專利名稱：用于局部施用和經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的組合物和方法
用于局部施用和經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的組合物和方法本申請要求于2005年3月3日申請的美國暫時專利申請案No. 60/658，434的優(yōu)先權(quán)。美國專利申請No. 60/658，434在這里通過全文引入作為參考。
背景技術(shù)：
皮膚保護(hù)身體的器官免受外界環(huán)境威脅并用作維持體溫的恒溫器。它由幾個不同的層組成，每一層具有專門的功能。主要的層包括表皮層、真皮層和皮下組織。表皮層是在真皮層上的分層的上皮細(xì)胞，真皮層由結(jié)締組織組成。表皮層和真皮層都進(jìn)一步由內(nèi)層脂肪組織的皮下組織支持。表皮層(皮膚的最上層)只有0. 1-1. 5毫米厚(Inlander，Skin, New York, NY People' s Medical Society，1-7 (1998))。它由角質(zhì)形成細(xì)胞組成并基于它們的分化狀態(tài)分為若干層。表皮層可進(jìn)一步分為角質(zhì)層和有活力的表皮，表皮由顆粒狀melphigian和基底細(xì)胞組成。角質(zhì)層是吸濕性的并且需要至少10%重量的水分來維持它的彈性和軟度。 吸濕性可部分地歸因于角蛋白的持水能力。當(dāng)角質(zhì)層喪失它的軟度和彈性時，它變得粗糙和易裂，導(dǎo)致干性皮膚。緊接在表皮層下面的真皮層為1.5-4毫米厚。它是皮膚的三層中最厚的層。另外，真皮層還是大部分皮膚結(jié)構(gòu)的所在地，包括汗腺和脂腺(其通過皮膚中稱為毛孔或粉刺的開口分泌物質(zhì))、毛囊、神經(jīng)末梢，以及血液和淋巴管(Inlander，Skin, New York, NY People' sMedical Society，1-7 (1998))。但是，真皮層的主要成分是膠原蛋白和彈性蛋白。皮下組織是皮膚的最深層。它擔(dān)當(dāng)用于身體熱量保存的隔熱體并擔(dān)當(dāng)用于器官保護(hù)的減震器(Inlander, Skin, New York, NY =People' s Medical Society，1-7 (1998))。另外，皮下組織還存儲脂肪用于能量儲備。皮膚的PH通常在5和6之間。該酸度是由于存在兩性氨基酸、乳酸，以及皮脂腺分泌的脂肪酸。術(shù)語“酸性外膜(acid mantle)”指在皮膚的大部分區(qū)域上水溶性物質(zhì)的存在。皮膚的緩沖能力部分歸因于皮膚角質(zhì)層中儲藏的這些分泌物。皮膚的其中一項(xiàng)主要功能是為可能對正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有害的水和物質(zhì)的運(yùn)輸提供一個屏障。如果沒有堅(jiān)韌的、半滲透性的皮膚，身體將會迅速脫水。皮膚有助于防止有害物質(zhì)進(jìn)入身體。皺紋是衰老的一個指示跡象，可通過從環(huán)境損害積累的生物化學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)變化弓丨起(Benedetto, International Journal of Dermatology, 38 :641-655 (1999))。 另外，存在能引起面部皺紋的特征性褶、溝和皺褶的其它次要因素(Stegman等，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery,2nd ed. , St. Louis, MO :Mosby Year Book :5_15 (1990))。這些次要因素包括皮膚受到重力的持續(xù)拉力、頻繁且持續(xù)的位置壓力(即在睡覺過程中)，以及由面部肌肉收縮引起的重復(fù)的面部運(yùn)動(Stegman等，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery,2nd ed. , St. Louis, MO Mosby Year Book :5-15 (1990))。已經(jīng)采用不同的技術(shù)以可能減輕一些衰老跡象。這些技術(shù)從含有α羥酸和維生素A的面部增濕劑到手術(shù)操作以及注射神經(jīng)毒素。例如，在1986年，Jean和Alastair Carruthers (由眼整形外科醫(yī)師和皮膚科醫(yī)師組成的夫妻團(tuán)隊(duì))開始發(fā)展A型肉毒桿菌毒素的美容用途，用于處理眉間區(qū)域中與運(yùn)動相關(guān)的皺紋(Schantz and Scott, In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum, New York :Academic Press,143-150(1981))。 Carruthers將A型肉毒桿菌用于處理皺紋的使用導(dǎo)致他們在1992年開創(chuàng)性地發(fā)表了該方法(Schantz and Scott,In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum,New York Academic Press，143-150 (1981))。到1994年，該小組報(bào)道了對面部上其它運(yùn)動-相關(guān)皺紋的體驗(yàn)Gcott，Ophthalmol，87 1044-1049 (1980))。這接下來導(dǎo)致美容性A型肉毒桿菌處理時代的誕生。除了 A型肉毒桿菌(botul inum)，存在血清學(xué)相關(guān)但不同的7種其它的肉毒桿菌毒素?？偟膩碚f，肉毒桿菌毒素(也稱為肉毒桿菌毒素或肉毒桿菌神經(jīng)毒素)是通過革蘭氏陽性細(xì)菌肉毒桿菌(Clostridium botul inum)產(chǎn)生的神經(jīng)毒素。它們通過阻止突觸傳遞或釋放乙酰膽堿跨越神經(jīng)肌接點(diǎn)來產(chǎn)生肌肉麻痹，并認(rèn)為也可以以其它的方式起作用。它們的作用基本上阻斷了通常會引起肌肉痙攣或收縮的信號，導(dǎo)致麻痹。在這8種血清學(xué)相關(guān)的肉毒桿菌毒素中，有7種能引起麻痹，即肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A、B、C、D、E、F和G。這7種的每種通過類型特異性抗體的中和作用區(qū)分。但是，對于所有7種這些活性肉毒桿菌毒素血清型，肉毒桿菌毒素蛋白質(zhì)分子的分子量都是約150kD。 正如通過細(xì)菌釋放的，肉毒桿菌毒素是含有所討論的150kD肉毒桿菌毒素蛋白質(zhì)分子連同相關(guān)非毒素蛋白質(zhì)的復(fù)合體。A型肉毒桿菌毒素復(fù)合體可由梭菌屬細(xì)菌以900kD、500kD和 300kD的形式產(chǎn)生。B和C型肉毒桿菌毒素顯然只作為700kD或500kD的復(fù)合體產(chǎn)生。D型肉毒桿菌毒素作為300kD和500kD的復(fù)合體產(chǎn)生。E和F型肉毒桿菌毒素只作為約300kD 的復(fù)合體產(chǎn)生。據(jù)認(rèn)為所述復(fù)合體(即分子量大于約150kD)含有非毒素血凝素蛋白質(zhì)以及非毒素且無毒的非血凝素蛋白質(zhì)。在攝入毒素時，這兩種非毒素蛋白質(zhì)(其連同肉毒桿菌毒素分子一起構(gòu)成了相關(guān)的神經(jīng)毒素復(fù)合體)可用于提供對抗肉毒桿菌毒素分子變性的穩(wěn)定性和當(dāng)其被消化時保護(hù)其對抗消化性酸。另外，有可能較大的(大于約150kD分子量)肉毒桿菌毒素復(fù)合體可導(dǎo)致肉毒桿菌毒素以較慢的擴(kuò)散速率離開肉毒桿菌毒素復(fù)合體的肌內(nèi)注射位點(diǎn)。不同血清型的肉毒桿菌毒素在它們感染的動物種以及它們引起的麻痹的嚴(yán)重性和持續(xù)時間上不同。例如，如通過在大鼠中測量產(chǎn)生的麻痹速率，已經(jīng)確定A型肉毒桿菌毒素比B型肉毒桿菌毒素有效500倍。另外，已經(jīng)確定B型肉毒桿菌毒素在劑量為480U/ kg(約為A型肉毒桿菌毒素的靈長類LD5tl的12倍)時在靈長類中是無毒的。由于肉毒桿菌毒素的分子大小和分子結(jié)構(gòu)，它不能夠通過角質(zhì)層和下面的皮膚結(jié)構(gòu)的多個層。全身性肉毒桿菌毒素曝露引起的中毒癥狀(稱為肉毒中毒)自古代以來就在歐洲存在。在1895年，Emile P. van Ermengem首次從生的咸豬肉分離出厭氧性產(chǎn)芽孢桿菌，所述的豬肉從在比利時死于肉毒中毒的豬的死后組織獲得。Van Ermengem發(fā)現(xiàn)該疾病是由他所命名的肉毒芽孢桿菌產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素引起(Van Ermengem, Z Hyyg Infektionskr, 26 1-56 ；Rev Infect (1897)) 該名稱在1992年更改成肉毒桿菌。