(ZIFT)與體外受精相比具有較高的臨床妊娠率。最近Levran等在2002年表明合子輸卵管內(nèi)轉(zhuǎn)移與在標(biāo)準(zhǔn)IVF之后轉(zhuǎn)移胚泡相比改良了重復(fù)植入失敗的結(jié)果。
這些發(fā)現(xiàn)提示合子存在于上段生殖道中對得益于子宮液中存在的所有已知和未知的生長因子的胚胎發(fā)育及其在植入過程期間侵潤子宮內(nèi)膜的潛力是重要的。
另外，在牛體內(nèi)進(jìn)行的研究近來表明在體內(nèi)產(chǎn)生的胚胎與具有更多的細(xì)胞內(nèi)通訊手段(Boni等，1999)及特別是成熟的線粒體(Crosier等，2000)的體外產(chǎn)生的胚胎相比很少變化。
所有上述研究證實(shí)，盡管已經(jīng)努力通過模擬子宮液特性而使培養(yǎng)基最佳化，但體外的胚胎植入前發(fā)育還遠(yuǎn)未達(dá)到優(yōu)化。
本發(fā)明提供了ART中的一種新方法，使用細(xì)胞包囊技術(shù)以特別使IVF程序(或者克隆所有其它哺乳動物物種)中的配子和/或植入前合子/胚胎從在子宮中暫時(shí)自然培育受益。
另外，控制子宮內(nèi)培育的時(shí)間可產(chǎn)生更好質(zhì)量的胚胎發(fā)育及因此具有較高的植入率，而且如果胚泡轉(zhuǎn)移在ART單位中很普遍，則與標(biāo)準(zhǔn)IVF相比具有較低花費(fèi)的經(jīng)濟(jì)學(xué)優(yōu)勢。
根據(jù)第二方面，本發(fā)明涉及通過植入可能經(jīng)過遺傳學(xué)修飾的組織、細(xì)胞或細(xì)胞系而子宮內(nèi)輸送活性因子，特別是進(jìn)行細(xì)胞治療。
在所有哺乳動物物種中，植入的成功與良好質(zhì)量的胚胎和接受子宮內(nèi)膜之間的完美通訊相關(guān)。
在輔助生殖技術(shù)(ART)領(lǐng)域中，臨床醫(yī)生對子宮內(nèi)膜接受性的復(fù)雜情況的控制限于通過施用17β雌二醇和孕酮以模擬生理學(xué)的貫序的卵泡和黃體期進(jìn)行內(nèi)分泌處理。
在基礎(chǔ)科學(xué)文獻(xiàn)中，大多數(shù)研究目前集中在使用體外和體內(nèi)模型如缺乏目的分子的基因敲除小鼠來研究胚胎和子宮內(nèi)膜之間的圍植入期(periimplantation)的旁分泌學(xué)。例如，已經(jīng)揭示了在整聯(lián)蛋白β1缺陷小鼠(Fassler和Meyer，1995)及具有白細(xì)胞介素II受體α鏈無效突變的雌性小鼠(Robb等，1998)中，胚胎不能植入。
然而，在嚙齒動物中發(fā)現(xiàn)不一定需要在胚胎和子宮內(nèi)膜之間直接接觸(Shiotani等，1993)。但二十年來胚胎植入率仍保持穩(wěn)定及低下，我們可以說用陰道孕酮和hCG全身性施用及最后的17β雌二醇進(jìn)行的內(nèi)分泌處理遠(yuǎn)未到達(dá)最佳而且完全未掌握胚胎植入過程的復(fù)雜的旁分泌學(xué)。
本發(fā)明提供了ART的一種新觀念，使用細(xì)胞包囊技術(shù)以植入細(xì)胞系，所述細(xì)胞系經(jīng)遺傳學(xué)修飾而暫時(shí)在IVF程序中轉(zhuǎn)移胚胎之前在子宮內(nèi)膜附近分泌目的分子。
這種比較接近靶組織的子宮內(nèi)分子或“藥物”輸送，使得更好及更選擇性預(yù)處理子宮內(nèi)膜及使用短半衰期的小分子或者使用具有不良反應(yīng)而嚴(yán)禁在全身施用的分子。
根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及一種可植入/可插入型裝置，以將在植入之前在接受胚胎之前能預(yù)處理子宮的因子輸送至子宮壁或者治療子宮。關(guān)于這個(gè)實(shí)施方案，能刺激子宮特異性針對胚胎植入而準(zhǔn)備的某些或大多數(shù)藥物，營養(yǎng)素，維生素，氨基酸，脂肪酸，肽，蛋白質(zhì)等物質(zhì)，或者任何其它治療劑，也可以通過本發(fā)明的含有釋放這些因子的聚合物或細(xì)胞的裝置而易于輸送。事實(shí)上，本發(fā)明的可取式子宮內(nèi)裝置就藥物輸送而言對不能通過正常的注射或其它輸送途徑接受藥物的婦女具有特別的優(yōu)勢。另外，通過子宮壁輸送因子可以是治療生殖系統(tǒng)癌癥和/或其它生殖疾病以及任何子宮疾病的最佳治療形式。
本發(fā)明特別提供了細(xì)胞包囊子宮內(nèi)裝置以進(jìn)行控制時(shí)間的體內(nèi)和子宮內(nèi)配子受精和/或胚胎植入前發(fā)育(從幾分鐘至48、72小時(shí))，在此子宮在IVF程序中轉(zhuǎn)移指定胚胎之前發(fā)揮“天然培育器”的作用。
因此，本發(fā)明的細(xì)胞包囊子宮內(nèi)裝置是一種新的及經(jīng)改良的子宮內(nèi)裝置，與Jerome Schwarz于1969年的美國專利No.3628530及ReneCoumut于1967年的美國專利No.3516403所述避孕IUD相似，其根據(jù)本發(fā)明可以使得將與其它體細(xì)胞相關(guān)或不相關(guān)的配子或胚胎(在體內(nèi)共同培養(yǎng))暫時(shí)導(dǎo)入子宮腔內(nèi)，及在限定時(shí)間之后通過使用細(xì)胞包囊技術(shù)回收，如Thomas Mandel等于1989年的WO91/00119，Newman和Kram于2000年的WO01/64185 A2及Aebischer等于1990年的美國專利No.5158881和Li等于1996年的美國專利No.6054142所述。