名稱梭狀芽孢桿菌用于反映這種微生物的厭氧特性以及它的形態(tài)特征(Carruthers和Carruthers，Can J Ophthalmol, 31 :389-400 (1996))。在20世紀(jì)20年代，在多次爆發(fā)食物中毒后粗產(chǎn)物形式的A型肉毒桿菌毒素得以分離。舊金山加利福尼亞大學(xué)的Herman Sommer博士第一次嘗試純化該神經(jīng)毒素(Borodic 等，Ophthalmic Plast Recostr Surg，7 :54-60 (1991))。在 1964年，Edward J. Schantz博士和他的同事分離出結(jié)晶體形式的上述神經(jīng)毒素(Schantz 等，In Jankovi J, Hallet M(Eds)Therapy with Botulinum Toxin, New York, NY :Marcel Dekker，41-49 (1994))。到1949年，Burgen和他的同事能夠證明肉毒桿菌毒素阻斷了跨越神經(jīng)肌肉接點(diǎn)的神經(jīng)沖動(Burgen 等，J Physiol, 109 10-24(1949)) 1973 年，Allan B. Scott首次在猴中使用肉毒桿菌毒素A(BTX-A)。Scott證明了持續(xù)3個月的可逆的眼肌麻痹(Lamanna, Science, 130 :763-772 (1959))。不久之后，報(bào)道了 BTX-A 是一種對人的斜視、臉痙攣和痙攣性斜頸的成功的療法(Baron等，In =Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM(Eds), Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, St. Louis, MO :Mosby Year Book,504-523 (1994) ；Carruthers 禾口 Carruthers，Adv Dermatol, 12 :325-348 (1997)； Markowitz, In :Strickland GT(Eds)Hunters Tropical Medicine, 7th ed.Philadelphia W. B. Saunders，441-444(1991))。A型肉毒桿菌毒素?fù)?jù)說是人類已知的最致命性的天然生物制劑。肉毒桿菌的孢子在土壤中發(fā)現(xiàn)并能夠在不正確消毒的且密封的食物容器中生長。 該細(xì)菌的攝入可導(dǎo)致肉毒中毒，這可能是致命的。同時，肉毒桿菌毒素的肌肉-麻痹效應(yīng)已經(jīng)用于治療目的。肉毒桿菌毒素的受控施用已經(jīng)用于提供肌肉麻痹來治療病癥，例如表征為機(jī)能亢進(jìn)的骨骼肌的神經(jīng)肌肉障礙。已經(jīng)用肉毒桿菌毒素治療的病癥包括半側(cè)面痙攣、成年型痙攣性斜頸、肛裂、臉痙攣、 腦性麻痹、宮口梗阻性難產(chǎn)、偏頭痛、斜視、顳側(cè)下頌關(guān)節(jié)障礙(temperomandibular joint disorder)，以及多種類型的肌肉痛性痙攣和痙攣。更近一些時候，已經(jīng)利用肉毒桿菌毒素的肌肉-麻痹效應(yīng)用于治療性和美容性面部施用例如處理皺紋、皺眉引起的皺紋，以及面部肌肉痙攣或收縮的其它結(jié)果?？紤]到肉毒桿菌毒素的毒性以及它的治療用途潛力，開發(fā)用于安全施用該毒素的組合物和方法將是所期望的。肉毒桿菌毒素的局部施用因?yàn)橄铝性蚨鴮峁└踩腋硐氲闹委焸溥x方案施用的無痛性質(zhì)、可覆蓋的更大治療表面積、制備具有更高比活性的純毒素的能力、應(yīng)用肉毒桿菌治療所需訓(xùn)練的減少、產(chǎn)生理想效果所需的量更少，以及不需要大量毒素來達(dá)到治療性的臨床效果。用于經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的有效手段，以及用于施用肉毒桿菌毒素治療或預(yù)防不需要注射的許多病癥的有效手段因而是非常理想的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有肉毒桿菌毒素的新的組合物，更特別涉及這樣的組合物，其能夠通過皮膚或上皮組織輸送或遞送(也稱為“經(jīng)皮膚遞送”)肉毒桿菌毒素，并因此可局部施用來提供肉毒桿菌毒素給受試者，用于如在此描述的多種治療、美容和/或美學(xué)目的。本發(fā)明的一方面是提供含有肉毒桿菌毒素和載體的組合物。該載體具有連接有帶正電荷的分支基團(tuán)的聚合主鏈。載體和肉毒桿菌毒素之間的連接是非共價的。本發(fā)明還提供了施用肉毒桿菌毒素給受試者的方法，該方法包括局部施用給受試者的皮膚或上皮組織與有效量載體結(jié)合的肉毒桿菌毒素。該載體具有連接有帶正電荷的分支基團(tuán)的聚合主鏈，并且與肉毒桿菌毒素非共價結(jié)合。本發(fā)明的另一個方面是提供制劑，所述的制劑含有肉毒桿菌毒素、帶正電荷的主鏈，以及至少一種選自分配劑(partitioning agent)、寡聚-橋(oligo-bridge)和聚陰離子橋(polyanion bridge)的成員，這樣肉毒桿菌毒素與帶正電荷的主鏈非共價地復(fù)合。該制劑可用于通過施用制劑至皮膚區(qū)域來處理皺紋。如果需要，可在施用該制劑后施用遮蔽劑(occlusion agent)0本發(fā)明的制劑還可用于治療多汗癥。本發(fā)明考慮的治療方法包括施用給皮膚區(qū)域本發(fā)明制劑以及隨后任選施用遮蔽劑。本發(fā)明的另一方面是提供用于施用肉毒桿菌毒素給受試者的試劑盒。該試劑盒包含以用于其經(jīng)皮膚遞送的有效量存在的肉毒桿菌毒素，以及載體，所述載體具有連接有帶正電荷的分支基團(tuán)的聚合主鏈。載體和肉毒桿菌毒素之間的結(jié)合是非共價的。然而，本發(fā)明的另一方面是提供用于施用肉毒桿菌毒素給受試者的試劑盒。該試劑盒包含用于遞送肉毒桿菌毒素至皮膚的裝置和含有載體的組合物，所述載體具有連接有帶正電荷的分支基團(tuán)的聚合主鏈，所述的分支基團(tuán)選自-(glyL-brg、、HIV-TAT及其片段，以及Antermapedia PTD，其中下標(biāo)nl是0至約20的整數(shù)，并且下標(biāo)n2獨(dú)立地是從約5 至約25的奇整數(shù)。在一個方面，本發(fā)明涉及含有肉毒桿菌毒素(如在此定義的)和載體的組合物，所述載體包含具有帶正電荷的分支或效應(yīng)基團(tuán)的帶正電荷的“主鏈”，如在此描述的。最優(yōu)選地，帶正電荷的載體是長鏈帶正電荷的多肽或帶正電荷的非肽基聚合物，例如聚亞烷基亞胺。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于通過局部施用有效量的這種組合物優(yōu)選至需要這種治療的受試者或患者的皮膚而產(chǎn)生生物效應(yīng)的方法，所述的生物效應(yīng)例如是肌肉麻痹、減少分泌過多或出汗、治療神經(jīng)性疼痛或偏頭痛、減少肌肉痙攣、預(yù)防或減少粉刺，或者減少或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生美容或美學(xué)效果的方法，例如通過局部施用肉毒桿菌毒素至面部而不是通過注射進(jìn)面部肌肉。本發(fā)明還提供了用于制備或配制組合物的試劑盒，所述的組合物包含載體和肉毒桿菌毒素，以及產(chǎn)生可使用的制劑或可依次用于產(chǎn)生這種制劑的預(yù)混合物所需的另外的物質(zhì)。備選地，該試劑盒包括用于分別施用，但是協(xié)同作用，施用肉毒桿菌毒素和載體給受試者的手段。附圖簡述

圖1顯示了一個實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)證明了用含有肽主鏈的本發(fā)明組合物經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的效力。圖2是描述小鼠的后肢狀態(tài)的照片，其中一個后肢區(qū)域用本發(fā)明的組合物處理， 而另一后肢區(qū)域用不含根據(jù)本發(fā)明的載體的另一種含有肉毒桿菌毒素的組合物處理。圖3是描述在用Revance’ s肉毒桿菌制劑局部處理之前和之后受試者前額上的皺紋的照片。圖4顯示了(A)在用Revance’ s肉毒桿菌制劑局部處理皺紋之后以及(b)在處理之前前額的Mikrosil印跡(cast)。這些Mikrosil印跡清楚地顯示未處理的一側(cè)具有更深的皺紋，所述的Mikrosil印跡是有用的，因?yàn)樗鼈兪箍赡軄碜越o真實(shí)受試者照相的人為因