事實(shí)上，本發(fā)明涉及一種可取式子宮內(nèi)裝置以將一或多種能與子宮液相互作用的被包囊化(encapsulated)的因子放置在子宮腔內(nèi)，其包括一種裝填包囊化的因子的子宮內(nèi)裝置。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“因子”是指任何有機(jī)或無機(jī)的、細(xì)胞或分子、天然或合成的化合物或物質(zhì)。
術(shù)語“裝填”不僅涵蓋了其中本發(fā)明子宮內(nèi)裝置是所述被包囊化的因子的支持物，例如所述因子可附著于所述裝置的表面上，而且還包括其中所述因子包含在本發(fā)明的裝置內(nèi)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，提供的本發(fā)明可取式子宮內(nèi)裝置具有至少一個(gè)腔(housing)，其中裝填了所述被包囊化的因子。不同的因子可以混合在相同的腔中或者置于單獨(dú)的腔中。
短語“能與子宮液相互作用”不僅涵蓋了其中所述因子通過本發(fā)明的裝置輸送至子宮液中以對子宮腔的壁(子宮內(nèi)膜和/或子宮肌膜)產(chǎn)生作用(第一種情況)，還包括其中所述因子保持在所述裝置中并與子宮液和/或與子宮壁(子宮內(nèi)膜和/或子宮肌膜)具有已知或未知的交換或相互作用(第二種情況)。
根據(jù)“第一種情況”的第一個(gè)方面，所述因子不僅是能治療子宮的制劑，而且還是能治療任何病變的制劑。事實(shí)上，能治療子宮的因子從本發(fā)明的裝置中輸送至子宮液中并對子宮腔壁具有直接作用。這種因子選自以下一組能預(yù)處理子宮壁以達(dá)到最佳植入胚胎的因子，能預(yù)處理子宮壁以達(dá)到最佳卵培養(yǎng)的因子，治療性處理子宮的因子及避孕制劑。
這種系統(tǒng)的優(yōu)勢是使得可以使用對靶器官具有直接作用的因子，避免全身性途徑使用。
另外，根據(jù)“第一種情況”的第二個(gè)方面，本發(fā)明的裝置可以使得可以通過子宮內(nèi)施用途徑輸送能治療任何病變的因子。換而言之，這種因子可以在子宮液內(nèi)輸送，然后進(jìn)入與子宮壁接觸并通過子宮內(nèi)膜的靜脈系統(tǒng)之后進(jìn)入全身血液系統(tǒng)。換而言之，該子宮內(nèi)輸送是施用可能治療與任何器官有關(guān)的任何病變的任何藥物的一種可能途徑。
在可能裝填于本發(fā)明可取式子宮內(nèi)裝置中的因子中，必須提及的有分泌一或多種因子的組織，細(xì)胞或細(xì)胞系(用于細(xì)胞治療)，體細(xì)胞，干細(xì)胞(全能細(xì)胞)，作為基因轉(zhuǎn)移載體的重組病毒(用于基因治療)，有義或反義mRNA序列，雄性和/或雌性配子，受精的卵母細(xì)胞(兩個(gè)前核細(xì)胞)，未受精的卵及任何上述因子的組合。
上述“第二種情況”涉及受精的卵母細(xì)胞(兩個(gè)前核細(xì)胞)和未受精的卵，其中子宮發(fā)揮天然培育器的作用，使得所述胚胎或卵在代替體外培養(yǎng)基的天然培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在這種情況中，本發(fā)明的裝置中未裝填因子輸送至子宮液中，短語“與子宮液相互作用”涵蓋了胚胎或卵與由子宮液和子宮壁組成的環(huán)境培養(yǎng)基交換或相互作用。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，由組織，細(xì)胞或細(xì)胞系分泌的至少一種因子選自藥物，激素，營養(yǎng)素，肽，蛋白質(zhì)，抗體，營養(yǎng)因子，生長因子，淋巴因子，細(xì)胞因子，酶，凝血因子，血管生成因子，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)節(jié)因子。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明涵蓋了其中分泌可裝填于本發(fā)明裝置中的因子的組織，細(xì)胞或細(xì)胞系可遺傳學(xué)修飾以獲得分泌希望的產(chǎn)物的情況。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，能治療性處理子宮的因子選自抗炎制劑，氨基酸，脂肪酸，抗體，營養(yǎng)因子，生長因子，淋巴因子，細(xì)胞因子，酶，蛋白質(zhì)，肽，凝血因子，血管生成因子，止痛劑，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，抗焦慮藥，抗抑郁藥，抗生素，有義或反義mRNA序列，作為基因轉(zhuǎn)移載體的重組病毒。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，裝填于本發(fā)明可取式子宮內(nèi)裝置中的因子能治療癌癥，各種生殖系統(tǒng)癌癥，生殖疾病及子宮疾病如子宮內(nèi)膜炎，子宮內(nèi)膜異位，子宮出血及各種感染(非限于所列出的疾病)。
事實(shí)上，本發(fā)明的裝置存在許多優(yōu)勢所述裝置對子宮不可能造成任何問題，因?yàn)槠洳皇侵踩胱訉m壁內(nèi)，其不需要外科或麻醉以插入而且其可以以完全非固定的方式插入。另外，因子可以在自然月經(jīng)周期階段及與控制藥物從所述裝置中輸送的激素依賴性基因表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合而輸送。同樣非常重要的是應(yīng)注意與經(jīng)皮膚途徑施用同樣，子宮內(nèi)施用使得可以避免施用的因子首先經(jīng)過肝臟。這產(chǎn)生低毒性及所述因子存在較好的生物可利用度。最后，所述裝置可以使用外科介入而快速回收。


圖1例證了本發(fā)明裝置(1包囊，2支持帶A-遠(yuǎn)端部分，支持帶B-近端部分，3活塞，4保護(hù)管，5開啟薄膜或瓣膜，6側(cè)翼，7移除裝置，8硅酮繩)。
例如，本發(fā)明的裝置包括1包囊·非生物可降解的·半通透的·聚合物材料(即聚醚砜或PES。來源于Akzo Nobel Faser AG，Wuppertal，德國)中空纖維如聚丙烯酸酯(包括共聚物)，聚乙烯，聚亞胺酯。
·孔適應(yīng)于最佳環(huán)境性質(zhì)，通透性從子宮液中存在的小至大分子。
·孔徑從0.005μm(等于截止分子量150kDa至280kDa)。
·孔結(jié)構(gòu)微孔或任何適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)。
·外徑適應(yīng)于通過宮頸進(jìn)入子宮的導(dǎo)管的最佳規(guī)格(即700μm)。
·內(nèi)徑適應(yīng)于卵或胚胎的大小(即500μm)，卵或胚胎大小的大約5倍(人體具有放射冠的卵大小＝200μm)，或者適應(yīng)于輸送的分子的大小·長度適應(yīng)于子宮腔，避免子宮內(nèi)膜損傷及由于子宮擴(kuò)伸及最后其取出所致任何有害因素(即大約1.5cm)·根據(jù)上述要點(diǎn)采取圓柱形狀或適于子宮腔的任何適當(dāng)形狀2兩個(gè)支持物，A帶(遠(yuǎn)端)和B帶(近端)，如Schwarz的美國專利3628530針對IUD所述加以如下修改·遠(yuǎn)端部分(A)由基于丙烯酸酯的膠，Luxtrack LCM 23(Ablestik，美國)或者任何其它系統(tǒng)如套帽密閉，近端部分(B)是中空及能打開的，具有一個(gè)有義方向(在內(nèi)壁上)瓣膜·A帶支持物包括兩個(gè)側(cè)翼或者相似材料的任何其它裝置(其可以包括相似材料的不對稱側(cè)翼，與用薄親水性材料覆蓋支持物相比液面接觸更厚一些)或者使所述裝置穩(wěn)定位于穩(wěn)定子宮內(nèi)其它支持物·B帶支持物包括一個(gè)系于取出線上的硅酮繩以回收所述裝置3.一個(gè)活塞
4.與活塞相連的一個(gè)操縱手柄5.一種取出纖維以取出子宮內(nèi)包囊裝置6.一個(gè)附著裝置以附著取出纖維保證子宮內(nèi)包囊裝置與活塞的固定位置7.一個(gè)環(huán)繞活塞的保護(hù)套管，如Lehtinen Matti等于1994年所述(專利號CZ 286 820)，但具有活塞使得IVF生物學(xué)家可以裝填配子，胚胎，藥物或具有標(biāo)準(zhǔn)移液管任何其它因子本發(fā)明的細(xì)胞包囊子宮內(nèi)裝置可以采取任何形狀，其適應(yīng)于使用合適微移液管裝填被包囊化的配子和/或胚胎或任何其它上述因子。優(yōu)選的可植入胚胎培養(yǎng)裝置是具有合適孔徑的管狀選擇性可通透膜，以使得可以將足夠的營養(yǎng)素如O2，蛋白質(zhì)，生長因子及子宮內(nèi)膜釋放的其它已知和未知的因子移至胚胎中，具有一個(gè)末端，通過該末端可將配子或胚胎裝填于細(xì)胞區(qū)室中。然后控制側(cè)面末端然后用套帽永久閉塞，或者用環(huán)氧膠或生物適合的及不可再吸收材料如聚丙烯材料縫合線閉塞。
關(guān)于本發(fā)明可取式子宮內(nèi)裝置的結(jié)構(gòu)，內(nèi)徑尺寸為100-10000微米的及具有將所述裝置附著于子宮腔(壁)的合適設(shè)施的一種可取式中空纖維裝置是子宮內(nèi)培育卵/胚胎的理想場所。本發(fā)明應(yīng)用的現(xiàn)行裝置是一種聚醚砜膜，MW截止為大約240000道爾頓，壁厚度為100微米，內(nèi)徑為472微米。壁厚度根據(jù)成分，多孔性，水壓通透性，孔徑及包囊材料的強(qiáng)度可在50-500微米范圍內(nèi)。分子量截止可在50000至＞1百萬分子量之間變化。另外，包囊材料可以由任何生物適合材料組成，包括聚醚砜，Pan-PVC或者擴(kuò)展的PTFE及用層積或單一薄膜結(jié)構(gòu)。包囊裝置可以含有或不含有一種基質(zhì)或內(nèi)襯材料。長度為0.5cm-5cm或者與子宮相適應(yīng)。如上所述，針對這種裝置最重要的是其能在子宮內(nèi)直接培育維持胚胎而不受損害，是完全可取式。另外，該裝置已經(jīng)設(shè)計(jì)為很少或無組織反應(yīng)，具有光滑表面，由此其可以植入或插入及回收而不誘導(dǎo)炎癥或纖維化反應(yīng)或者不適當(dāng)?shù)淖訉m壁組織損害或者瘢痕。最后，該裝置設(shè)計(jì)為其具有一種保留在子宮內(nèi)的設(shè)施(即小縫合線膠粘于所述裝置的頂端以附著于子宮內(nèi)或外)而且在植入子宮后任何時(shí)間均可易于回收(附著于縫合線)。與Modex治療(PES 5，PES 1，PES 10/10)現(xiàn)行使用的那些中空纖維裝置及細(xì)胞治療(Pan-PVC)過去使用的裝置成分相似的裝置，針對這種應(yīng)用是理想的，盡管符合這種一般描述的任何裝置均適于使用。