素最小化。圖5 圖5顯示描述在處理之前于受試者前額上進(jìn)行的Minor’ s淀粉/碘試驗(yàn)的照片。圖6 圖6a顯示描述在施用Revance’ s肉毒桿菌制劑(A)和對照制劑(B) 5天后Minor' s淀粉/碘試驗(yàn)的照片。對照制劑含有分子量約21，000并具有TAT分支基團(tuán)的帶正電荷的多聚賴氨酸主鏈。這些照片在施用2分鐘后獲得。圖6b與圖6a相同，除了它們在經(jīng)過4分鐘后獲得以外。圖7 顯示在腋下多汗癥試驗(yàn)中使用的給藥區(qū)域。注意到，該給藥區(qū)域的范圍超過了腋毛覆蓋的皮膚區(qū)域1厘米。圖8 圖8a顯示了一個試驗(yàn)結(jié)果，該試驗(yàn)證明了肉毒桿菌毒素治療人受試者的腋下多汗癥的效力，所述的肉毒桿菌毒素作為使用短的肽基載體的局部用藥劑治療性地遞送穿過完整的皮膚。該圖描述了在用Botox加上短的肽基載體或單獨(dú)用載體處理4周后按重量分析測量到的汗量(mg/5分鐘)的顯著減少。結(jié)果是作為與相同組基準(zhǔn)值的比率的4 周的值，顯著性通過Wilcoxon分析(P <0.05、N= 10個患者)測定。圖8b顯示了一個試驗(yàn)結(jié)果，該試驗(yàn)證明肉毒桿菌毒素治療人受試者的腋下多汗癥的效力，所述的肉毒桿菌毒素使用短的肽基載體作為局部用藥劑治療性地遞送經(jīng)過完整的皮膚。該圖描述了在用 Botox加上短的肽基載體或單獨(dú)用載體處理4周后按重量分析測量到的汗量(mg/5分鐘) 的顯著減少。結(jié)果是作為對兩者時間點(diǎn)的對照值的比率的治療值，其顯著性通過Wilcoxon 分析(P < 0. 05、N = 10個患者)測定。圖9顯示了描述Minor’ s淀粉/碘試驗(yàn)的照片，所述試驗(yàn)在用Revance’ s肉毒桿菌制劑局部處理來治療腋下多汗癥之前和之后進(jìn)行。顯示了基線和2周時的淀粉碘試驗(yàn)， 其中受試者#12的右側(cè)腋窩用Revance’ s肉毒桿菌制劑處理(a和c)而左側(cè)腋窩施用對照 (b和d)。這些照片說明了在碘淀粉試驗(yàn)中用載體+botox處理后觀察到的典型的效果。雖然在對照一側(cè)上觀察到一些交叉(與重量分析數(shù)據(jù)減少25%—致)，但是處理引起顯著減少(與經(jīng)處理的一側(cè)的重量分析數(shù)據(jù)減少65%—致)。圖11 在兩個不同動物中局部施用無載體的肉毒桿菌毒素(a和c)或有KNR的肉毒桿菌毒素(b和d) 7天后，通過碘-淀粉染色法(深藍(lán)色的為陽性)顯示的小鼠足部汗的產(chǎn)生。圖10 圖10 (a)顯示了在施用對照制劑給雄性O(shè)Tl小鼠后的肌力(muscle force) 產(chǎn)生。圖10(b)顯示了在施用局部用“RevanceBotox溶液”后的肌力產(chǎn)生。圖12 改良的Franz Chamber。(a)儀器裝置，包括貯器、循環(huán)式水浴鍋、在線蠕動泵、在線Franz chamber和級分收集器。(b)單個的Franz chamber的橫截面，顯示了輸入管和輸出管、皮膚膜，以及供體化合物的放置。圖13 :K30T相對于對照樣品的增加的流通量。(a)K30T對多聚賴氨酸(b)K30T對無載體。圖14 在豬皮膚模型中Revance載體遞送A型肉毒桿菌毒素穿過皮膚屏障的效力用改良的Franz chamber評估。顯示了局部施用后增加的毒素流通量(圖13a_f)。每個圖描述了以不同載體毒素質(zhì)量比遞送穿過豬的皮膚的局部用毒素的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差百分比。圖15 描述鏈霉抗生物素蛋白染色(藍(lán)色為陽性)的代表性顯微照片，所述的鏈霉抗生物素蛋白染色是在局部施用無載體的生物素化肉毒桿菌毒素(對照組，a-c)，或具有K30T載體的生物素化肉毒桿菌毒素(處理組，d-f)后進(jìn)行。圖16 該圖顯示了對于含有K15T2的NNX (處理組)、無載體的NNX (對照組)以及NNX注射肌力減少的百分比。圖17 該圖顯示了在局部施用A型肉毒桿菌毒素后減少了前額的皺紋。人受試者 1在頂行并且受試者2在底端行。該圖舉例說明了處理前(基線)和處理后的狀況。圖18 比較了根據(jù)本發(fā)明的制劑和對照制劑的人的腋下多汗癥試驗(yàn)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于通過局部施用合適的制劑遞送、尤其經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的組合物和方法。根據(jù)本發(fā)明，具有效應(yīng)基團(tuán)的帶正電荷的載體分子，如在此描述的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)適合作為肉毒桿菌毒素的運(yùn)輸系統(tǒng)，使得毒素能夠經(jīng)皮膚施用至肌肉和/或其它皮膚相關(guān)組織。運(yùn)輸發(fā)生，而無需共價修飾肉毒桿菌毒素?！皫д姾傻摹北硎据d體在至少一些液相條件下，更優(yōu)選在至少一些生理學(xué)兼容的條件下帶有正電荷。更優(yōu)選地，如在此使用的，“帶正電荷的”表示所考慮的基團(tuán)含有在所有PH條件下帶電荷的官能團(tuán)，例如季胺，或者含有在某些液相條件下，例如在伯胺的情形中PH變化的條件下，可獲得正電荷的官能團(tuán)。更優(yōu)選的，如在此使用的，“帶正電荷的”指具有在生理學(xué)兼容條件下與陰離子締合的行為的那些基團(tuán)。具有多個帶正電荷的部分的聚合物不必是均聚物，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。帶正電荷的部分的其它實(shí)例是現(xiàn)有技術(shù)所熟知的并可容易地采用，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。一般而言，帶正電荷的載體(也稱為“帶正電荷的主鏈”)通常是原子組成的直鏈， 其鏈中的基團(tuán)在生理PH下帶正電荷，或帶正電荷的基團(tuán)連接至從主鏈延伸的側(cè)鏈上。優(yōu)選地，帶正電荷的主鏈自身將不具有確定的酶促活性或治療性生物學(xué)活性。線性主鏈?zhǔn)菬N主鏈，在一些實(shí)施方案中，其由選自氮、氧、硫、硅和磷的雜原子間插。大多數(shù)主鏈的原子通常是碳。另外，主鏈將通常是重復(fù)單位(例如，氨基酸、聚(乙烯氧基)、聚(丙烯胺)、聚亞烷基亞胺等)的聚合物但可以是雜聚物。在一組實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)瞧渲性S多胺氮原子作為攜帶正電荷的銨基(四-取代的)存在的聚丙烯胺。在另一個實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)欠请幕酆衔铮淇梢允请s聚物或均聚物例如聚亞烷基亞胺，如聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺，分子量約10，000-2, 500, 000、優(yōu)選約100，000-1, 800, 000,并且最優(yōu)選約 500，000-1，400，000。在另一組實(shí)施方案中，主鏈已經(jīng)連接有多個包含帶正電荷的基團(tuán)(例如銨基、吡啶錢、磷銀、锍、胍基團(tuán)(guanidinium)或amidinium基團(tuán))的側(cè)鏈部分。該組實(shí)施方案中的側(cè)鏈部分可沿主鏈間隔放置，間隔是一致的或可變的。另外，側(cè)鏈的長度可以相似或不同。例如，在一組實(shí)施方案中，側(cè)鏈可以是具有1-20個碳原子并在遠(yuǎn)端(遠(yuǎn)離主鏈)以上述帶正電荷的基團(tuán)之一結(jié)尾的直或分支的烴鏈。在本發(fā)明的所有方面，載體與生物活性制劑之間的結(jié)合是通過非共價相互作用，其非限制性實(shí)例包括離子相互作用、氫鍵結(jié)合、范德華力或其組合。在一組實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)蔷哂卸鄠€帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)(例如賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)的多肽。優(yōu)選地，該多肽的分子量為約 10，000-1，500，000，更優(yōu)選約 25，000-1，200，000，最優(yōu)選約 100，000-1，000，000。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，當(dāng)氨基酸用于本發(fā)明的這個部分時，在連接的中心，側(cè)鏈可具有D-或L-型(R或S構(gòu)型)。備選地，主鏈可以是多肽的類似物例如類肽(ρ印toid)。 參見，例如 Kessler，Angew. Chem. Int. EcL Engl. 32 :543(1993) ;Zuckermann 等，Chemtracts-Macromol. Chem. 4 :80(1992) MR Simon 等’ Proc. Nat' 1. Acad. Sci. USA 89 9367(1992))。