本發(fā)明的裝置可以經(jīng)外科操作作為避孕的標(biāo)準(zhǔn)IUD通過子宮頸植入子宮內(nèi)及在指定培育時(shí)間之后取出。
然而，通過修改本發(fā)明細(xì)胞包囊子宮內(nèi)裝置，使得本發(fā)明還可在輸卵管部位植入，例如修改為沒有具有兩翼的遠(yuǎn)端部分。這種植入更難以達(dá)到而且需要使用外科方法，如在全身麻醉下使用腹腔鏡或者在局部麻醉下使用陷凹鏡。這種體內(nèi)輸卵管內(nèi)胚胎培育與GIFT或ZIFT相似，除了使用本發(fā)明細(xì)胞包囊裝置可以控制培育時(shí)間及裝填的胚胎可以不限制數(shù)目，可以對其加以回收并在一個(gè)簡便的沖洗程序之后選擇移植。
因此，在使用或不使用ICSI的標(biāo)準(zhǔn)IVF之后，可以用標(biāo)準(zhǔn)微移液管將不同階段的(2-5天)合子或胚胎裝填入本發(fā)明的細(xì)胞包囊子宮內(nèi)裝置中。
本發(fā)明還涉及一種制備可取式子宮內(nèi)裝置以放置一或多個(gè)因子的方法，所述因子能與子宮液相互作用，所述方法包括以下步驟-提供被包囊化的合適形式的所述因子，-提供適于接受被包囊化的因子的一種可取式子宮內(nèi)裝置-用所述因子裝填所述裝置。
本發(fā)明還涉及一種放置一或多個(gè)放置因子的方法，所述因子能與子宮液相互作用，所述方法包括以下步驟-提供一種可取式子宮內(nèi)裝置，-將所述裝置植入子宮腔內(nèi)一定時(shí)期。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，在哺乳動物子宮腔內(nèi)進(jìn)行上述方法，所述動物優(yōu)選選自牛，綿羊，豬和人。
更特別地，本發(fā)明可以根據(jù)以下方法進(jìn)行A.體內(nèi)受精在包囊裝置中注入準(zhǔn)備的精子和可重新獲得的卵母細(xì)胞以植入子宮內(nèi)。在體內(nèi)及子宮內(nèi)培養(yǎng)的指定及控制的培育時(shí)間后(2小時(shí))，回收被包囊化的精子和卵母細(xì)胞，在簡單的沖洗程序之后收集合子和/或未受精的卵母細(xì)胞。在第3天選擇合子低溫貯藏或者移植剩余的胚胎的體外培養(yǎng)物。
B.體內(nèi)植入前胚胎發(fā)育將準(zhǔn)備的精子和可重新獲得的卵母細(xì)胞在體外受精。在控制的時(shí)期內(nèi)(即48小時(shí))，將不同發(fā)育階段的一些胚胎(即6-8個(gè)細(xì)胞)注入可以植入子宮腔內(nèi)的細(xì)胞。在從子宮中取出包囊系統(tǒng)裝置后，將卵泡階段的胚胎從該裝置中取出沖洗，使用常規(guī)轉(zhuǎn)移管移至子宮腔內(nèi)或者在冷凍之后延期在下一個(gè)周期中。
C.體內(nèi)胚胎輔助孵化近來已經(jīng)表明在體外程序中充分研究和描述的卵泡孵化方法已經(jīng)在嚙齒動物中錯(cuò)誤接受，表示一種自然情況(Gonzales等，2001)。確實(shí)，在倉鼠物種中子宮在體內(nèi)有助于卵泡脫掉由子宮分泌的蛋白質(zhì)組成的透明帶，這似乎是在子宮內(nèi)透明帶脫失的主要機(jī)制，而在體外溶胞活性對滋養(yǎng)外胚層的侵襲行為是次要的。
考慮到這種令人驚奇的經(jīng)過，使用本發(fā)明的子宮內(nèi)細(xì)胞包囊裝置暫時(shí)培育胚胎的本發(fā)明方法可以用于進(jìn)行一種新的輔助孵化方法體內(nèi)胚胎輔助孵化。
在這個(gè)基礎(chǔ)上，使用本發(fā)明的細(xì)胞包囊裝置在體內(nèi)和子宮內(nèi)控制時(shí)間地培養(yǎng)配子和/或植入前胚胎，使得在胚胎-母體界面的真實(shí)對話具有來自子宮內(nèi)膜的(或者在輸卵管內(nèi)植入的情況中來自輸卵管)的一些已知但也未知的因子旁分泌作用及最佳發(fā)育的胚胎可以使ART程序中的植入過程更成功。
其它科學(xué)家已經(jīng)描述了配子或胚胎包囊化(Loi等，1992；Nebel等，1993)。然而，他們均使用生物可降解的材料(藻酸鈉)并具有消除與胚胎移植程序相關(guān)的一些問題(創(chuàng)傷)和在植入之前改善胚胎保護(hù)及保護(hù)胚胎的游離透明帶(Cosby等，1990；Adaniya等，1993)。
本發(fā)明人的最佳見解是本發(fā)明中描述的通過使用本發(fā)明的包囊裝置自然培育配子和/或胚胎的新觀點(diǎn)從未由科學(xué)家公布或提議。
本發(fā)明還提供了一種使用通過基因轉(zhuǎn)染而遺傳學(xué)修飾的細(xì)胞系的細(xì)胞包囊裝置以植入子宮腔內(nèi)的方法，這種方法在本發(fā)明之前從未由科學(xué)家公布，所述基因轉(zhuǎn)染如Kopchick等于1984年的美國專利No.4686098及Aebischer等于1987年的美國專利No.4892538所述。
上述這種新裝置使得可以將分子從子宮腔輸送至子宮內(nèi)膜而無全身作用，及可以在ART中體外受精或自然受精之后在胚胎移植之前改變和準(zhǔn)備更特異性的子宮內(nèi)膜，或者可以相反地作為IUD避免任何方式妊娠(抗植入，抗受精)。
將生物活性因子輸送入子宮腔內(nèi)的這種新觀念可以更好地理解對子宮內(nèi)膜組織的特異性旁分泌作用，及可以在不遠(yuǎn)的將來揭示一種新的及加以補(bǔ)充的細(xì)胞治療方法以調(diào)節(jié)和準(zhǔn)備在ART中胚胎植入所需的子宮內(nèi)膜。
實(shí)施例1在小鼠模型中的體內(nèi)和子宮內(nèi)胚胎培養(yǎng)這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是評價(jià)使用改良的半通透的中空纖維作為包裝進(jìn)行體內(nèi)和子宮內(nèi)植入前胚胎發(fā)育的能力。
對在4-6周齡的青春期前雌性小鼠使用卵巢刺激方案獲得合子，所述方案是相應(yīng)于在程序第一天經(jīng)腹膜內(nèi)注射使用5U PMSG(Folligon，Veterinaria)及在第三天在17:00腹膜內(nèi)注射使用5IU人絨毛膜促性腺激素(Choluron，Veterinaria)，間隔48小時(shí)以誘導(dǎo)超排卵。
將雌性小鼠與CBAxC57B1雄性小鼠在注射HCG(第三天)套籠交配。
在雄性與雌性小鼠套籠交配后第5天收集6-8個(gè)細(xì)胞階段的胚胎，在體內(nèi)培養(yǎng)(1組)或者在體外用貫序培養(yǎng)基培養(yǎng)(2組)。只對兩個(gè)具有交配孔栓(plug)的雌性小鼠進(jìn)行操縱并用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)中。
將雌性小鼠通過頸部脫位處死并進(jìn)行剖腹手術(shù)以取出子宮角和輸卵管以收集胚胎。
在第3天將6-8個(gè)細(xì)胞階段的胚胎移至兩個(gè)假妊娠雌性小鼠(受體)的左角或右角。
將1組胚胎(體內(nèi)培養(yǎng))裝填于本發(fā)明經(jīng)修改的中空纖維裝置中(半通透的聚醚砜(PES)中空纖維，得自Akzo Nobel Faser AG，Wuppertal，德國)，所述中空纖維外徑＝680μm，內(nèi)徑＝480μm，長度＝0.5cm，附于一個(gè)6.0號無菌不可再吸收手術(shù)線上，使用細(xì)玻璃移液管在顯微鏡觀察下進(jìn)行裝填。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序在乙醚麻醉下進(jìn)行背部剖腹手術(shù)，以取出右側(cè)或左側(cè)子宮角并將具有被包囊化的合子的子宮內(nèi)裝置植入右角或左角的內(nèi)腔中。
在經(jīng)手術(shù)固定具有被包囊化的合子的子宮內(nèi)裝置后，將所述子宮角再放置入其解剖部位，使用鉤子以閉合皮膚。
在48小時(shí)后，將移植的雌性小鼠通過頸部脫位處死，進(jìn)行剖腹手術(shù)以取出含有子宮內(nèi)裝置的左角和右角并回收所述裝置。
在切下所述裝置的兩個(gè)遠(yuǎn)端部分后收集胚胎，用培養(yǎng)基沖洗包囊化腔。表1示出兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對比了在48小時(shí)培養(yǎng)后6-8個(gè)細(xì)胞階段的胚胎在體內(nèi)和體外(對照)的發(fā)育。
在1組中，所有被包囊化的6-8個(gè)細(xì)胞的胚胎在子宮內(nèi)與在對照組中相似持續(xù)發(fā)育。然而，與體外胚胎培養(yǎng)相比注意到發(fā)育延遲。
這個(gè)實(shí)施例首次揭示了具有被包囊化的胚胎的子宮內(nèi)裝置可以使得其在子宮內(nèi)自然培育，至少與常規(guī)在體外培養(yǎng)的發(fā)育相似。
從可獲得的文獻(xiàn)中，曾經(jīng)認(rèn)為IUD與生殖是相對立的及總是與避孕相關(guān)的。在子宮腔內(nèi)存在外源體已知在所有物種中均干擾生殖。然而，受影響的生殖過程的步驟在文獻(xiàn)中還未清楚。似乎其可以根據(jù)物種的變化而改變。一般認(rèn)可的是IUD誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜局部炎癥反應(yīng)。而在小鼠和大鼠中，這種多形核細(xì)胞的慢性侵潤似乎與細(xì)菌感染相關(guān)及將子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為具有胚胎毒性分泌因子的對立環(huán)境(Parr等，1967)，20年，Alvarez等(1988)揭示了在婦女中在胚泡進(jìn)入子宮腔之前IUD可影響受精。
上述結(jié)果表明小鼠胚胎無退化發(fā)育與一般認(rèn)可的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)相對立，所認(rèn)可的觀點(diǎn)是在動物模型中子宮自身通過釋放一些毒性因子而殺死胚胎。