簡而言之，類肽是其中側(cè)鏈連接至主鏈氮原子而不是α-碳原子的多聚甘氨酸。同上，一部分側(cè)鏈通常將會以帶正電荷的基團(tuán)結(jié)尾以提供帶正電荷的主鏈成分。類肽的合成在例如美國專利No. 5，877，278中描述，其在這里通過全文引入作為參考。如在此使用的術(shù)語，具有類肽主鏈結(jié)構(gòu)的帶正電荷的主鏈認(rèn)為是“非肽”的，因?yàn)樗鼈儾皇怯稍讦?-碳位置具有天然存在的側(cè)鏈的氨基酸組成。可使用多種其它主鏈，例如采用其中肽的酰胺鍵用代用品例如酯鍵、硫代酰胺(-CSNH-)、反向的硫代酰胺(-NHCS-)、氨基亞甲基(-NHCH2-)或反向的亞甲基氨基(-CH2NH-)基團(tuán)、酮-亞甲基(-COCH2-)基團(tuán)、次膦酸酯(-PO2RCH2-)、膦酰胺(phosphonamidate)和膦酰胺酯(phosphonamidate ester) (-PO2RNH-)、反向的肽(-NHC0-)、反式-烯基(-CR = CH-)、氟代烯(-CF = CH-)、二亞甲基(-CH2CH2-)、硫醚(-CH2S-)、羥基亞乙基(-CH (OH) CH2-)、亞甲基氧基(-CH2O-)、四唑(CN4)、磺酰氨基 (-SO2NH-)、亞甲基磺酰氨基(-CHRSO2NH-)、反向的磺酰胺基(-NHSO2-)替換的多肽的空間或電子模擬物，以及具有丙二酸酯和/或偕-二氨基-烷基亞單位的主鏈，例如，通過 Fletcher等人綜述的((1998)Chem. Rev. 98 :763)以及通過其中引用的參考文獻(xiàn)詳細(xì)描述的。許多前述的取代產(chǎn)生相對于由α-氨基酸形成的主鏈近似等排的聚合物主鏈。在上面提供的每個主鏈中，可以添加攜帶帶正電荷的基團(tuán)的側(cè)鏈基團(tuán)。例如，磺酰胺-連接的主鏈(-SO2NH-和-NHSO2-)可具有連接至氮原子的側(cè)鏈基團(tuán)。類似地，羥基乙烯基(-CH(OH)CH2-)鍵可具有連接至羥基取代基的側(cè)鏈基團(tuán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地修改其它鍵化學(xué)來用標(biāo)準(zhǔn)合成方法提供帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)。在一個實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)蔷哂蟹种Щ鶊F(tuán)(也稱為效應(yīng)基團(tuán))的多肽。 如在此使用的，效應(yīng)基團(tuán)或分支基團(tuán)是具有促進(jìn)帶正電荷主鏈運(yùn)送通過組織或細(xì)胞膜的效果的任何物質(zhì)。所述分支或效應(yīng)基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括-(glyhdardfHIV-TAT或其片段，或Antermapedia的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，或其片段，其中下標(biāo)nl是0-20，更優(yōu)選0_8， 依然更優(yōu)選2-5的整數(shù)，并且下標(biāo)n2獨(dú)立地是約5-25，更優(yōu)選約7-17，最優(yōu)選約7_13的奇整數(shù)。更進(jìn)一步優(yōu)選的是其中HIV-TAT片段具有式(gly^RGRDDRRQRRlHgly),、(gly) p-YGRKKRRQRRR-fely),或(gly^-RKKRRQRRR-fely),的那些實(shí)施方案，其中下標(biāo) ρ 禾Π q 各自獨(dú)立地是從0-20的整數(shù)并且所述片段經(jīng)由該片段的C-端或N-端連接至主鏈。優(yōu)選的 HIV-TAT片段是其中下標(biāo)ρ和q各自獨(dú)立地是0-8，更優(yōu)選2-5的整數(shù)。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，帶正電荷的側(cè)鏈或分支基團(tuán)是AntermapediWAntp)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)， 或其保留活性的片段。優(yōu)選地，帶正電荷的載體包含側(cè)鏈帶正電荷的分支基團(tuán)，所述分支基團(tuán)的量為總載體重量的至少約0. 05%，優(yōu)選約0. 05-45%重量，并且最優(yōu)選約0. 1-30%重量。對于具有式(glyL-brg)^的帶正電荷的分支基團(tuán)，最優(yōu)選的量是約0.1-25%。在另一個實(shí)施方案中，主鏈部分是多聚賴氨酸并且?guī)д姾傻姆种Щ鶊F(tuán)連接至賴氨酸側(cè)鏈的氨基酸。多聚賴氨酸可具有的分子量為約10，000-1，500，000，優(yōu)選約 25，000-1, 200, 000,并且最優(yōu)選約100，000-1, 000, 000。其可以是任何可商業(yè)獲得的(Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA)多聚賴氨酸，例如 MW > 70, 000 的多聚賴氨酸、MW為70，000-150, 000的多聚賴氨酸、MW為150，000-300, 000的多聚賴氨酸以及MW > 300, 000的多聚賴氨酸。合適的多聚賴氨酸的選擇將取決于組合物的剩余部分，并將足以總體提供凈正電荷給組合物并提供優(yōu)選為帶負(fù)電荷成分的組合長度的1-4倍的長度。優(yōu)選的帶正電荷的分支基團(tuán)或效應(yīng)基團(tuán)包括，例如-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg (-Gly3Arg7)或HIV-TAT。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，帶正電荷的主鏈?zhǔn)情L鏈的聚亞烷基亞胺例如聚乙烯亞胺，如分子量為約1，000, 000的聚乙烯亞胺。包含多肽或聚亞烷基亞胺的帶正電荷的主鏈或載體分子是新的化合物并形成本發(fā)明的一個方面，所述的主鏈或載體分子具有上述分支基團(tuán)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，僅具有帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的載體是經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素所需的。在特定的實(shí)施方案中，帶正電荷的載體是具有多個帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)的多肽(如賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)，如上描述的。優(yōu)選地，所述多肽分子量至少為約10，000。在另一個實(shí)施方案中，帶正電荷的載體是非肽基聚合物例如分子量至少約100,000的、具有多個帶正電荷的側(cè)鏈基團(tuán)的聚亞烷基亞胺。這種聚亞烷基亞胺包括聚乙烯-和聚丙烯亞胺。在任一情況中，為了用作經(jīng)皮膚遞送唯一需要的制劑，帶正電荷的載體分子包含帶正電荷的分支或效應(yīng)基團(tuán)，包括-(gly) nl- (arg) n2、HIV-TAT或其片段，或者Antermapedia PTD或其片段，其中下標(biāo)nl是0_20，更優(yōu)選0_8，更優(yōu)選2_5的整數(shù)，并且下標(biāo)n2獨(dú)立地是約5-25，更優(yōu)選約7-17，并且最優(yōu)選約7_13的奇整數(shù)。優(yōu)選地，所述側(cè)鏈或分支基團(tuán)具有如上描述的通式-(glyL-brg)^。其它優(yōu)選的實(shí)施方案是其中分支或效應(yīng)基團(tuán)是具有式(gly^-RGRDDRRQRRR-fely),、(gly^YGRKKRRQRRR-fely),或(gly) p-RKKRRQRRR-fely),的HIV-TAT片段的那些，其中下標(biāo)ρ和q各自獨(dú)立的是0_20的整數(shù)并且所述片段通過該片段的C-端或N-端連接至載體分子。在連接中心，側(cè)鏈的分支基團(tuán)可具有D-或L-型(R或S構(gòu)型)。優(yōu)選的HIV-TAT片段是其中下標(biāo)ρ和q各自獨(dú)立地是0_8， 更優(yōu)選2-5的整數(shù)的那些。其它優(yōu)選的實(shí)施方案是其中分支基團(tuán)是Antermapedia PTD基團(tuán)或其保持該基團(tuán)活性的片段的那些。這些在本領(lǐng)域例如從Console等，J. Biol. Chem. 278 35109(2003)得知。