在體內(nèi)被包囊化的胚胎中示出的發(fā)育延遲可以解釋為孔或內(nèi)腔直徑的大小不合適，導(dǎo)致其周圍營養(yǎng)素濃度較低。另外，在體內(nèi)培養(yǎng)之前在室溫將具有被包囊化的胚胎的IUD植入子宮內(nèi)的時(shí)間，有時(shí)是幾分鐘，可以解釋對植入前胚胎的熱和gazous休克的有害作用。
實(shí)施例2子宮內(nèi)促紅細(xì)胞生成素輸送使用經(jīng)修改和發(fā)明的包囊化的分泌小鼠Epo的小鼠C2C12細(xì)胞在子宮內(nèi)輸送促紅細(xì)胞生成素(Epo)，降低子宮內(nèi)膜中細(xì)胞程序死亡及提高血液血細(xì)胞比容，這提示EPO對鄰近的子宮內(nèi)膜組織的直接作用及從子宮中輸送Epo的全身作用。
促紅細(xì)胞生成素在成人由腎產(chǎn)生，在胎兒由肝產(chǎn)生。其是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的重要因子，通過刺激晚幼紅細(xì)胞增殖和分化而起作用。近來已經(jīng)示出腦具有一種旁分泌Epo/EpoR，Epo可以在腦缺血后防止神經(jīng)細(xì)胞程序死亡(Siren等，2001)。令人感興趣地地，Epo似乎與子宮血管生成相關(guān)。
考慮到Epo的上述生理學(xué)作用，通過測定血液血細(xì)胞比容評價(jià)使用本發(fā)明的細(xì)胞包囊裝置從子宮輸送Epo對子宮內(nèi)膜的作用，及評價(jià)子宮腔內(nèi)該裝置的新植入部位的細(xì)胞存活性。
將小鼠C2C12成肌細(xì)胞用含有小鼠Epo cDNA和突變的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，在施用增加劑量的氨甲蝶呤的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因擴(kuò)增。
將分泌Epo的細(xì)胞系裝填于聚醚砜小孔中空纖維中，以植入子宮腔內(nèi)。這種新發(fā)明的細(xì)胞包囊裝置的特點(diǎn)與實(shí)施例1所述相似。
在本實(shí)驗(yàn)中使用共14個(gè)裝置以盲試形式植入，1組具有Epo分泌作用mEpo-C2C12(n＝7)，2組無Epo分泌作用mEpo-C2C12對照細(xì)胞(n＝7)。
在第14天，根據(jù)處死動物的標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)可方案，取出子宮和回收包囊裝置以進(jìn)行mEpo輸出脈沖。將子宮固定于10％甲醛中，進(jìn)行免疫組織化學(xué)和TUNEL分析測試細(xì)胞程序死亡。
與無Epo輸送的2組(45.7±2.9)相比，具有子宮內(nèi)Epo輸送的1組的血液血細(xì)胞比容明顯提高(59.4±6.8)。注意到在14只雌性小鼠中在子宮內(nèi)輸送Epo 14天后p≤0.005(數(shù)據(jù)未示出)。
注意到Epo與最近描述的其在神經(jīng)細(xì)胞中的作用相似，降低子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞程序死亡。
子宮內(nèi)膜因此是Epo一種新靶位，具有細(xì)胞程序死亡的調(diào)節(jié)作用。
被包囊化入微孔中空纖維內(nèi)的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系在子宮內(nèi)培育14天后是可存活的，其在之前從未作為細(xì)胞包囊裝置的植入部位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
由轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系分泌的Epo穿過該裝置的微孔壁并通過子宮內(nèi)膜吸收及通過全身循環(huán)，明顯提高處理動物血液血細(xì)胞比容。
這些結(jié)果證實(shí)i)通過實(shí)施例1的結(jié)果證實(shí)子宮可以是胚胎附于的良好天然培育器，ii)可以使用婦女或雌性動物的子宮腔作為細(xì)胞包囊系統(tǒng)的植入部位進(jìn)行藥物輸送。
表1
*早期胚泡，在包囊沖洗兩個(gè)胚胎后不可回收×1早期胚泡，1胚胎喪失參考文獻(xiàn)Adaniya GK，Rawlins RG，Quigg JM，Roblero L，Miller IF，Zaneveld Firstpregnancies andlivebirths from transfer of sodium alginate encapsulatedembryos in a rodent model.L J Fertil Steril 1993 59652-6.
Alvarez F，Brache V，F(xiàn)emandez E，Guerrero B，Guiloff E，Hess R Newinsights on the mode of action of intrauterine contraceptive devices in womenFertil Steril 1988 49768-773.
Barmat LI，Liu HC，Spandorfer SD，Xu K，Veeck L，Damario MA，Rosenwaks Z Human preembryo development on autologous endometrialcoculture versus conventional medium.Fertil Steril 1998 701109-13.
Boni R，Tosti E，Roviello S，Dale B.Intercellular communication in invivo-and in vitro-produced bovine embryos Biol Reprod 1999 611050-1055.
Cosby NC，Dukelow WR Microencapsulation of single，multiple，andzonapellucida-free mouse preimplantation embryos in sodium alginate andtheir development in vitro.J Reprod Fertil 1990 9019-24.
Crosier A，F(xiàn)arin P，Dykstra M，Alexander J，F(xiàn)arin C.Ultrastructuralmorphometry of bovine compact morulae produced in vivo or in vitro BiolReprod 2000 621459-1465.
Fassler R and Meyer M Consequences of lack ofpi integrin gene expression inmice.Genes and Development 1995 91876-1908.
Fazleabas A，Donnelly KM，Srinivasan S，F(xiàn)ortman JD，Miller JB.Modulationof the baboon(papio anubis)uterine endometrium by chorionicgonadotrophin during the period of uterine receptivity.Proc Natl Acad Sci1999 962543-8.
Gardner DK，Lane M，Calderone I and Leeton J.Environnement of thepreimplantation human embryo in vivometabolite analysis of oviduct anduterine fluids and metabolism of cumulus cells Fertil Steril 1996 65349-353.Gardner DK，Schoolcraft WB，Wagley L，Schlenker T，Stevens J and Hesla J.
A prospective randomized trial of blastocyst culture and transfer in in vitrofertilization Hum Reprod 1998 133434-3440.
Gonzales D，Bavister B，Mese S.In utero and in vitro proteinase activityduring the Mesocricetus auratus embryo zona escape time window BiolReprod 2001 64222-230.
Levran D，F(xiàn)arhi J，Nahum H，Royburt M，Glezerman M，Weissman A.Prospective evaluation of blastocyst stage transfer vs.zygote intrafallopiantube transfer in patients with repeated implantation failure Fertil Steril 200277971977.
Loi P，Ledda S，Gallus M，F(xiàn)ilia F，Cappai P，Naitana S.Microencapsulationin Na-alginate and in vitro development of sheep blastomeres.Boll Soc ItalBiol Sper1992 68311-4.
Nebel RL，Vishwanath R，McMillan WH，Saacke RG Microencapsulation ofbovine spermatozoa for use in artificial inseminationa review.Reprod FertilDev 1993701-12.
Parr E，Schlaedler R，Hirsch J.The relationshipof polymorphonuclearleukocytes to infertility in uteri containing foreign bodies J Exp Med 1967126523-535.