優(yōu)選地，帶正電荷的載體包含側(cè)鏈帶正電荷的分支基團(tuán)，所述分支基團(tuán)的量是總載體重量的至少約0. 05%，優(yōu)選約0. 05-45%重量，并且最優(yōu)選約0. 1-30%重量。 對于具有式_(gly)nl-(arg)n2的帶正電荷的分支基團(tuán)，最優(yōu)選的量是約0. 1-25%。在另一個實(shí)施方案中，載體是具有帶正電荷的分支基團(tuán)的多聚賴氨酸，所述的分支基團(tuán)連接至賴氨酸側(cè)鏈氨基上。在該特定實(shí)施方案中使用的多聚賴氨酸可以是任何可商業(yè)獲得的(例如 Sigma Chemical Company, St. Louis,Missouri,USA)多聚賴氨酸，例如 MW > 70，000的多聚賴氨酸、MW為70，000-150，000的多聚賴氨酸、MW為150，000-300，000的多聚賴氨酸以及MW > 300,000的多聚賴氨酸。然而，優(yōu)選多聚賴氨酸具有至少約10，000 的MW。優(yōu)選的帶正電荷的分支基團(tuán)或效應(yīng)基團(tuán)包括例如-gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg (-Gly3Arg7)、HIV-TAT 或其片段，以及 Antermapedia PTD 或其片段。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，載體是相對短的多聚賴氨酸或聚乙烯亞胺(PEI) 主鏈(其可以是直鏈的或分支的)并且其具有帶正電荷的分支基團(tuán)。這些載體可用于使治療組合物中主鏈和肉毒桿菌毒素不受控制的集聚最小化，該集聚導(dǎo)致運(yùn)輸效率急劇降低。 當(dāng)載體是相對短的直鏈多聚賴氨酸或PEI主鏈時，該主鏈將具有低于75，000,更優(yōu)選低于 30，000，并且最優(yōu)選低于25，000的分子量。然而，當(dāng)載體是相對短的分支的多聚賴氨酸或 PEI主鏈時，主鏈將具有低于60，000，更優(yōu)選低于55，000，并且最優(yōu)選低于50，000的分子量。但是，如果如在此描述的分配劑包含于組合物中，則所述分支的多聚賴氨酸和PEI主鏈的分子量可達(dá)到75，000，而直鏈多聚賴氨酸和PEI主鏈的分子量可達(dá)到150，000。如在此描述的，術(shù)語“肉毒桿菌毒素”意指通過細(xì)菌或通過重組技術(shù)產(chǎn)生的任何已知類型的肉毒桿菌毒素，以及可隨后發(fā)現(xiàn)的任何類型包括基因工程變體或融合蛋白。如上面提及的，目前，已經(jīng)鑒定了 7種免疫學(xué)上不同的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，即肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，它們的每種通過用類型-特異性抗體中和來區(qū)分。肉毒桿菌毒素血清型可從 Sigma-Aldrich 禾口 Metabiologics, Inc. (Madison, Wisconsin)以及從其它來源商業(yè)獲得。不同血清型的肉毒桿菌毒素在它們影響的動物種以及它們引發(fā)的麻痹的嚴(yán)重性和持續(xù)時間方面不同。至少兩種類型的肉毒桿菌毒素(A型和B型)可商業(yè)獲得用于治療某些病癥的制劑。例如，A型包含于商標(biāo)為BOTOX 的Allergan制劑和商標(biāo)為 DYSP0RT 的Ipsen制劑中，而B型包含于商標(biāo)為MY0BL0C 的Elan制劑中。本發(fā)明組合物中使用的肉毒桿菌毒素可備選地是肉毒桿菌毒素衍生物，S卩，具有肉毒桿菌毒素活性但相對于天然存在的或重組天然肉毒桿菌毒素在任意部分或任意鏈上含有一個或多個化學(xué)或官能改變的化合物。例如，肉毒桿菌毒素可以是經(jīng)修飾的神經(jīng)毒素(例如，與天然的或重組產(chǎn)生的神經(jīng)毒素或其片段或衍生物比較，具有至少一個它的氨基酸缺失、修飾或取代的神經(jīng)毒素)。例如，肉毒桿菌毒素可以是已經(jīng)以例如增強(qiáng)它的特性或減少不期望的副作用，但仍然保留期望的肉毒桿菌毒素活性的方式修飾了的肉毒桿菌毒素。肉毒桿菌毒素可以是由細(xì)菌產(chǎn)生的任何肉毒桿菌毒素復(fù)合體，如上面描述的。備選地，肉毒桿菌毒素可以是用重組或合成化學(xué)技術(shù)制備的毒素(例如，從不同肉毒桿菌毒素血清型的亞基或結(jié)構(gòu)域制備的重組肽、融合蛋白或雜合神經(jīng)毒素(例如，參見美國專利 6，444，209))。肉毒桿菌毒素還可以是已經(jīng)顯示具有必需的肉毒桿菌毒素活性的整個分子的一部分，并且在這種情形中可以本身或作為組合物或綴合分子(例如融合蛋白)的部分使用。另外，肉毒桿菌毒素可以是肉毒桿菌毒素前體的形式，其自身可以是無毒的，例如無毒鋅蛋白酶，其在溶蛋白性裂解后變成有毒。本發(fā)明還考慮肉毒桿菌毒素的組合物和混合物的一般使用，雖然由于它們不同的本質(zhì)和特性，肉毒桿菌毒素血清型的混合物通常不會在醫(yī)療保健或化妝品工業(yè)中同時施用。本發(fā)明的組合物優(yōu)選是施用至受試者或患者(即需要該特定治療的人或其它哺乳動物)的皮膚或上皮組織的產(chǎn)品形式。術(shù)語“需要”表示包括藥學(xué)或健康相關(guān)的需要， 例如治療涉及不期望的面肌痙攣的病癥，以及美容和主觀需要，例如改變或改善面部組織的外觀。通常，組合物通過將肉毒桿菌毒素與載體，并通常與一種或多種另外的可藥用載體或賦形劑混合制備。在它們的最簡單形式中，它們可包含簡單的含水可藥用載體或稀釋劑，例如緩沖鹽水。然而，組合物可包含局部用藥物組合物或化妝品組合物中典型的其它成分，包括皮膚學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體、賦形物或介質(zhì)(即與它們將施用的組織相兼容的載體、賦形物或介質(zhì))。如在此使用的，術(shù)語“皮膚學(xué)或藥學(xué)上可接受的”表示所描述的組合物或其成分適合用于與這些組織接觸或適合用于患者，通常沒有過度毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、變應(yīng)性應(yīng)答等。如果合適，本發(fā)明的組合物可包含在所考慮領(lǐng)域中，并且尤其在美容學(xué)和皮膚病學(xué)中常規(guī)使用的任何成分。組合物還可以包含一些小的陰離子，優(yōu)選多價陰離子，例如磷酸鹽、天冬氨酸鹽或檸檬酸鹽。關(guān)于它們的形式，本發(fā)明組合物可包括用于施用至皮膚和可使用該組合物的其它組織的溶液劑、乳劑(包括微乳劑)、混懸劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、粉劑或其它典型的固體或液體組合物。除肉毒桿菌毒素和載體外，這些組合物還可包含通常用于這種產(chǎn)品的其它成分，例如抗微生物劑、增濕劑和水合劑(hydration agents)、穿透劑、防腐劑、乳化劑、天然或合成油脂、溶劑、表面活性劑、去污劑、潤膚劑、抗氧化劑、芳香劑、充填劑、增稠劑、蠟、 氣味吸收劑、染料、著色劑、粉劑，并任選包括麻醉劑、止癢添加劑、植物提取物、調(diào)節(jié)劑、遮光或發(fā)光劑、閃光劑、保濕劑、云母(mica)、礦物質(zhì)、多酚類、硅酮或其衍生物、防曬霜、維生素，以及植物藥物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包含凝膠劑和/或粘度修飾劑。通常加入這些制劑來增加組合物的粘度，以便使得組合物的施用更容易且更精確。另外，這些制劑有助于防止含水的肉毒桿菌毒素/載體溶液劑干燥，干燥將會導(dǎo)致肉毒桿菌毒素的活性降低。特別優(yōu)選的制劑是不帶電的且不會干擾肉毒桿菌毒素活性或毒素-載體復(fù)合物在跨越皮膚中的效力的那些制劑。凝膠劑可以是某些基于纖維素的凝膠劑，例如羥丙基纖維素(HPC)。 在一些實(shí)施方案中，肉毒桿菌毒素/載體復(fù)合物配制成具有2-4% HPC的組合物。備選地， 含有肉毒桿菌毒素/載體復(fù)合物的溶液劑的粘度可以通過加入聚乙二醇(PEG)改變。在其它實(shí)施方案中，肉毒桿菌毒素/載體溶液劑與預(yù)混合的粘稠劑例如Cetaphi 1 增濕劑組合。本發(fā)明的組合物可任選包含分配劑。如在此使用的，“分配劑”是具有防止或最小化肉毒桿菌毒素與本發(fā)明載體的不期望或不受控制的集聚的任何物質(zhì)或添加劑。分配劑可例如在由于體積限制而必須采用濃縮的肉毒桿菌毒素溶液劑時是有用的。在這些情形中， 分配劑使肉毒桿菌毒素保持分散，從而防止該毒素聚集，否則在沒有分配劑時將會發(fā)生聚集。通常，分配劑是(1)無刺激性的、( 不會破壞肉毒桿菌毒素、C3)不會使?jié)B透性有任何增加、(4)提供可靠且穩(wěn)定的粒度、( 是不帶電的，以及(6)不會干擾毒素和經(jīng)皮膚載體的復(fù)合物。