Robb L，Li R，Hartley L，Nandurkar HH，Koentgen K，Begley CG Infertilityin female mice lacking the receptor for interleukin ll is due to a defectiveuterine response to implantation.Nature Medicine 1998 4303-308.
Simon C，Mercader A，Garcia-Velasco J，Nikas G，Moreno C，Remohi J，Pellicer A Coculture of human embryos with autologous human endometrialepithelial cells in patients with implantation failure.J Clin Endocrinol Metab1999 842638-46.
Siren A-L，F(xiàn)ratelli M，Brines M et al.Erythropoietin prevents neuronalapoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress Proc Natl AcadSci2001 984044-4049.
Shiotani M，Noda Y，Mori T.Embryo-dependent induction of uterinereceptivity assessed by an in vitro model of implantation in mice.Biol Reprod1993 49794-801.
Spandorfer SD，Barmat LI，Navarro J，Liu HC，Veeck L，Rosenwaks ZImportance of the biopsy date in autologous endometrial cocultures forpatients with multiple implantation failures Fertil Steril 2002 771209-121權(quán)利要求
1.一種用于將一或多種能與子宮液相互作用的被包囊化的因子放置在子宮腔內(nèi)的可取式子宮內(nèi)裝置，其包括一種裝填了所述被包囊化的因子的子宮內(nèi)裝置。
2.權(quán)利要求1的可取式子宮內(nèi)裝置，其中所述裝置具有至少一個(gè)腔，其中裝填所述被包囊化的因子。
3.權(quán)利要求1或2的子宮內(nèi)裝置，其中所述因子選自包含以下物質(zhì)的一組-能處理子宮的因子，-能治療任何病變的因子，-分泌一或多種因子的組織，細(xì)胞或細(xì)胞系，-體細(xì)胞，-干細(xì)胞，-作為基因轉(zhuǎn)移載體的重組病毒，-有義或反義mRNA序列，-雄性和/或雌性配子，-受精的卵母細(xì)胞，-未受精的卵，及其任意組合。
4.權(quán)利要求3的可取式子宮內(nèi)裝置，其中所述能處理子宮的因子選自包含以下物質(zhì)的一組-能預(yù)處理子宮壁以進(jìn)行最佳胚胎植入的因子，-能預(yù)處理子宮壁以進(jìn)行最佳卵孵化的因子，-能治療性處理子宮的因子，-避孕制劑。
5.權(quán)利要求3的可取式子宮內(nèi)裝置，其中由組織，細(xì)胞或細(xì)胞系分泌的至少一種因子選自包含以下物質(zhì)的一組藥物，激素，營養(yǎng)素，肽，抗體，營養(yǎng)因子，生長因子，淋巴因子，細(xì)胞因子，酶，凝血因子，血管生成因子，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)節(jié)因子。
6.權(quán)利要求4的可取式子宮內(nèi)裝置，其中能治療性處理子宮的因子選自包含以下物質(zhì)的一組抗炎劑，氨基酸，脂肪酸，抗體，營養(yǎng)因子，生長因子，淋巴因子，細(xì)胞因子，酶，蛋白質(zhì)，肽，凝血因子，血管生成因子，止痛劑，神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)節(jié)因子，抗焦慮藥，抗抑郁藥，抗生素，有義或反義mRNA序列，作為基因轉(zhuǎn)移載體的重組病毒。
7.權(quán)利要求3的可取式子宮內(nèi)裝置，其中所述的至少一種因子是由經(jīng)遺傳學(xué)修飾的組織，細(xì)胞或細(xì)胞系分泌的。
8.前述任何權(quán)利要求的可取式子宮內(nèi)裝置，其中所述因子能治療癌癥，各種生殖系統(tǒng)癌癥，生殖疾病及子宮疾病如子宮內(nèi)膜炎，子宮內(nèi)膜異位，子宮出血及各種感染。
9.一種制備用于將一或多種能與子宮液相互作用的被包囊化的因子放置在子宮腔內(nèi)的可取式子宮內(nèi)裝置方法，包括以下步驟-提供適合被包囊化的形式的所述因子，-提供一種適于接受一或多種被包囊化因子的可取式子宮內(nèi)裝置，-將所述一或多種因子裝填入所述裝置中。
10.一種用于將一或多種能與子宮液相互作用的被包囊化的因子放置在子宮腔內(nèi)的方法，包括以下步驟-提供權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的一種可取式子宮內(nèi)裝置，-將所述裝置植入子宮腔內(nèi)持續(xù)一定時(shí)間。
11.權(quán)利要求10的方法，其中將至少一種被包囊化的因子置于哺乳動物的子宮腔內(nèi)。
12.權(quán)利要求10或11的方法，其中所述哺乳動物選自包含以下動物的一組牛，綿羊，豬，馬和人。
全文摘要
一種用于將一或多種能與子宮液相互作用的被包囊化的因子(1)放置于子宮腔內(nèi)的可取式子宮內(nèi)裝置，其包括一種裝填了所述的被包囊化的因子(1)的子宮內(nèi)裝置。
文檔編號A61B17/435GK1561186SQ02819398
公開日2005年1月5日 申請日期2002年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月1日
發(fā)明者帕斯卡爾·莫克 申請人:帕斯卡爾·莫克