合適的分配劑的實(shí)例是乙醇(EtOH)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，EtOH少于組合物的 20%，并且最優(yōu)選少于組合物的5%。作為實(shí)例，如果體積限制要求重構(gòu)100U肉毒桿菌毒素于0. 5ml，而不是2. 5ml溶液中，通常觀察到肉毒桿菌毒素將會顯示出不期望的集聚，并因此降低了活性。然而，通過加入的KOH作為分散劑，甚至在該濃度下M小時后仍保持完全的活性。作為另一個實(shí)例，Botox 以1.0ml 0. 9% NaCl重構(gòu)具有完全活性，而以0.5ml在和5% KOH加上 0.9% NaCl中重構(gòu)產(chǎn)生具有完全活性的溶液劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，將寡聚-或聚陰離子橋加入至肉毒桿菌毒素組合物中以提高毒素與帶正電荷的主鏈載體的復(fù)合。正如本領(lǐng)域所熟知的，肉毒桿菌毒素實(shí)際上是不同蛋白質(zhì)的復(fù)合物，這些蛋白質(zhì)的一些是帶正電荷的，而一些是帶負(fù)電荷的。因?yàn)槎舅爻煞值拇_切比例取決于毒素來源而不同，所以有可能來自某些來源的肉毒桿菌毒素具有較低的與在此描述的帶正電荷的主鏈復(fù)合的傾向。然而，本發(fā)明的一方面是發(fā)現(xiàn)，通過加入寡聚-或聚陰離子橋至這類肉毒桿菌毒素，局部施用的功率和效力顯著增加。這種寡聚_/聚陰離子橋的合適的實(shí)例包括磷酸鈉(5% ) ,PBS或5%聚-L-天冬氨酸(例如MW為3000)。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以是控制釋放或持續(xù)釋放組合物的形式，其中肉毒桿菌毒素和載體包封于或以別的方式包含于一種物質(zhì)中，這樣它們以控制的方式在一段時間內(nèi)釋放至皮膚上。肉毒桿菌毒素和載體可以包含于基質(zhì)、脂質(zhì)體、小囊泡、微膠囊、微球等中，或包含于固體顆粒材料中，選擇和/或構(gòu)建所有上述物質(zhì)用以使得肉毒桿菌毒素隨時間過去釋放。肉毒桿菌毒素和載體可以在一起封裝(例如，在相同膠囊中)或分開封裝(在單獨(dú)的膠囊中)于膠囊中。使用在此描述的組合物，肉毒桿菌毒素可以以有效量遞送至皮膚下面的肌肉，或遞送至皮膚內(nèi)部的腺結(jié)構(gòu)來產(chǎn)生麻痹、產(chǎn)生松弛、減少收縮、防止或減輕痙攣、減少腺的排出量或產(chǎn)生其它期望效果。相對于可注射或可植入材料，以這種方式局部遞送肉毒桿菌毒素能使劑量減少、減小毒性并使得能進(jìn)行更精確的劑量優(yōu)化來獲得理想的效果。施用本發(fā)明的組合物以便施用有效量的肉毒桿菌毒素。如在此使用的，術(shù)語“有效量”表示如上定義的肉毒桿菌毒素的量，該量足以產(chǎn)生期望的肌肉麻痹或其它生物學(xué)或美學(xué)效果，但是隱含它是安全劑量，即足夠低而能避免嚴(yán)重副作用的量。期望的效果包括松弛某些肌肉，為了例如減少特別是臉上的細(xì)紋和/或皺紋的出現(xiàn)，或以其它方式例如使眼睛變寬、提升嘴角、或使從上唇散開的皺紋平滑，或一般性解除肌緊張來調(diào)整外觀。最后提及的效果(一般性解除肌緊張)可在面部或其它部位實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明組合物可包含合適的有效量的肉毒桿菌毒素用于作為單劑量處理施用，或者可以是更加濃縮的，用于在施用處稀釋或用于多次施用。通過使用根據(jù)本發(fā)明的帶正電荷的載體，肉毒桿菌毒素可以經(jīng)皮膚施用給受試者用于治療病癥例如不期望的面肌或其它肌肉痙攣、多汗癥、痤瘡或其中肌肉疼痛或痙攣的緩解是所期望的身體其它部位的病癥。肉毒桿菌毒素經(jīng)局部施用來經(jīng)皮膚遞送至肌肉或其它皮膚-相關(guān)結(jié)構(gòu)。施用可在例如腿、肩、背(包括下背)、腋窩、掌、足、頸、腹股溝、 手背或腳背、肘、上臂、膝、大腿、臀、軀干、骨盆或期望施用肉毒桿菌毒素的身體的任何其它部位進(jìn)行。還可以施用根據(jù)本發(fā)明的肉毒桿菌毒素制劑用于治療其它病癥，包括治療神經(jīng)疼痛、預(yù)防或減少偏頭痛或其它頭痛、預(yù)防或減少痤瘡、預(yù)防或減少張力障礙或張力障礙性收縮(主觀的或臨床的)、預(yù)防或減少與主觀性或臨床多汗癥相關(guān)的癥狀、減少分泌過多或出汗、降低或增強(qiáng)免疫應(yīng)答、或治療已經(jīng)建議或?qū)嵤┩ㄟ^注射施用肉毒桿菌毒素的其它病癥。還可施用在此描述的肉毒桿菌毒素或其它治療性蛋白質(zhì)用于免疫-相關(guān)目的。令人驚訝的是，可以施用在此描述的肉毒桿菌毒素用于減少免疫應(yīng)答。更具體地說，本發(fā)明使得肉毒桿菌毒素能通過改變的施用途徑遞送，從而改變制劑的復(fù)合抗原的呈遞。以這種方式，本發(fā)明可用于減少對肉毒桿菌毒素抗原的免疫應(yīng)答，并便于重復(fù)施用而沒有免疫-相關(guān)的活性減少。備選地，可制備并局部施用復(fù)合物來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，例如提供關(guān)于多種蛋白質(zhì)的免疫，例如，用于兒童免疫而無需注射。對于與免疫-相關(guān)活性相關(guān)的使用，“有效量” 指足以使受試者在施用或一系列施用肉毒桿菌毒素后產(chǎn)生對它的免疫應(yīng)答的肉毒桿菌毒素的量。最優(yōu)選地，組合物由或在醫(yī)師或其它保健專家的指導(dǎo)下施用。它們可以以單次處理或在一段時間內(nèi)以一系列周期性處理施用。為了經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素用于上述目的，將如上描述的組合物局部施用至期望產(chǎn)生效果的一個位置或多個位置的皮膚上。在將含水的肉毒桿菌毒素/載體溶液劑直接施用至皮膚的實(shí)施方案中，優(yōu)選覆蓋接受治療的區(qū)域(例如用Cetaphi 1 增濕劑)或用屏蔽物(例如Telfa)遮蔽受治療的區(qū)域，以便防止溶液干燥，溶液干燥將會導(dǎo)致毒素活性減少。由于它們的性質(zhì)，最優(yōu)選地，施用的肉毒桿菌毒素的量應(yīng)該小心應(yīng)用，以將產(chǎn)生期望效果而不會產(chǎn)生任何不利或不期望結(jié)果的施用比率和施用頻率施用。因此，例如，本發(fā)明的局部用組合物應(yīng)該以每cm2皮膚面積約1U-20，000U, 優(yōu)選約1U-10，000U肉毒桿菌毒素的比率施用。這些范圍內(nèi)的較高劑量可優(yōu)選與控制釋放材料一起使用，例如，或者使在去除前在皮膚上停留時間更短。在施用肉毒桿菌毒素/載體組合物之前適當(dāng)處理皮膚表面對于保持該溶液劑的效力是重要的。例如，在皮膚表面引入表面活性劑以在施用前除去皮膚上的表面油脂令人驚訝地是起反作用的，因?yàn)楸砻婊钚詣┧坪跗茐牧巳舛緱U菌毒素活性。即使隨后在施用肉毒桿菌毒素/載體溶液劑前用水多次洗滌皮膚，這也會發(fā)生。甚至極其溫和的表面活性劑， 例如在嬰兒擦劑中的那些，看起來也引起了這種現(xiàn)象。因此，在施用本發(fā)明組合物的優(yōu)選方法中，皮膚僅用清水預(yù)先清洗。僅用水清洗看來還適度地提高了肉毒桿菌毒素的經(jīng)皮膚運(yùn)輸。另外，可在施用肉毒桿菌毒素/載體復(fù)合物之前剝離皮膚以減少角質(zhì)層。原則上， 剝離皮膚的過程應(yīng)該導(dǎo)致經(jīng)皮膚運(yùn)輸肉毒桿菌毒素的效力增強(qiáng)。然而，用于剝離皮膚的方法是重要的。例如，丙酮-介導(dǎo)的人或動物中角質(zhì)層的減少看起來減少了隨后施用的肉毒桿菌毒素的活性。比較而言，膠帶剝脫(即將膠帶粘在皮膚表面并隨后移除膠帶)看起來使得肉毒桿菌毒素在小鼠模型和人中都能更深滲透并使劑量減少。據(jù)推測皮膚表面的磨損 (例如通過使用磨擦墊(abrasive pads))將會引起與膠帶剝脫類似的效果。本發(fā)明還包括用于經(jīng)皮膚遞送含有肉毒桿菌毒素和載體的組合物的裝置，所述載體具有如在此定義的連接有分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈。這種裝置在結(jié)構(gòu)上可與皮膚貼劑一樣簡單，或者可以是更復(fù)雜的裝置，包括用于投放和監(jiān)控組合物投放的手段，以及任選用于監(jiān)控受試者狀態(tài)(例如，監(jiān)控受試者對投放的物質(zhì)的反應(yīng))的手段。應(yīng)該注意的是，用于構(gòu)建該裝置的材料的選擇是重要的。用于構(gòu)建遞送裝置的優(yōu)選材料是不會通過降解或裝置表面對肉毒桿菌毒素不期望的吸收而導(dǎo)致肉毒桿菌毒素/ 載體溶液劑活性喪失的那些材料。這種不期望的行為已經(jīng)在例如當(dāng)含水溶液劑中的肉毒桿菌毒素/載體接觸聚丙烯表面時觀察到，但是在肉毒桿菌毒素/載體接觸聚氯乙烯(PVC) 表面時未觀察到?！愣?，組合物可以預(yù)先配制和/或預(yù)先安裝于裝置中或者可以稍后制備，例如使用試劑盒，該試劑盒保存有分開的兩種成分(肉毒桿菌毒素和載體)但提供了用于在施用時或施用前將它們混合的手段。載體分子的量或它與肉毒桿菌毒素的比率將取決于選擇哪種載體用于所考慮的組合物。在給出的情況中，合適的載體分子的量或比率可容易地確定，例如通過進(jìn)行一個或多個實(shí)驗(yàn)，例如在下面描述的那些試驗(yàn)確定。—般而言，本發(fā)明還包括用于施用肉毒桿菌毒素至需要它的受試者或患者的方法。該方法包括局部施用與載體一起的有效量的肉毒桿菌毒素，所述載體具有連接有帶正電荷的分支基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，如在此描述的。“和...一起”表示兩種成分(肉毒桿菌毒素和載體)在組合程序中施用，其可包括將它們組合為一種隨后施用給受試者的組合物，或者將它們分開施用，但是以它們共同起作用以提供所需要的有效量的治療性蛋白質(zhì)的遞送的方式施用。例如，可首先施用含有載體的組合物至受試者的皮膚，之后應(yīng)用含有肉毒桿菌毒素的皮膚貼劑或其它設(shè)備。肉毒桿菌毒素可以以干燥形式整合進(jìn)皮膚貼劑或其它投藥裝置中，同時帶正電荷的載體可以在施用貼劑之前施用至皮膚表面以便兩者共同起作用，產(chǎn)生期望的經(jīng)皮膚遞送。因此，這兩種物質(zhì)(載體和肉毒桿菌毒素)聯(lián)合作用或者可能相互作用而在原位形成組合物或復(fù)合物。因此，本發(fā)明也包括一種試劑盒，該試劑盒包括用于經(jīng)由皮膚分配肉毒桿菌毒素的裝置以及含有載體或主鏈的液體、凝膠劑、乳劑等，并且該試劑盒適合應(yīng)用于受試者的皮膚或上皮組織。用于在保健專家指導(dǎo)下或者通過患者或受試者施用本發(fā)明組合物的試劑盒還可以包括適合該目的的定制的涂藥器(applicator)。本發(fā)明的組合物、試劑盒和方法使得能遞送具有更高比活性的純的肉毒桿菌毒素并潛在地改善了藥物動力學(xué)。另外，載體可用作減少對外來輔助蛋白(例如，400-600mg的人血清白蛋白或250-500mg的重組血清白蛋白)和/或多糖穩(wěn)定劑的需要的穩(wěn)定劑，并可有利地減少了對內(nèi)毒桿菌毒素的免疫應(yīng)答。另外，組合物適合在PH約4. 5至約6. 3的生理環(huán)境中使用，并因此可具有該P(yáng)H值。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以在室溫下或在冷藏條件下存儲。下面是本發(fā)明的代表性實(shí)施例。它們展示了功能性肉毒桿菌神經(jīng)毒素復(fù)合物跨越皮膚的遞送，而不需要共價修飾要遞送的神經(jīng)毒素。
實(shí)施例實(shí)施例1用Revance肽基載體體內(nèi)運(yùn)輸肉毒桿菌毒素。該試驗(yàn)展示了 相對于對照，在單次施用后，使用肽基載體轉(zhuǎn)運(yùn)含有完整的標(biāo)記蛋白質(zhì)肉毒桿菌毒素的大復(fù)合物穿過完整的皮膚。主鏈選擇帶正電荷的主鏈通過綴合-Gly3Ai^7至多聚賴氨酸(MW 112，000)以18%的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有18個與-Gly3Ai^7綴合)裝配，該綴合是通過末端甘氨酸與賴氨酸側(cè)鏈的游離胺結(jié)合。所述經(jīng)修飾的主鏈稱為“KNR”。對照聚陽離子是相同大小且來自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K”，Sigma Chemical Co.，St. Louis，MO)。治療劑:選擇Botox 商標(biāo)的A型肉毒桿菌毒素(Allergan)用于該試驗(yàn)。它具有約 150,000的分子量。樣品的制備根據(jù)生產(chǎn)商的說明書重構(gòu)肉毒桿菌毒素。將一等分試樣的蛋白質(zhì)用經(jīng)計(jì)算的 12-倍摩爾過量的硫-NHS-LC生物素(Pierce Chemical)進(jìn)行生物素化。標(biāo)記產(chǎn)物稱為 “Btox-b”。在所有情形中，過量的聚陽離子用來裝配最終的復(fù)合物，所述最終復(fù)合物如在遞送高負(fù)電性的大的核苷酸復(fù)合物時具有過量的正電荷。凈中性或凈正電荷防止蛋白質(zhì)復(fù)合物受到高度負(fù)電性細(xì)胞表面蛋白聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)的排斥。對于所有組將Btox-b劑量標(biāo)準(zhǔn)化，同樣對要局部施用的組合物的總體積和終PH值標(biāo)準(zhǔn)化。如下制備樣品“ JMW-7”組將每等分試樣2. 0單位的Btox_b (即總量為20U)和肽基載體KNR以計(jì)算的MW比例4 1混合至均勻，并用磷酸鹽緩沖鹽水將其稀釋成200微升。將得到的組合物與1.8ml Cetaphi 1 乳劑混合至均勻并等分成200微升的等份?！?JMW-8”組將每等分試樣2. 0單位的Btox_b (即總量為20U)和K以計(jì)算的漏比例4 1混合至均勻，并用磷酸鹽緩沖鹽水將其稀釋至200微升。將得到的組合物與1.8ml Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。用于在用肽基載體和標(biāo)記Btox單次處理后測定經(jīng)皮膚遞送效率的動物實(shí)騎:在實(shí)施處理過程中，將動物通過吸入異氟烷麻醉。在麻醉后，讓C57 black 6小鼠 (每組η = 4)接受局部施用定量的200微升劑量的合適治療物，所述治療物施用至頭顱部分的背后面皮膚(選擇此處是因?yàn)樾∈蟛荒苡米旎蛩闹|及該區(qū)域)。動物不進(jìn)行脫毛。 在初次處理30分鐘后，將小鼠通過吸入(X)2安樂死，并由進(jìn)行該盲法試驗(yàn)的觀察者獲取完整厚度的受處理的皮膚部分。將受處理部分分成三等份；將頭顱部分固定在10%中性緩沖的福爾馬林中12-16小時，隨后存儲于70%乙醇中直到進(jìn)行石蠟包埋。將中間部分快速冷凍，將其直接用于由進(jìn)行該盲法試驗(yàn)的觀測者按下面概述的進(jìn)行生物素顯影。將受處理的近尾部分速凍用于溶解研究。生物素顯影如下進(jìn)行。簡而言之，將每個切片浸入NeutrAvidin 緩沖液中1小時。為了顯影堿性磷酸酶活性，將橫切片在鹽水中洗滌4次，隨后將其浸入NBT/ BCIP(Pierce Scientific)中1小時。隨后將切片在鹽水中沖洗并在具有平面-高度消色透鏡的Nikon E600顯微鏡下對整體拍照。數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析總的陽性染色由進(jìn)行該盲法試驗(yàn)的觀測者采用Image Pro Plus軟件(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)進(jìn)行分批圖像分析測定，并將其對總的橫斷面積標(biāo)準(zhǔn)化以測定每個切片的百分比陽性染色。隨后確定每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，用Matview軟件(Abacus，Berkeley，CA)在單向ANOVA重復(fù)測量中分析95%置信度時的顯著性。結(jié)果在單次局部施用含有KNR的Btox-b ( “EB-Btox")或含有K的Btox_b ( "nl")后， 生物素化肉毒桿菌毒素陽性的平均橫斷面積報(bào)告為總面積的百分比。結(jié)果在下面的表1中給出并在圖1中說明。在圖1中，在用含有Btox-b和肽基載體KNR的‘‘EB-Btox”以及含有 Btox-b和聚陽離子K的“nl” (作為對照)每天處理一次處理三天后，確定對標(biāo)記呈陽性的區(qū)域?qū)偯娣e的百分比。描述了每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。表1 在單次局部施用含有KNRCJMW-7)或K(JMW_8)的Btox_b 30分鐘后，作為總橫切面的百分比的標(biāo)記肉毒桿菌毒素區(qū)域的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
組平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差JMW-7335.333334JMW-88. 6666670.333334P = 0.0001 (99% 時的顯著性)實(shí)施例2具有肽基載體的局部用肉毒桿菌毒素制劑的治療效果。實(shí)施例1表明肽基經(jīng)皮膚載體在局部施用于鼠模型的完整皮膚后使得能有效轉(zhuǎn)移肉毒桿菌毒素。然而，該試驗(yàn)未指出復(fù)合蛋白質(zhì)肉毒桿菌毒素在轉(zhuǎn)運(yùn)穿過皮膚后是否以功能形式釋放。因此建立下面的實(shí)驗(yàn)用以評估肉毒桿菌毒素是否可用這種肽基載體(同樣，沒有共價修飾該蛋白質(zhì))作為局部用藥劑治療性遞送穿過完整的皮膚。帶正電荷的主鏈同樣通過以18%的飽和度(即每100個賴氨酸殘基中有18個與-Gly3Ai^7結(jié)合)將-Gly3Ai^7綴合至多聚賴氨酸(MW 112,000)來裝配，所述的綴合是通過末端甘氨酸的羧基與賴氨酸側(cè)鏈的游離胺結(jié)合。所述經(jīng)修飾的主鏈稱為“KNR”。對照聚陽離子是相同大小且來自相同批次的未經(jīng)修飾的多聚賴氨酸(稱為“K”，Sigma Chemical Co.，St. Louis,M0)。使用與實(shí)施例1中相同的肉毒桿菌毒素治療劑，并以相同的方式制備。 樣品如下制備“JMW-9”組將每等分試樣2. 0單位的肉毒桿菌毒素(即總量為60U)和肽基載體 KNR以計(jì)算的MW比例4 1混合至均勻，并用磷酸鹽緩沖鹽水將其稀釋至600微升。將得到的組合物與5. 4ml Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。“JMW-10”組將每等分試樣2.0單位的肉毒桿菌毒素(即總量為60U)和K以麗比例4 1混合至均勻，并用磷酸鹽緩沖鹽水將其稀釋至600微升。將得到的組合物與5.細(xì)1 Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份?！癑MW-11”組將無聚陽離子的、每等分試樣2. 0單位的肉毒桿菌毒素(即總量為 60U)用磷酸鹽緩沖鹽水稀釋至600微升。將得到的組合物與5.細(xì)1 Cetaphil混合至均勻并等分成200微升的等份。在用At某iH本禾Π肉毒桿菌毒素單次處理后確定治療效果的云腫勿^齡:在實(shí)施處理過程中，將動物通過吸入異氟烷麻醉。麻醉后，給C57black 6小鼠(每組η = 4)局部施用定量的400微升劑量的適當(dāng)處理物，所述處理物均勻地從腳趾施用至大腿中部。二肢都接受處理，并且處理隨機(jī)地發(fā)生在任一側(cè)。動物不用脫毛。初次處理后30分鐘，根據(jù)公開的關(guān)于在施用肉毒桿菌毒素后足的靈活性的足趾外展(digital abduction) 能力打分來評估小鼠的足趾外展能力[Aoki, KR. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon. 2001 Dec ；39 (12) 1815-20]。也可以主觀地評價小鼠的靈活性。數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析足趾外展打分由進(jìn)行該盲法試驗(yàn)的兩名觀測者獨(dú)立地列表顯示。隨后確定每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，用Matview軟件(Abacus，Berkeley, CA)在單向ANOVA重復(fù)測量中分析95%置信度時的顯著性。結(jié)果單次局部施用含有KNR( “JMW-9”)、K( “JMW-10”)或無聚陽離子的稀釋劑 (“JMW-11”)的肉毒桿菌毒素后的平均足趾外展打分在表2中顯示，并且在下面圖2的代表性顯微照片中舉例說明。相對于兩個對照，肽基載體KNR提供了統(tǒng)計(jì)上顯著的對肉毒桿菌毒素的功能性跨越皮膚遞送，這些試驗(yàn)是彼此可比較的。另外獨(dú)立重復(fù)本試驗(yàn)(全部的三個獨(dú)立試驗(yàn)都有一致的結(jié)論統(tǒng)計(jì)上顯著的麻痹作用來自含有KNR的局部用肉毒桿菌毒素而不是對照)證實(shí)了當(dāng)前的發(fā)現(xiàn)，并顯示在含有或不含K的局部用肉毒桿菌毒素(即兩種對照)之間無顯著差別。有趣地是，小鼠一致地移向麻痹的肢體(這在100%受處理的動物發(fā)生而0%的來自任一對照組的對照中發(fā)生)。如在圖2中顯示的，用肉毒桿菌毒素加上對照聚陽離子多聚賴氨酸或用無聚陽離子的肉毒桿菌毒素(“僅毒素”)處理的肢可移動足趾(作為提起時的防御機(jī)制)，但是用肉毒桿菌毒素加上肽基載體KNR( "Revance' s肉毒桿菌制劑”)處理的肢不能移動。表2:在單次局部施用具有肽基載體KNR的肉毒桿菌毒素(“JMW-9”)、具有對照
17聚陽離子K的肉毒桿菌毒素(“JMW-10”)或單獨(dú)的肉毒桿菌毒素后30分鐘的足趾外展打分。
權(quán)利要求
1.制劑在制備產(chǎn)生生物效應(yīng)的藥物的用途，所述的生物效應(yīng)例如是肌肉麻痹、減少分泌過多、治療疼痛、皺紋或多汗癥、減少肌肉痙攣、預(yù)防或減少粉刺，或者減少或增強(qiáng)免疫應(yīng)答，其中所述的制劑包含肉毒桿菌毒素，包括連接至其上的效應(yīng)基團(tuán)的帶正電荷的主鏈，以及寡聚-橋，其中所述肉毒桿菌毒素與所述帶正電荷的主鏈非共價復(fù)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑的用途，其中所述的寡聚-橋包括聚天冬氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制劑的用途，其中所述的聚天冬氨酸的分子量為3000D。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑的用途，其中所述效應(yīng)基團(tuán)是具有選自如下的序列的氨基酸 Jgly^-RGRDDRRQRRR-fely),、(gly^-YGRKKRRQRRR-fely),和(gly) p-RKKRRQRRR- (gly),，其中所述的下標(biāo)ρ和q獨(dú)立地選自0_20的整數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑的用途，其中至少一個所述效應(yīng)基團(tuán)具有序列(gly) p-RGRDDRRQRRR- (gly),，其中所述的下標(biāo)ρ和q獨(dú)立地選自0_20的整數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑的用途，其中至少一個所述效應(yīng)基團(tuán)具有序列(gly) p-YGRKKRRQRRR- (gly),，其中所述的下標(biāo)ρ和q獨(dú)立地選自0_20的整數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑的用途，其中至少一個所述效應(yīng)基團(tuán)具有序列(gly) p-RKKRRQRRR- (gly),，其中所述的下標(biāo)ρ和q獨(dú)立地選自0_20的整數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑的用途，其進(jìn)一步包括泊洛沙姆。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑的用途，其中所述的制劑用于減少分泌過多。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑的用途，其中所述的制劑用于用于治療多汗癥。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑的用途，其中所述的制劑用于治療疼痛。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制劑的用途，其中所述疼痛是神經(jīng)性疼痛。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑的用途，其中所述疼痛是偏頭痛。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑的用途，其中所述的制劑用于預(yù)防或減少粉刺。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑的用途，其中所述的制劑用于減少或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
全文摘要
公開了用于經(jīng)皮膚遞送肉毒桿菌毒素的改良制劑。該制劑包含，例如，與帶正電荷的主鏈非-共價連接的肉毒桿菌毒素，所述的主鏈具有分支或效應(yīng)基團(tuán)。制劑還包含分配劑、寡聚-橋或多聚陰離子橋，并可任選包含粘度改良劑。該制劑設(shè)計(jì)用于局部施用于患者的皮膚上并可用于處理皺紋、多汗癥和其它與健康相關(guān)的問題。用于施用的試劑盒也得以描述。
文檔編號A61K47/48GK102499981SQ20111032457
公開日2012年6月20日 申請日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月3日
發(fā)明者J·M·沃, M·D·戴克 申請人:雷文斯治療公司